熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷的抗氧化及美白活性

張彪，滕聰，楊修仕，張瑞，王英平，任貴興,*

（1.成都大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點實驗室，四川成都 610106）

（2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）（3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118）

隨著生活水平的提高，越來越多的人開始注重抗衰老和皮膚美白方面的保養(yǎng)[1,2]。氧化過程是人體必不可少的生理過程，氧化自由基的過度產(chǎn)生會導(dǎo)致皮膚疾病，加速衰老[3,4]。另外，酪氨酸酶是黑色素合成中的關(guān)鍵酶，酪氨酸酶的過量表達會致使黑色素生成過量進而引起各種色素性疾病，導(dǎo)致皮膚老化[5]。然而，化學(xué)合成抗氧化劑如丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）、特丁基對苯二酚（TBHQ）具有一定毒性和致畸作用[6]。美白活性成分如曲酸、熊果苷、維生素C及其衍生物等又具有安全隱患、穩(wěn)定性不佳或功效顯現(xiàn)緩慢等缺點[7]。因此，尋求天然、安全有效的抗氧化和美白活性成分成為近年來國內(nèi)外的研究熱點之一。

西洋參（Panax quinquefoliumL.）是五加科人參屬的一種多年生草本植物，原產(chǎn)于北美洲東部。人參皂苷是西洋參的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗疲勞、抗黑色素生成等生物活性[8,9]。根據(jù)其苷元結(jié)構(gòu)的不同，可分為達瑪烷型皂苷、奧克梯隆型皂苷和齊墩果酸型皂苷3種類型[10]。目前應(yīng)用較為廣泛的提取方法有索氏提取、熱回流提取、超聲輔助提取等[11]。西洋參的根、莖葉等部位均含有人參皂苷，且其皂苷組分較為類似，主要為Rb1、Re、Rd、Rc、Rg1、Rb3，但莖葉中人參皂苷含量明顯高于主根[12-15]。西洋參根一般要生長3～4年才能采收[16]，而西洋參莖葉可于每年9～10月份進行采收[17]，且其人參皂苷含量受生長年限的影響不大[18]，因而以莖葉為原料生產(chǎn)的人參皂苷具有成本更低的特點。

人參皂苷分為極性人參皂苷和低極性人參皂苷[19]，低極性人參皂苷的生物活性和吸收效率通常高于極性人參皂苷[20-23]，而對人參屬植物使用一些加工處理方式可以導(dǎo)致低極性人參皂苷含量的增加。通過糖苷酶及微生物等生物轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生低極性皂苷，特異性強，反應(yīng)條件溫和，但反應(yīng)時間較長，條件要求高[24,25]。還有學(xué)者采用微波加酸或加堿處理，其投料量大，但存在轉(zhuǎn)化率低，安全性及環(huán)境污染等問題[26,27]。上述轉(zhuǎn)化方法均不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求，而熱轉(zhuǎn)化法較為適合，其具有操作簡單、轉(zhuǎn)化率高、單次生產(chǎn)量大等優(yōu)勢。顧承真等[28]將人參、西洋參、三七噴灑適量水后置于高壓滅菌鍋中，在120 ℃條件下蒸12 h再保持24 h，其主要成分（人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等）全部轉(zhuǎn)化為低極性人參皂苷Rk3、Rh4、Rk1、Rg5和20(S/R)-Rg3等。Xue等[29]以三七皂苷為原料，于高壓反應(yīng)釜中130 ℃條件下蒸制3 h，使5種極性人參皂苷（三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb2、Rd）幾乎全部轉(zhuǎn)化為3種低極性人參皂苷（人參皂苷Rk3、Rh4、Rh5）。此外，有研究表明，熱轉(zhuǎn)化過程中低極性人參皂苷含量會隨著溫度（100～120 ℃）的升高與時間（0.5～4 h）的延長而增加[30]。實驗室前期優(yōu)化了可工業(yè)化制備的熱轉(zhuǎn)化條件。發(fā)現(xiàn)西洋參莖葉皂苷（American Ginseng Stem-leaf Saponins，AGS）在130 ℃下加熱3 h后，低極性人參皂苷（Rg6、F4、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1等）含量由0.08 mg/mg增加到0.76 mg/mg[31]。

