七氟醚暴露對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞及功能的影響

韓姣姣,張家慧,李愛香,蘇慶婭,王威

河南大學(xué)淮河醫(yī)院 麻醉科,河南 開封475000

七氟醚是一種常用吸入麻醉藥,廣泛用于手術(shù)室麻醉、牙科診所麻醉和無(wú)痛人流、核磁共振檢查鎮(zhèn)靜等[1-2]。在臨床麻醉實(shí)施過(guò)程中,不可避免地導(dǎo)致七氟醚泄露于周圍環(huán)境。國(guó)外有學(xué)者關(guān)于麻醉廢氣對(duì)手術(shù)室工作人員身體各系統(tǒng)影響進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:長(zhǎng)期暴露于麻醉廢氣環(huán)境的女性患肝腎疾病、腫瘤、自發(fā)性流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)明顯增加,男性患肝臟疾病及其后代先天性畸形的風(fēng)險(xiǎn)增加[3]。然而,長(zhǎng)期低濃度七氟醚暴露是否會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)造成影響尚無(wú)明確定論。本研究構(gòu)造長(zhǎng)期低濃度七氟醚暴露小鼠模型,檢測(cè)其T淋巴細(xì)胞亞群變化及小鼠淋巴細(xì)胞IL-17A、IFN-γ的表達(dá),探討長(zhǎng)期低濃度暴露七氟醚對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群及功能的影響。在本研究七氟醚暴露濃度的選擇上,我們進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn),觀察檢測(cè)到人類在環(huán)境中所嗅到的七氟醚濃度約為0.2%(v/v)。由于無(wú)法完全模擬手術(shù)室中七氟醚暴露環(huán)境(例如進(jìn)行相關(guān)麻醉誘導(dǎo)操作時(shí),七氟醚泄露濃度高于此濃度),本實(shí)驗(yàn)選擇了0.2%(v/v)左右的濃度,即0.1%(v/v)和0.3%(v/v)的七氟醚暴露濃度。

1 材料與方法

1.1 模型制作

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

無(wú)特定病原菌級(jí)(SPF)KM 小鼠30只(購(gòu)自北京維通利和動(dòng)物有限公司),雌雄各15只,8周齡,體質(zhì)量(20±2)g。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)清潔,溫度23～25℃,濕度45%～55%,明暗周期12 h/12 h,自由進(jìn)食水。將KM 小鼠隨機(jī)分為空氣暴露組(C組)、0.1%(v/v)七氟醚暴露組(S1組)、0.3%(v/v)七氟醚暴露組(S2)組,每組10只,雌雄各5只。本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),七氟醚購(gòu)自河北一品制藥有限公司(產(chǎn)品批號(hào):C038200801)。

1.1.2 模型制作

實(shí)驗(yàn)中麻醉暴露處理裝置為72 cm×53 cm×44 cm 的特制密閉透明容器。S1組、S2組每天暴露于相應(yīng)濃度的七氟醚1 h,1周暴露5 d,連續(xù)暴露18周;C組暴露于空氣。

1.1.3 標(biāo)本采集

實(shí)驗(yàn)干預(yù)結(jié)束后,活體于小鼠左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈取動(dòng)脈血1 mL。

1.1.4 試劑與儀器

小鼠熒光單抗CD3+、CD4+、CD8+、IL-17A、IFN-γ,購(gòu)自美國(guó)BD 公司。實(shí)驗(yàn)常用的蒸餾水以及紅細(xì)胞裂解液等,由河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。BD 流式細(xì)胞儀,購(gòu)自美國(guó)BD 公司。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1 外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)

1)單細(xì)胞懸液制備。取150μL全血于流式管中,400g離心5 min,棄血漿,加入10倍體積紅細(xì)胞裂解液,避光裂紅2 min;300g離心10 min,棄紅色上清,留沉淀;加入PBS重懸,洗滌沉淀1～2次后加入抗體進(jìn)行染色。

