PI3K/AKT介導(dǎo)線粒體途徑血小板凋亡在免疫性骨髓衰竭血小板減少中的機(jī)制

夏樂(lè)敏,余海,金喆,丁潔,余和平

上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院/復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院 血液科,上海200040

血小板(PLT)的主要生理功能之一是止血,其數(shù)量及功能的異常是血小板相關(guān)疾病發(fā)生的根本原因。近些年的研究發(fā)現(xiàn),雖然血小板沒(méi)有細(xì)胞核,但也會(huì)出現(xiàn)凋亡,一般由內(nèi)始式與外始式兩條途徑來(lái)介導(dǎo)[1]。其中,內(nèi)始式途徑(即線粒體途徑)是調(diào)控血小板凋亡的最重要途徑[2-3]。通過(guò)抑制線粒體途徑介導(dǎo)血小板過(guò)度凋亡來(lái)增加血小板的生存時(shí)間是環(huán)孢素A(cyclosporine A,CSA)治療血小板減少的機(jī)制之一[4]。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路的激活與血小板相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在著十分密切的相關(guān)性。它位于線粒體介導(dǎo)的血小板凋亡途徑的交匯點(diǎn)連接處,能夠利用磷酸化或者與相關(guān)凋亡蛋白互相作用直接或間接地調(diào)控血小板的凋亡[5]。PI3K/AKT通路在免疫性骨髓衰竭血小板減少中是否起作用尚不明確。本研究從PI3K/AKT介導(dǎo)線粒體途徑血小板凋亡入手,研究其在免疫性骨髓衰竭血小板減少中的作用機(jī)制,希冀為研發(fā)新的藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)C57BL/6小鼠30只(購(gòu)自斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(上海),動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002),8～12周齡,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2)g。在飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠時(shí),均采用標(biāo)準(zhǔn)化的動(dòng)物飲食、飲水。將小鼠放置在濕度為55%左右、室溫為(22±2)℃、12 h明暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中嚴(yán)格執(zhí)行《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

CSA 膠囊25 mg×50 粒/盒(由諾華制藥有限公司生產(chǎn),藥品批號(hào):S0408),用無(wú)菌生理鹽水將藥物配置成4 mg/m L的溶液。

1.3 抗體和試劑

抗Bax、Bad、抗半胱天冬酶(caspase)-9 抗體、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GAPDH 抗體及二抗,購(gòu)自Santa Cruz生物科技公司(美國(guó)加利福尼亞);PI3K/AKT 阻斷劑LY294002(EKEAR),由伊卡生物技術(shù)有限公司(上海)提供;PI3K mRNA、AKT mRNA 的引物,由捷瑞生物工程有限公司(上海)合成。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法

將30只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和CSA組,每組10只。正常組小鼠未予以骨髓衰竭建模。依據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》規(guī)定的正常人每天常規(guī)用藥量1.07 g/kg,按照體表面積換算,CSA 組小鼠每天常規(guī)用藥量為0.027 g/kg,故每只小鼠按0.1 mL/10 g灌胃,在造模當(dāng)天起開(kāi)始給藥。正常組和模型組小鼠按0.1 mL/10 g灌胃生理鹽水。均每日灌胃1次,連續(xù)3 d。

1.5 骨髓衰竭動(dòng)物模型

參照有關(guān)文獻(xiàn)[6-8]所描述的造模方法,將DBA/2小鼠斷頸處死后,用75%(v/v)的乙醇浸泡5 min,常規(guī)消毒之后取出其胸腺,加入少許生理鹽水洗去血漬,輕輕磨碎以后用尼龍濾血網(wǎng)將其過(guò)濾,并通過(guò)4號(hào)針頭制成單細(xì)胞懸液,臺(tái)盼藍(lán)鑒定細(xì)胞的活性(其中活性細(xì)胞達(dá)95%以上)。在完成細(xì)胞計(jì)數(shù)后,將懸液配成所需濃度備用。先將C57BL/6小鼠予以不同劑量的60Co-γ射線全身照射,在實(shí)驗(yàn)小鼠接受輻照之后4 h內(nèi)立即經(jīng)由其尾靜脈緩慢輸入DBA/2小鼠的胸腺、淋巴結(jié)混合細(xì)胞1×106/只×0.2 mL。在造模3 d后,取小鼠的尾靜脈血,采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)計(jì)數(shù)。若顯示全血細(xì)胞減少,證實(shí)造模成功。