因此，本文利用高效液相色譜技術(shù)分析熱轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷中低極性人參皂苷的含量變化，同時對熱轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷抗氧化活性和美白活性進行研究，為熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷活性（Heat-Transformed American Ginseng Stem-leaf Saponins，HAGS）的深入研究及其開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

西洋參莖葉皂苷購自吉林宏久生物科技有限公司。人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Re、20(S)-Rg2、Rb2、Rd、Rg6、F4、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1（≥98%），吉林人參研究院；乙腈（色譜純），美國Thermo Fisher公司；DMSO（≥99.7%）、DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，≥98%）、ABTS（2,2'-氮聯(lián)-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，≥98%）、Trolox，美國Sigma公司；左旋多巴（≥98%）、戊二醛、亞甲基藍、TPTZ（2,4,6-三吡啶基三嗪，≥98%），上海源葉生物科技有限公司；B16F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞，武漢普諾賽生命科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素，上海富衡生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS），美國Gibco公司；熊果苷（≥98%），阿拉丁試劑有限公司；過硫酸鉀、醋酸、乙醇、無水氯化鐵均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YMC-ODS-AM色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、LC-20A高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；倒置顯微鏡，上海永亨光學(xué)儀器制造有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，日本Panasonic公司；臺式離心機，可成儀器設(shè)備有限公司；水平振蕩儀，美國Orbital shaker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷的制備

取西洋參莖葉皂苷適量置樣品盤中，高壓蒸汽滅菌鍋130 ℃左右加熱處理3 h，待冷卻后，冷凍干燥，即得熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷[31]。

1.3.2 轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷中人參皂苷含量測定

液相色譜條件[31]：采用色譜柱YMC-ODS-AM（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：水（A）和乙腈（B），流速：0.8 mL/min，檢測波長202 nm，柱溫：25 ℃，洗脫條件如表1所示。

樣品溶液配置：分別精密稱取適量西洋參莖葉皂苷和熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷，體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇溶解配置成終濃度為4 mg/mL的溶液，過0.45 μm濾膜后進樣，每次進樣30 μL，重復(fù)三次。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精密稱取適量的人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Re、20(S)-Rg2、Rb2、Rd、Rg6、F4、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3及Rk1，體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶解配置成終濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。過0.45 μm濾膜，按進樣量5、10、15、20、25、30 μL分別依次注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，皂苷進樣含量為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 高效液相色譜梯度洗脫程序Table 1 High performance liquid chromatography gradient elution program

1.3.3 轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷的抗氧化活性

1.3.3.1 DPPH自由基清除率的測定

準(zhǔn)確稱取DPPH試劑19.71 mg，用無水乙醇溶解至500 mL容量瓶中，搖勻得0.1 mmol/L，取待測樣溶液0.1 mL（AGS、HAGS為0.1、0.5、1、2、5 mg/mL，Trolox為0.025、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL，所有測試樣品均溶解在70%乙醇）和3.9 mL DPPH溶液混勻，室溫避光反應(yīng)1 h，在517 nm波長下測定吸光度，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為空白對照[32]。根據(jù)公式（1）計算待測樣品對DPPH的自由基清除率：

式中：

F1——DPPH自由基清除率，%；

Az——0.1 mL樣品和3.9 mL DPPH的吸光度值；

Aj——0.1 mL樣品和3.9 mL無水乙醇的吸光值；

A0——0.1 mL70%乙醇和3.9 mL DPPH的吸光度值。

1.3.3.2 ABTS+自由基清除率的測定

取352 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液和20 mL 7 mmol/L ABTS儲備液混合，室溫避光儲備12～16 h得到ABTS+·溶液，測定之前加入無水乙醇將ABTS+·溶液稀釋至吸光值為0.700±0.02（734 nm），將3.9 mL的ABTS+·溶液與0.1 mL待測樣液（AGS、HAGS為0.1、0.5、1、2、5 mg/mL，Trolox為0.025、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL，所有測試樣品均溶解在體積分?jǐn)?shù)70%乙醇）混合均勻，室溫避光反應(yīng)6 min，在734 nm下測吸光值，70%乙醇為空白對照[33]。根據(jù)公式（2）計算ABTS自由基清除率：