2)外周血淋巴細(xì)胞膜表面標(biāo)志檢測(cè)。將CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE 表面抗體按照一定的稀釋比例加入至細(xì)胞懸液中,4 ℃避光孵育1 h;染色后的細(xì)胞上機(jī)進(jìn)行分析,檢測(cè)[CD3+]、[CD4+]、[CD8+]及[CD4+]/[CD8+]。

1.2.2 IFN-γ、IL-17A 檢測(cè)

1)單細(xì)胞懸液制備。取300μL全血于流式管中,400g離心5 min,棄血漿,加入10倍體積紅細(xì)胞裂解液,避光裂紅2 min;300g離心10 min,棄紅色上清,留沉淀;加入PBS重懸,洗滌沉淀1～2次;加入CD4-FITC和抑制劑,于4℃孵育1 h,500g離心5 min,棄去上清液,加入PBS洗滌1～2次;于每管加入100μL 固定透化液,4 ℃孵育20 min,用1×buffer洗滌2次后加入相應(yīng)抗體進(jìn)行染色。

2)外周血淋巴細(xì)胞膜表面標(biāo)志檢測(cè)。將IFNγ、IL-17A 表面抗體按照一定的稀釋比例加入至細(xì)胞懸液中,4 ℃避光孵育1 h;染色后的細(xì)胞上機(jī)進(jìn)行分析,檢測(cè)[IFN-γ]、[IL-17A]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 外周血淋巴細(xì)胞亞群的比較

與C 組相比,S1 組和S2 組的[CD3+]、[CD4+]、[CD8+]及[CD4+]/[CD8+]的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見表1。

表1 三組小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群比較

2.2 淋巴細(xì)胞亞群功能的影響

與C組和S1 組比較,S2 組的[IFN-γ]顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);三組的[IL-17A]相比較,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 三組小鼠細(xì)胞因子含量比較

3 討論

機(jī)體免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞及免疫分子共同組成,具有免疫監(jiān)視、防御、調(diào)控的作用,是機(jī)體執(zhí)行免疫應(yīng)答及免疫功能的重要系統(tǒng)。淋巴細(xì)胞在機(jī)體免疫系統(tǒng)當(dāng)中起著十分重要的作用,淋巴細(xì)胞主要根據(jù)其功能特征和表面標(biāo)志可分為CD4+T和CD8+T 兩個(gè)亞群。CD4+T 細(xì)胞主要分化產(chǎn)生三種效應(yīng)細(xì)胞——Th1、Th2、Th17,它們分別通過(guò)分泌不同的細(xì)胞因子產(chǎn)生不同的免疫效應(yīng)。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子,介導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)和細(xì)胞免疫過(guò)程;Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6等細(xì)胞因子,介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)過(guò)程;Th17細(xì)胞主要分泌IL-17A 細(xì)胞因子。研究[4]發(fā)現(xiàn),Th17及其分泌的IL-17與自身免疫性疾病中炎癥病理機(jī)制密切相關(guān)。