1.6 標(biāo)本采集

在實(shí)驗(yàn)第3天,各組小鼠按0.005 mL/g的標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射10%(v/v)的水合氯醛;施行麻醉后,經(jīng)尾靜脈叢采血,分別待做血常規(guī),并準(zhǔn)備離心制備洗滌血小板。

1.7 洗滌血小板的制備

以免疫性骨髓衰竭小鼠為模型,體外制備洗滌血小板。取小鼠靜脈血0.7 mL,按照1∶7的體積比加入ACD(2.5%(m/m)的檸檬酸鈉,2.0%(m/m)的葡萄糖,1.5%(m/m)的檸檬酸),以1 300 r/min離心20 min后獲得富含血小板的血漿(PRP);接著將PRP按2 500 r/min離心20 min,棄去上清液。用CGS緩沖液(0.123 mol/L氯化鈉,0.033 mol/L葡萄糖,0.013 mol/L檸檬酸鈉,pH=6.5)懸浮并且離心、洗滌沉淀的血小板;然后用修改的Tyrode's 緩沖液(2.5 mmol/L Hepes,150 mmol/L氯化鈉,2.5 mmol/L氯化鉀,1 mmol/L 氯化鈣,1 mmol/L 氯化鎂,12 mmol/L碳酸氫鈉,5.5 mmol/L葡萄糖,pH=7.4)重懸血小板,獲得洗滌血小板懸液,再用計(jì)數(shù)板對(duì)血小板予以計(jì)數(shù)。最后調(diào)整血小板懸液到濃度為3×108個(gè)/mL,在室溫條件靜置60 min[9]。

1.8 指標(biāo)檢測(cè)

1.8.1 血小板計(jì)數(shù)

運(yùn)用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定血小板計(jì)數(shù)。

1.8.2 流式細(xì)胞儀法檢測(cè)凋亡指標(biāo)

PE管依次排序編號(hào),加入流式試劑抗體各50 μL,將制備的洗滌血小板樣本顛倒混勻。取50μL加入PE管中;混勻震蕩PE管,使抗體充分結(jié)合;避光孵育,室溫(37 ℃)暗室靜置20 min;流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)Bax、Bad、caspase-9的活化。

1.8.3 采用Western blot法測(cè)定PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的蛋白表達(dá)水平

Western blot法檢測(cè)方法參照相關(guān)操作手冊(cè)。Western blot法檢測(cè)時(shí)以β-actin蛋白為內(nèi)參,運(yùn)用BandScan軟件分析條帶的光密度值,計(jì)算各組間蛋白的相對(duì)表達(dá)量(目的蛋白/內(nèi)參蛋白)。重復(fù)3次,取均值。

1.8.4 運(yùn)用QPCR法測(cè)定PI3K mRNA、AKT mRNA 的表達(dá)

QPCR 檢測(cè)方法參照相關(guān)操作手冊(cè)。研究運(yùn)用的是Primer 5.0計(jì)算機(jī)軟件所設(shè)計(jì)的PCR 引物,最終采用BLAST 分析對(duì)PCR 引物進(jìn)行引物特異性驗(yàn)證。數(shù)據(jù)計(jì)算運(yùn)用的公式是mRNA 相對(duì)表達(dá)量=,式中Δct=目標(biāo)基因CT 值-內(nèi)參(GAPDH)CT 值。所用引物見(jiàn)表1。

表1 PCR所用引物

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)循環(huán)血小板計(jì)數(shù)的變化

與正常組相比較,模型組小鼠血小板顯著減少(P＜0.05)。與之相反,CSA 組血小板計(jì)數(shù)顯著高于模型組(P＜0.05)。因此,CSA 可以有效提升骨髓衰竭性疾病的血小板計(jì)數(shù)。見(jiàn)表2。

表2 血小板計(jì)數(shù)的變化

2.2 促凋亡蛋白Bax、Bad、Caspase-9表達(dá)

與正常組相比較,模型組小鼠中的促凋亡蛋白Bax、Bad、Caspase-9表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05);而與模型組相比較,CSA 組中促凋亡蛋白Bax、Bad、Caspase-9表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 Bax、Bad、Caspase-9的表達(dá)