式中：

F2——ABTS+自由基清除率，%；

Am——0.1 mL樣品和3.9 mL ABTS·+溶液的吸光值；

An——0.1 mL70%乙醇和3.9 mL ABTS·+溶液的吸光值。

1.3.3.3 還原力的測定

0.3 mol/L醋酸緩沖液（pH值3.6），10 mmol/L TPTZ溶液（40 mmol/L的鹽酸溶液配置）和20 mmol/L FeCl3以10:1:1的比例混合得FRAP工作液。3.9 mL FRAP工作液加入0.1 mL樣品溶液（濃度均為5 mg/mL），混勻后，在37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)10 min，于593 nm下讀取吸光度值，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為空白對照[34]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取0.1 mL系列濃度為0.025、0.05、0.1、0.15、0.2和0.5 mg/mL Trolox，與3.9 mL FRAP溶液混合，在37 ℃水浴中反應(yīng)10 min，于593 nm下讀取吸光值，以Trolox的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=2.4817x+0.0177，R2=0.9993。結(jié)果FRAP值表示為每克干重相當(dāng)于Trolox還原力的相當(dāng)量（mg TEAC/mg DW）。

1.3.4 轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷的美白活性

1.3.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

無菌條件下，將B16F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16細(xì)胞）接種于含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)，用PBS漂洗1次，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，添加含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，于二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2的飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，每2 d傳代一次。

1.3.4.2 B16細(xì)胞增殖率的測定

取對數(shù)期生長的B16細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升2×105個細(xì)胞，接種于96孔板，每孔100 μL，于培養(yǎng)箱中37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，分別加入100 μL不同濃度（0.025、0.05和0.1 mg/mL）的樣品，每個濃度3次重復(fù)，24 h后用PBS洗1次，加入50 μL HBSS（含1.25%戊二醛＋0.6%亞甲基藍），至培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出傾倒掉染色液，蒸餾水漂洗，加入100 μL洗脫液（含49% PBS緩沖液+體積分?jǐn)?shù)50%乙醇+體積分?jǐn)?shù)1%乙酸），室溫振搖30 min，波長570 nm測吸光度值[35]。根據(jù)公式（3）計算細(xì)胞存活率。

式中：

P——細(xì)胞存活率，%；

A0——對照組吸光度；

Aw——樣品組吸光度。

1.3.4.3 B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶抑制活性的測定

取對數(shù)期生長的B16細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升5×105個細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔1 mL，于培養(yǎng)箱中37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗1次，每孔加入1 mL不同濃度（0.025、0.05和0.1 mg/mL）的樣品，48 h后，棄上清液，用PBS清洗1次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞沉淀。加入1 mL 0.5%脫氧膽酸鈉水溶液，在-20 ℃下放置5 min，然后在4 ℃下放置10 min裂解細(xì)胞制備含酪氨酸酶提取液。取該提取液0.5 mL，于37 ℃預(yù)溫10 min后加入0.3%多巴溶液0.5 mL，37 ℃水浴反應(yīng)5 min后取出，在475 nm處下測定吸光值，平行試驗3次[36]。細(xì)胞酪氨酸酶抑制率按公式（4）計算：

式中：

Z1——酪氨酸酶抑制率，%；

B0——對照組吸光度值；

Bn——實驗組吸光度值。

1.3.4.4 B16細(xì)胞內(nèi)黑色素形成抑制活性的測定

細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.3.4.3。在收獲的細(xì)胞沉淀中加入1 mL 1 mol/L的NaOH（含體積分?jǐn)?shù)10% DMSO）溶液，于80 ℃水浴1 h充分溶解后，測定405 nm處的吸光值[37]。根據(jù)公式（5）計算抑制率：

式中：

Z2——黑色素形成抑制率，%；

C0——對照組吸光度；

Cn——樣品組吸光度。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 19軟件進行數(shù)據(jù)分析，所得結(jié)果進一步采用Origin 9.1作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及含量測定

