HPLC法測(cè)定納米膠束中甘草次酸、丹參酮ⅡA的載藥量和包封率

郭秀春,袁玥,李中強(qiáng),陳世一,康貝遙,王延玲,蒲曉輝

河南大學(xué)藥物研究所,河南 開封475004

乙型和丙型肝炎病毒感染、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)及其相關(guān)的肝硬化、肝功能衰竭和肝細(xì)胞癌(HCC),由于其在全球范圍內(nèi)的高患病率和轉(zhuǎn)移率,導(dǎo)致非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,是全世界疾病和死亡的主要原因[1]。盡管研究者已經(jīng)做出很大的努力,但肝病的治療現(xiàn)狀依然不容樂觀。

相較于合成藥物,中醫(yī)藥因其療效廣泛、副作用小而在肝癌的治療中脫穎而出。有臨床研究表明,血瘀癥狀貫穿肝癌的始終。因此,活血化瘀類的藥物能夠有效地抑制肝癌的發(fā)展。但是單用活血化瘀類藥物可能會(huì)促進(jìn)腫瘤血管生成,增加出血風(fēng)險(xiǎn)。已有研究[2]表明,補(bǔ)中益氣藥與活血化瘀藥相配伍可以在抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和改善腫瘤微環(huán)境等方面減少單用時(shí)的弊端。

甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)是從中藥甘草(Glycyrrhiza uralensisFisch.)中提取的甘草酸經(jīng)水解后得到的五環(huán)三萜類化合物[3],具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、解毒、保肝護(hù)肝、增強(qiáng)免疫力和抗腫瘤等多種藥理作用[4]。GA 不僅具有抗非病毒性肝損傷效應(yīng)[5-6],還能靶向結(jié)合肝Hep G2 細(xì)胞[7-8]。針對(duì)這種靶向作用,可通過合成設(shè)計(jì)多種GA 載藥體系,從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療肝細(xì)胞癌的目的。

丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA,TAN)是從中藥丹參中提取的脂溶性菲醌類化合物,是丹參的主要有效成分。在改善心腦血管疾病、抗癌、抗氧化、抗纖維化、抑菌等方面具有一定的療效[9-10]。研究[11-12]表明,TAN 可通過清除氧自由基抗脂質(zhì)過氧化、抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)活化Ca2+效應(yīng)、抑制纖維細(xì)胞增殖及膠原合成、抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、誘導(dǎo)HSC凋亡等方面發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

聯(lián)合用藥相比于單獨(dú)用藥具有增強(qiáng)藥物療效及最大限度地減少單個(gè)藥物的用量、降低藥物的毒副作用等多種優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)研究[13-14]證明,GA 和TAN配伍使用對(duì)肝病具有很強(qiáng)的治療效果。近年來,研究者利用藥物遞送載體,將TAN 和GA 實(shí)現(xiàn)共同遞送,從而發(fā)揮兩者的協(xié)同抗肝癌作用[15-16]。盡管GA 和TAN 均具有很強(qiáng)的抗肝癌活性,但由于兩者的難溶性及較低的生物利用度等問題極大地限制了其在臨床上的應(yīng)用。研究者開發(fā)了脂質(zhì)體、納米粒、納米乳等[17-18]制劑來提高GA 和TAN 的生物利用度。但這些制劑依然存在穩(wěn)定性差、藥物泄露、載藥量低等缺陷。因此,仍需研究一種可以提高GA 和TAN 溶解性和穩(wěn)定性的新劑型。本課題組在前期研究中,以具有良好生物相容性和生物降解性的聚乙二醇單甲醚-去氧膽酸(mPEG-DCA,MD)為材料,制備共載GA 和TAN 的肝靶向長(zhǎng)循環(huán)納米膠束。該膠束能提高GA 和TAN 的溶解性、穩(wěn)定性和生物利用度,具有控制藥物釋放速度及降低用藥量等優(yōu)點(diǎn)外,最重要的是可以靶向釋放GA 和TAN,達(dá)到高效低毒的治療肝細(xì)胞癌的目的。

包封率和載藥量是制備納米膠束過程中處方工藝篩選與質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo),其測(cè)定是重要的處方前研究工作。文獻(xiàn)[19-20]顯示,許多學(xué)者利用HPLC法對(duì)不同制劑中的藥物包封率和載藥量進(jìn)行測(cè)定,均取得較好的結(jié)果。而且,近年來對(duì)GA 和TAN 的研究方法多采用HPLC 法測(cè)定其制劑含量[21-22]。因此,為了評(píng)價(jià)共載GA 和TAN 的肝靶向長(zhǎng)循環(huán)納米膠束的質(zhì)量,本課題組建立了簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠的HPLC方法,可同時(shí)測(cè)定納米膠束中GA 和TAN,為該制劑的處方工藝和臨床前研究奠定基礎(chǔ)。