國(guó)外研究[5]表明,將體外T 淋巴細(xì)胞暴露于1.5 mmol/L的七氟醚環(huán)境24 h 可直接誘導(dǎo)其凋亡。2005年,Loop等[6]亦發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性麻醉劑七氟醚、異氟醚均誘導(dǎo)人類T 淋巴細(xì)胞凋亡,其凋亡機(jī)制與七氟醚破壞線粒體膜電位造成細(xì)胞色素C 向胞質(zhì)釋放增加,激活caspase3,從而誘導(dǎo)凋亡,且其凋亡與暴露濃度和暴露時(shí)間呈正相關(guān)。本研究建造長(zhǎng)期低濃度暴露七氟醚小鼠模型,研究低濃度七氟醚暴露對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)影響,結(jié)果顯示:長(zhǎng)期低濃度七氟醚暴露不會(huì)導(dǎo)致小鼠T 淋巴細(xì)胞亞群及其分泌細(xì)胞因子功能下降。這一結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致,其原因可能有二:①文獻(xiàn)中研究方法均為體外實(shí)驗(yàn),而本研究為活體小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞無(wú)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,而小鼠體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制可能會(huì)調(diào)節(jié)七氟醚暴露引起的免疫損害,外周免疫器官產(chǎn)生淋巴細(xì)胞,淋巴細(xì)胞不停再生,使七氟醚暴露對(duì)機(jī)體的損害降低。②七氟醚誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞凋亡呈時(shí)間、劑量依賴性。該實(shí)驗(yàn)的七氟醚暴露濃度比體外實(shí)驗(yàn)引起免疫損害時(shí)的濃度低,不足以對(duì)體內(nèi)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)中,S2組小鼠的[IFN-γ]顯著升高,其主要由Th1細(xì)胞、NK 細(xì)胞產(chǎn)生,是一種低分子量的糖蛋白,可以促進(jìn)抗原呈遞,提高NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞溶酶體的活性,是細(xì)胞因子的重要組成之一,參與人體炎性和免疫反應(yīng)[7]。這一結(jié)果可能與Th1細(xì)胞應(yīng)激性分泌IFN-γ增多有關(guān)。因?qū)嶒?yàn)經(jīng)費(fèi)問(wèn)題,本研究未檢測(cè)其他細(xì)胞因子的分泌。

七氟醚大部分以氣體從肺內(nèi)原形排出,麻醉可控性高,廣泛應(yīng)用于臨床麻醉。但是在使用吸入麻醉氣體過(guò)程中不可避免地會(huì)從患者口腔、麻醉呼吸回路和麻醉機(jī)泄漏到手術(shù)室空氣中,對(duì)患兒進(jìn)行吸入誘導(dǎo)時(shí),患兒不可避免地?zé)┰?掙脫面罩使七氟醚大量泄漏;PACU 病人煩躁嗆管時(shí)從肺中呼出大量七氟醚氣體,這些七氟醚氣體相當(dāng)一部分被位于患者頭側(cè)的麻醉醫(yī)生吸入,使長(zhǎng)期在手術(shù)室工作的人員尤其是麻醉醫(yī)生長(zhǎng)期暴露于微量麻醉廢氣的工作環(huán)境中。1977年美國(guó)職業(yè)安全局(OSHA)提出了關(guān)于麻醉廢氣的相關(guān)規(guī)定,對(duì)手術(shù)室中暴露麻醉藥的濃度做出了限制性規(guī)定:任何工作人員暴露于鹵化物麻醉藥物的廢氣濃度不得超過(guò)2 cm3/m3,持續(xù)時(shí)間不超過(guò)1 h。然而,我國(guó)目前相關(guān)文獻(xiàn)所調(diào)查醫(yī)院手術(shù)室麻醉廢氣濃度均高于OSHA 標(biāo)準(zhǔn)。沈有君、高瑞君、于淼等[8-10]分別對(duì)深圳市、重慶市共499個(gè)手術(shù)間的七氟醚濃度進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)超出一半數(shù)量的手術(shù)室七氟醚的濃度超過(guò)限制標(biāo)準(zhǔn)2 cm3/m3。

國(guó)內(nèi)外研究已證實(shí)七氟醚暴露對(duì)生殖系統(tǒng)、肝腎功能均有不同程度損害,而對(duì)免疫系統(tǒng)的影響尚無(wú)明確定論。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)造長(zhǎng)期低濃度七氟醚暴露小鼠模型,結(jié)果證實(shí)對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)并無(wú)影響。但本實(shí)驗(yàn)具有局限性,其暴露時(shí)長(zhǎng)及濃度無(wú)法完全模擬手術(shù)室工作人員所處環(huán)境,七氟醚暴露對(duì)人體免疫系統(tǒng)的影響仍需要臨床實(shí)驗(yàn)研究。在日常工作中,手術(shù)室工作人員仍應(yīng)注意防護(hù),減少七氟醚的泄露,避免職業(yè)暴露,加強(qiáng)自身保護(hù)。