圖1 轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷的HPLC-UV液相圖譜Fig.1 HPLC-UV liquid chromatogram of American ginseng stem-leaf saponins before and after transformation

如圖1所示，圖1a為轉(zhuǎn)化前的西洋參莖葉皂苷的液相色譜圖，圖1b為轉(zhuǎn)化后的西洋參莖葉皂苷的液相色譜圖。人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量如表2所示，熱轉(zhuǎn)化后，西洋參莖葉皂苷中總?cè)藚⒃碥蘸坑?.46 mg/mg顯著增加至0.75 mg/mg，其中極性人參皂苷Re、Rg2(S)、Rb2、Rd含量減少，而低極性人參皂苷（包括Rg6、F4、Rh4、Rg3(S)、Rg3(R)、Rk1）含量由0.07 mg/mg顯著增加至0.66 mg/mg。本研究結(jié)果與Hwang等[38]和Kim等[39]得出熱處理后人參粗皂苷含量增加，極性人參皂苷含量逐漸減少，而低極性人參皂苷含量顯著增加的結(jié)論相似。另外，有研究表明，原人參二醇型皂苷Rb2、Rd的C-20位糖苷鍵斷裂產(chǎn)生人參皂苷Rg3，而人參皂苷Rg3的C-20位置進一步脫水轉(zhuǎn)化為Rg5和Rk1[40]。極性人參皂苷Re經(jīng)過脫糖和脫水反應(yīng)，可生成低極性人參皂苷Rh4[41]。在本研究中，低極性人參皂苷Rg6、F4、Rh4、20S-Rg3、20R-Rg3、Rk1可能是由于極性人參皂苷Re、Rb2和Rd在熱轉(zhuǎn)化過程中脫去糖基和水分子形成的。

表2 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及含量Table 2 Establishment and content of standard curve of ginsenosides (mg/mg)

2.2 西洋參莖葉皂苷抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力

如圖2所示，轉(zhuǎn)化前后的西洋參莖葉皂苷均具有清除DPPH自由基的能力，且呈濃度依賴關(guān)系。Trolox的DPPH自由基清除能力最強，濃度為0.2 mg/mL時，Trolox對DPPH自由基的清除率為60.48%。濃度為5 mg/mL時，熱轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷對DPPH自由基的清除率分別為16.65%和38.28%，可以看出，轉(zhuǎn)化后西洋參莖葉皂苷對DPPH自由基的清除能力得到顯著提高。袁元等[42]研究報道白參、紅參和黑參的DPPH自由基清除率大小順序為黑參＞白參＞紅參，可能原因是白參的總皂苷高于紅參，且紅參中生成的稀有人參皂苷Rg3、Rh1的含量有限，而黑參總皂苷含量雖然沒有白參總皂苷含量多，但由于生成了大量具有高抗氧化性的人參皂苷Rg3、Rh1，所以黑參皂苷自由基清除能力最強。Lee等[43]研究表明膨化前后紅參提取物的DPPH自由基清除率分別為51%和86.2%。膨化紅參中總?cè)藚⒃碥蘸刻岣?，其中人參皂苷Rg3(S)含量從0.23 mg/g顯著增加至0.46 mg/g。膨化紅參提取物體外抗氧化活性增強的原因之一可能是總?cè)藚⒃碥蘸炕蛉藚⒃碥誖g3(S)的增加。在本研究中，熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷的總?cè)藚⒃碥蘸康玫斤@著提高，其中人參皂苷Rg3（包括Rg3(S)和Rg3(R)）含量從0.03 mg/mg增加至0.17 mg/mg，所以熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷比西洋參莖葉皂苷具有更強的抗氧化能力。此外，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的形成可能是熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷抗氧化活性增強的另一個原因[44]。Sharma等[45]報道稱，熱加工過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)，進而產(chǎn)生了深色色素。Manzocco等[46]認(rèn)為這些色素（尤其是類黑素）是具有抗氧化活性的化合物。所以，抗氧化活性的提高可能與美拉德褐變色素的形成有關(guān)，而美拉德褐變色素的產(chǎn)生增強了熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷的抗氧化活性。