1 試藥和儀器

1.1 試藥

甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110723-201413,純度:99.6%)、丹參酮ⅡA 標(biāo)準(zhǔn)品(北京百奧萊博科技有限公司,CAS:568-72-9,純度:98%);甲醇(天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司,批號(hào):631072-66599,色譜純);無水乙醇(天津星馬克科技發(fā)展有限公司,批號(hào):20180105);三氯甲烷(天津市富宇精細(xì)化工有限公司,批號(hào):20190412);二甲基亞砜(DMSO,天津市德恩化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20200803);丙酮(AR,天津市化學(xué)試劑六廠,批號(hào):20191025);聚乙二醇單甲醚-去氧膽酸(mPEGDCA,實(shí)驗(yàn)室自制)。水為“娃哈哈”純凈水,其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

高效液相色譜儀(Waters2695-2489,上海沃特世科技有限公司);紫外可見分光光度計(jì)(UV-2600,日本島津公司);分析天平(BSA224S,德國(guó)Sartorius);超聲波清洗儀(北京泰元達(dá)精密清洗機(jī))。

2 方法與結(jié)果

2.1 納米膠束的制備

采用溶劑揮發(fā)法制備以m PEG-DCA 為材料的GA 和TAN 的混合納米膠束(TAN/GA/MD)。首先取一定量的材料m PEG-DCA、GA 和TAN 加入適量乙醇使溶解,隨后在高速攪拌下逐滴加入到超純水中,直至乙醇完全揮發(fā)后,用超聲粉碎機(jī)在60 W 的功率下超聲10 min后離心即得。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別稱取GA 標(biāo)準(zhǔn)品、TAN 標(biāo)準(zhǔn)品及m PEGDCA(MD)適量,用甲醇溶解并稀釋成濃度適宜的樣品,即為供試品溶液。用甲醇溶液作為空白對(duì)照,在200～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)供試品進(jìn)行紫外掃描,考察藥品及材料的紫外吸收情況,結(jié)果見圖1。

圖1 游離藥與納米粒材料的紫外波長(zhǎng)掃描圖

由圖1 可知,GA 在250 nm 處有最大吸收,TAN 的最大吸收峰在270 nm 處,同時(shí)空白材料在250 nm 和270 nm 處無干擾。因此,采用250 nm作為甘草次酸的檢測(cè)波長(zhǎng),采用270 nm 作為丹參酮ⅡA 的檢測(cè)波長(zhǎng)。

張麗娟等[21]制備了GA 納米粒,并采用HPLC法測(cè)定了納米粒中GA 含量,色譜條件中檢測(cè)波長(zhǎng)也選擇250 nm。胡國(guó)輝[23]建立了不同產(chǎn)地10 批不同丹參藥材中二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA 的含量測(cè)定方法,色譜條件中的檢測(cè)波長(zhǎng)也選擇了270 nm。這與本課題組通過紫外波長(zhǎng)掃描所確定的GA 和TAN 的檢測(cè)波長(zhǎng)一致。

2.2 色譜條件

色譜柱:Waters Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的磷酸鹽緩沖液(pH=3,體質(zhì)比=90∶10)。檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm(GA),270 nm(TAN);柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10μL。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

取GA 和TAN 標(biāo)準(zhǔn)品適量,用甲醇溶解至適宜濃度制備對(duì)照品溶液;另取m PEG-DCA 適量,用甲醇溶解至適宜濃度制備陰性對(duì)照品溶液;按照上述制備方法將藥品與材料混合制備混合對(duì)照品溶液。最后將制備好的三種溶液分別注入高效液相色譜儀,按照第2.2節(jié)所述色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖(見圖2)。

圖2 mPEG-DCA(A)、GA和TAN(B)的HPLC圖

如圖2所示,陰性對(duì)照品色譜圖與對(duì)照品溶液色譜圖相同保留時(shí)間處無干擾峰,且混合對(duì)照品色譜圖中GA 和TAN 的色譜峰分離較好,GA 的保留時(shí)間=10.441 min,TAN 的保留時(shí)間=9.198 min,表明方法專屬性強(qiáng),且GA 和TAN 能完全分離,能滿足同時(shí)檢測(cè)的要求。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取GA 和TAN 標(biāo)準(zhǔn)品各1.5 mg,共同置于100 mL容量瓶中,先用少量甲醇溶解,再用甲醇定量稀釋至刻度線,搖勻,即得GA 和TAN濃度均為150μg/mL的對(duì)照品貯備液。用移液管精密量取5 mL的對(duì)照品貯備溶液,置于50 mL棕色容量瓶中,甲醇定容至刻度,得到GA 和TAN濃度均為15μg/mL 的對(duì)照品溶液作為母液。再將母液分別稀釋成濃度為0.75,1.5,2.25,3,6,9,12,15μg/mL的溶液,按照第2.2節(jié)所述的色譜條件進(jìn)樣,記錄相應(yīng)的峰面積。以進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo),GA 和TAN 的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,分別得到GA 和TAN 的線性回歸方程,結(jié)果見圖3。