2.3 PI3K、AKT及其活化形式的表達(dá)

與正常組相比較,模型組的p-PI3K 和p-AKT表達(dá)水平均下降(P＜0.05);與模型組相比較,CSA組的p-PI3K 及p-AKT 表達(dá)水平均上升(P＜0.05)。提示CSA 可能通過(guò)上調(diào)PI3K/AKT 通路表達(dá)來(lái)起作用。見(jiàn)表4。

表4 PI3K、AKT的表達(dá)分析

2.4 PI3K mRNA、AKT mRNA的表達(dá)

與正常組相比較,模型組的PI3K mRNA 和AKT mRNA 表達(dá)水平均下降(P＜0.05)。與模型組相比較,CSA 組的PI3K mRNA 及AKT mRNA表達(dá)水平均上升(P＜0.05),提示CSA 能促進(jìn)PI3K/AKT 通路活化。見(jiàn)表5。

表5 PI3K mRNA、AKT mRNA的表達(dá)分析

3 討論

近年來(lái)發(fā)現(xiàn),免疫介導(dǎo)的造血干細(xì)胞損傷在骨髓衰竭疾病發(fā)病機(jī)制中占有非常重要的地位[10-11]。免疫性骨髓衰竭引起血小板減少導(dǎo)致的出血是臨床十分棘手的問(wèn)題,通常以皮膚、黏膜或內(nèi)臟出血為主要癥狀,反復(fù)經(jīng)常發(fā)作,有時(shí)會(huì)引起顱腦內(nèi)出血甚至可能危及生命[3]。本研究所選用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑閲?guó)際公認(rèn)的免疫性骨髓衰竭模型,其表現(xiàn)也與實(shí)際臨床十分接近。目前針對(duì)骨髓衰竭治療的藥物,譬如抗胸腺球蛋白(ATG)、免疫抑制劑,還有針對(duì)血小板減少的一些治療方法,例如糖皮質(zhì)激素、輸注血小板等[12]療法,要么價(jià)格昂貴,要么副作用較大或呈劑量依賴性,推廣應(yīng)用存在一定困難。因此,探尋更為新穎的、有效的止血方法尤為重要[8,13]。

在生理過(guò)程之中,凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡的過(guò)程,它的存在對(duì)于維護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起著極為重要作用。但在很多疾病過(guò)程中,過(guò)度的凋亡反而會(huì)造成機(jī)體的損傷。在免疫性骨髓衰竭發(fā)病過(guò)程中,血小板被過(guò)度破壞,同時(shí)啟動(dòng)了內(nèi)始式與外始式這兩條途徑介導(dǎo)的一系列凋亡過(guò)程,出現(xiàn)血小板的減少[14-15]。凋亡是一種高度管理化的程序性細(xì)胞死亡途徑,其進(jìn)程受到了PI3K/AKT在內(nèi)等多條信號(hào)通路的調(diào)控。PI3K/AKT通路中可利用促凋亡蛋白來(lái)調(diào)節(jié)血小板的生存周期,主要的促凋亡蛋白包括了Bax、Bad、Caspase家族蛋白等[16-20]。此外,對(duì)于PI3K/AKT通路而言,它通過(guò)直接或者間接調(diào)節(jié)線粒體的方式,較為深入地參與了血小板凋亡過(guò)程當(dāng)中不同階段的調(diào)控[21-24]。本研究結(jié)果顯示,與正常組相比較,模型組實(shí)驗(yàn)小鼠洗滌血小板中Bax、Bad、Caspase-9明顯升高,p-PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)水平下降,且PI3K mRNA和AKT mRNA表達(dá)水平也明顯下降,說(shuō)明PI3K/AKT通路參與了免疫性骨髓衰竭血小板凋亡,這與先前的一系列其他疾病的研究相吻合。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn),CSA能上調(diào)PI3K/AKT通路表達(dá)減少血小板凋亡。

綜上所述,PI3K/AKT 介導(dǎo)線粒體途徑血小板凋亡在免疫性骨髓衰竭血小板減少的機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。該研究為進(jìn)一步研發(fā)相關(guān)藥物打下了一定的基礎(chǔ)。