圖2 轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷對DPPH自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of American ginseng stem-leaf saponins on DPPH free radical before and after transformation

2.2.2 ABTS+自由基清除能力

如圖3所示，轉(zhuǎn)化前后的西洋參莖葉皂苷均具有清除ABTS+自由基的能力，且呈濃度依賴關(guān)系。Trolox的ABTS+自由基清除能力最強，濃度為0.2 mg/mL時，Trolox對ABTS+自由基的清除率為51.37%。濃度為5 mg/mL時，熱轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷的ABTS+自由基清除率分別為8.24%和41.94%，轉(zhuǎn)化后西洋參莖葉皂苷ABTS+自由基清除能力顯著提高。

Lee等[43]測得膨化前后紅參提取物的ABTS+自由基清除率分別為28.72%和72.23%。膨化紅參提取物的DPPH與ABTS+自由基清除率均在70%以上。Hwang等[47]研究表明隨著熱處理溫度的升高，人參的DPPH自由基清除能力與ABTS+自由基清除能力均得到顯著提高。其它研究表明，ABTS法測定的抗氧化能力與DPPH法測定的抗氧化能力呈極顯著正相關(guān)[48]。本研究中，西洋參莖葉皂苷、熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷和Trolox的ABTS+自由基清除能力也表現(xiàn)出與DPPH自由基清除能力一致的趨勢。

圖3 轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷對ABTS+自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of American ginseng stem-leaf saponins on ABTS free radical before and after transformation

2.2.3 還原力

圖4 轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷的還原力（FRAP值）Fig.4 Reducing power of American ginseng stem-leaf saponins before and after transformation (FRAP)

還原力是評價天然產(chǎn)物抗氧化能力的指標(biāo)之一。不同樣品的還原能力如圖4所示，在5 mg/mL濃度下，熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷的F R A P值為25.22 mg TEAC/g DW，西洋參莖葉皂苷的FRAP值為3.24 mg TEAC/g DW。熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷的還原能力約為西洋參莖葉皂苷的8倍。本文測定熱轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷的還原力結(jié)果與Hwang等[38]得出熱處理后人參根和人參葉的還原力顯著提高的結(jié)果相似。此外，Gui等[49]研究發(fā)現(xiàn)對白參粉和紅參粉進行擠壓蒸煮后還原能力均得到提高。本研究中，熱轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷的還原力與DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力趨勢保持一致。

2.3 西洋參莖葉皂苷美白活性

2.3.1 轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷對B16細(xì)胞增殖的影響

不同樣品處理后的B16細(xì)胞存活率如圖5所示，在0.025～0.1 mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著西洋參莖葉皂苷與熊果苷濃度的升高，B16細(xì)胞存活率未見明顯下降。而隨著熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷濃度的逐漸升高，熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷對B16細(xì)胞表現(xiàn)出一定的抑制作用，但在濃度0.1 mg/mL時，熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷處理下的B16細(xì)胞存活率仍大于90%，表明轉(zhuǎn)化前后的西洋參莖葉皂苷在受試濃度范圍內(nèi)不會對B16細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

圖5 轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷對B16細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effects of American ginseng stem-leaf saponins on B16 cell proliferation before and after transformation

2.3.2 轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷對B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響