圖3 TAN(A)和GA(B)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

如圖3所示,縱坐標(biāo)Y代表色譜峰面積,橫坐標(biāo)X代表不同濃度,再通過峰面積Y對(duì)濃度X進(jìn)行線性回歸,最終能夠得出TAN 的線性回歸方程為:Y=84 606X+505.11(R2=0.999 9),GA 的線性回歸方程為Y=31 973X-1 934.5(R2=0.999 8),線性范圍為0.75μg/mL～15μg/m L。結(jié)果表明,在線性范圍內(nèi)GA 和TAN 的色譜峰面積與濃度具有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

配制濃度為6μg/mL的GA 和TAN 對(duì)照品溶液6等份,在第2.2 節(jié)所述色譜條件下分別進(jìn)樣10μL,在日內(nèi)及日間對(duì)其重復(fù)測(cè)定,考察精密度。然后記錄所測(cè)得的色譜峰面積,并通過第2.4節(jié)所得的線性方程計(jì)算濃度。最后計(jì)算出其日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值,具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

經(jīng)計(jì)算得出,GA 和TAN 對(duì)照品溶液的日內(nèi)RSD 分別為0.77%、0.99%(n=6),日間RSD 分別為1.04%、0.79%(n=6),RSD 均小于2%。結(jié)果表明,高效液相色譜法檢測(cè)GA 和TAN 濃度的精密度良好,符合《中國(guó)藥典》2020版的規(guī)定。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取濃度為1.5,6,12μg/mL的GA 和TAN 對(duì)照品溶液,分別在室溫下放置0,1,2,4,6,8,12 h后,在第2.2 所述色譜條件下分別進(jìn)樣10μL,測(cè)定其相應(yīng)的色譜峰面積,將結(jié)果帶入第2.4節(jié)所得的線性回歸方程中,計(jì)算其RSD 值,具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

通過對(duì)低、中、高3種濃度的GA 和TAN 對(duì)照品溶液在1,2,4,6,8,12 h不同時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定性的考察,其RSD 均小于2%。結(jié)果表明,其穩(wěn)定性較好。

2.7 方法回收率實(shí)驗(yàn)

取濃度為1.5,6,12μg/mL的GA 和TAN 對(duì)照品溶液,在第2.2 節(jié)所述色譜條件下分別進(jìn)樣10μL,測(cè)定其相應(yīng)的色譜峰面積,帶入第2.4節(jié)所得的線性回歸方程中,計(jì)算GA 和TAN 濃度,最后計(jì)算回收率及RSD 值,具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 方法回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

計(jì)算結(jié)果顯示,低、中、高3 種濃度的GA 和TAN 對(duì)照品溶液中GA 的平均回收率分別為101.33%、101.17%、100.33%;RSD 分別為0.61%、0.71%、0.25%(n=3)。TAN 的平均回收率分別為98.67%、99.01%、100.01%;RSD 分別為1.11%、0.59%、0.26%(n=3)。三個(gè)濃度的回收率均符合藥典規(guī)定,RSD 值均小于2%,結(jié)果表明回收率良好。

2.9 載藥量和包封率的測(cè)定

精密量取含GA 和TAN 的混合納米膠束溶液1 mL,置10 mL 容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,超聲15 min后用0.22μm 濾膜過濾,取續(xù)濾液10μL,在第2.2節(jié)所述色譜條件下注入HPLC,記錄峰面積,所得峰面積代入第2.4節(jié)所得的入回歸方程,計(jì)算藥物濃度C。再利用下述公式計(jì)算其包封率(encapsulation efficiency,EE)和載藥量(loading content,LC)。

其中,D為稀釋倍數(shù),即10;V為一批次制劑總體積;Wt為GA 或TAN 的投藥量;Ws為載體材料及藥物的總量。測(cè)定3批樣品,測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 三批納米膠束包封率和載藥量的測(cè)定結(jié)果(n=3)

由表4可知,3批納米膠束中GA 和TAN 的包封率均接近80%,載藥量均在6.00%以上。

3 結(jié)論

本課題組首先利用紫外分光光度計(jì)對(duì)載體材料、GA 和TAN 進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,確定GA 和TAN最大吸收峰位于250 nm 和270 nm,其材料無干擾。然后采用HPLC 法建立了同時(shí)測(cè)定納米粒中GA和TAN 的方法。色譜柱:Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的磷酸鹽緩沖液(pH=3,體積比=90∶10);檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm(甘草次酸)、270 nm(丹參酮ⅡA),柱溫30 ℃,流速1.0 mL·min-1,進(jìn)樣量10μL。結(jié)果表明,在上述色譜條件下,GA 和TAN 在0.75～15μg/mL 線性范圍內(nèi)色譜峰面積與濃度具有良好的線性關(guān)系,且精密度,穩(wěn)定性,方法回收率均符合藥典規(guī)定。測(cè)定了3批次的納米膠束,GA 和TAN 的包封率均在80%左右,載藥量均在6.0%以上。該方法操作簡(jiǎn)便快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可采用高效液相法同時(shí)測(cè)定混合納米粒中GA和TAN 的包封率和載藥量,為新制劑臨床前研究奠定了良好的基礎(chǔ)。