酪氨酸酶是黑色素合成的關(guān)鍵酶，抑制酪氨酸酶活性就能夠有效抑制黑色素的形成[5]。如圖6所示，在0.025～0.1 mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的提高，樣品對細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的抑制作用越來越強，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。在各個測試濃度下，熊果苷對B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的抑制作用最強。在0.025～0.05 mg/mL濃度范圍內(nèi)，西洋參莖葉皂苷對酪氨酸酶的抑制作用強于熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷；當(dāng)濃度達到0.1 mg/mL時，熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷對酪氨酸酶的作用強于西洋參莖葉皂苷，抑制率分別為33.54%和30.22%。研究表明，人參皂苷Rb2、Rh4、Rg3和Rk1均能抑制酪氨酸酶活性[50-53]。在本研究中，西洋參莖葉皂苷中人參皂苷Rb2和Rg3(R)含量分別為0.12 mg/mg和0.03 mg/mg。熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷中人參皂苷Rb2、Rh4、Rg3(S)、Rg3(R)和Rk1含量分別為0.02、0.16、0.05、0.12和0.12 mg/mg。雖然熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷中人參皂苷Rb2、Rh4、Rg3(S)、Rg3(R)和Rk1含量顯著高于西洋參莖葉皂苷中人參皂苷Rb2和Rg3(R)含量，但熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷對酪氨酸酶的抑制作用并未顯著強于西洋參莖葉皂苷。有研究表明，不同藥物的組合應(yīng)用所產(chǎn)生的效應(yīng)關(guān)系可以是協(xié)同作用，也可以是拮抗作用[54]。所以造成熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷對酪氨酸酶的抑制作用并未顯著強于西洋參莖葉皂苷的可能原因是熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷中各組分之間存在著抑制酪氨酸酶活性的拮抗作用。

圖6 轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷對B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.6 Inhibition of saponins from American ginseng stem-leaf saponins on tyrosinase activity in B16 cells before and after transformation

2.3.3 轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷對B16細(xì)胞內(nèi)黑色素形成的抑制作用

如圖7所示，在不同的濃度下處理B16細(xì)胞，隨著樣品濃度的提高，樣品對B16細(xì)胞內(nèi)黑色素形成的抑制作用逐漸增強，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。在濃度為0.1 mg/mL時，熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷對細(xì)胞內(nèi)黑色素形成的抑制作用最強，西洋參莖葉皂苷次之，熊果苷最弱，抑制率分別為29.33%、17.27%和12.31%。這與吳永祥等[55]測得100 mg/L的熊果苷對黑色素生成的抑制率為17.29%實驗結(jié)果相似。然而，本研究結(jié)果與酪氨酸酶活性抑制結(jié)果：熊果苷＞熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷＞西洋參莖葉皂苷的趨勢不一致。有研究報道，人參皂苷Rb2通過下調(diào)小眼畸型相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）和酪氨酸酶（TYR）表達，降低小鼠黑色素細(xì)胞中的黑色素形成[50]。人參皂苷Rh4苷元可通過下調(diào)MITF和TYR顯著降低B16黑色素瘤細(xì)胞中的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平，抑制黑色素形成[51]。人參皂苷Rg3能有效抑制MITF、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TRP1）和TYR的表達，提高細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號蛋白水平來抑制黑色素形成[52]。Rk1通過激活MEK-ERK信號通路來抑制酪氨酸酶表達，減少黑色素的形成[53]。上述研究表明，熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷與西洋參莖葉皂苷除通過抑制酪氨酸酶活性來減少黑色素生成的途徑外，還存在其他抑制黑色素形成的機制途徑，所以熊果苷對黑色素形成的抑制作用最弱。此外，又由于熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷中人參皂苷含量（Rb2、Rh4、Rg3、Rk1）明顯高于西洋參莖葉皂苷，因此，熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷對B16細(xì)胞內(nèi)黑色素形成的抑制作用強于西洋參莖葉皂苷。

圖7 轉(zhuǎn)化前后西洋參莖葉皂苷對B16細(xì)胞內(nèi)黑色素形成的抑制作用Fig.7 Inhibition of saponins from American ginseng stem-leaf saponins on melanin formation in B16 cells before and after transformation

3 結(jié)論

本研究利用西洋參莖葉皂苷作為原料，通過熱轉(zhuǎn)化處理使得西洋參莖葉皂苷中的極性人參皂苷脫去糖基和水分子形成低極性人參皂苷，低極性人參皂苷含量得到顯著提高。同時，熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷表現(xiàn)出比西洋參莖葉皂苷更強的DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、還原能力、抑制酪氨酸酶活力以及抑制黑色素合成能力，并表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。這些結(jié)果將對西洋參莖葉皂苷的開發(fā)研究提供重要的參考價值，為后期深入探究熱轉(zhuǎn)化西洋參莖葉皂苷的抗氧化、美白相關(guān)的活性機制奠定基礎(chǔ)。