蓮子中不同蛋白的結(jié)構(gòu)及理化特性對比分析

孫乾，黃敏麗，曾木花，劉思迪，郭澤鑌

（福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建農(nóng)林大學中愛國際合作食品物質(zhì)學與結(jié)構(gòu)設計研究中心，福建福州 350000）

蛋白質(zhì)在日常營養(yǎng)膳食中不可或缺，由于其分子結(jié)構(gòu)的復雜性，研究蛋白質(zhì)分子的多尺度結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)功能活性的關系，對揭示蛋白質(zhì)功能特性的變化規(guī)律，以及食品性狀與感官特性間的影響至關重要。

蓮子是中國特有的種子資源和經(jīng)濟作物[1]，每年產(chǎn)量以10%～15%增長，占國際貿(mào)易量的90%以上。福建主產(chǎn)區(qū)種植的“建蓮”營養(yǎng)全面[2]，富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[3]，研究表明蓮子蛋白質(zhì)占蓮子總質(zhì)量的14%～17%，最高可達25%，氨基酸組成種類齊全[4]。國內(nèi)外研究學者對蓮子蛋白的分離以及結(jié)構(gòu)進行了相關研究，發(fā)現(xiàn)蓮子含有約19.85%的基于干重的蛋白質(zhì)，并且與FAO/WHO模式相比顯示出均衡的氨基酸組成，具有與大豆相似的營養(yǎng)特性[2]。唐佩華等[3]對廣昌白蓮蛋白的組成、品質(zhì)等進行了研究，發(fā)現(xiàn)白蓮中清、球蛋白含量占70%以上，且氨基酸含量均衡。李向紅等[5]在前期研究基礎上，使用常規(guī)堿提獲取蓮子蛋白，得到蛋白提取率為78.93%，蛋白等電點在4.5左右。蘇貝[6]對比不同方法提取湘蓮蛋白，并分析了不同提取方式蓮子蛋白質(zhì)理化功能特性的異同。Zeng等[7]采用Osborne法對湘蓮蓮子蛋白進行分離，并結(jié)合傅里葉變換紅外光譜（Fourier Transform Infrared Reflection，F(xiàn)T-IR）和紫外可見光譜（Ultraviolet Visible，UV）對蛋白加以結(jié)構(gòu)研究。另有研究學者分析了蓮子蛋白組成等，并對蓮子蛋白進行了物理與酶法的改性處理[8-9]。目前與蓮子蛋白相關的研究相對缺乏，尤其是關于“建蓮”不同蛋白組分的結(jié)構(gòu)表征及其理化性質(zhì)的系統(tǒng)研究。基于蓮子蛋白的營養(yǎng)特性。本研究以蓮子中不同組分蛋白（分離蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白）作對比，從蛋白提取、理化特性、多尺度結(jié)構(gòu)等差異性進行分析；闡明蓮子蛋白理化特性與多尺度結(jié)構(gòu)間的構(gòu)效關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮子，福建閩江源綠田實業(yè)投資發(fā)展有限公司；大豆油，福州市永輝超市（大儒世家店）；NaOH、HCl、無水乙醇、NaCl，均為光譜純，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、溴化鉀，均為光譜純，阿拉?。ㄉ虾＃┥萍脊煞萦邢薰?。

1.2 儀器與設備

FE28 pH計，梅特勒-托多利儀器（上海）有限公司；L8900全自動氨基酸分析儀，日本Hitachi高新技術公司；F-7000熒光分光光度計，日本Hitachi公司；Malvern Zetasizer Nano ZS90電位分析儀，英國Malven公司；Mastersizer 3000激光粒度儀，英國Malven公司；Nanodrop 2000c型超微量紫外分光光度計，美國Themo Fisher Scientific公司；TENSOR II傅里葉紅外光譜分析儀，德國Bruker公司；Jasco-815圓二色譜儀，日本Jasco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蓮子分離與分級蛋白的制備

蓮子粉→加去離子水→0.5 mol/L NaOH調(diào)pH值9.0→4 000 r/min離心8 min→收集上清液→0.5 mol/L HCl調(diào)pH值4.9→4 000 r/min離心8 min→收集沉淀→復溶水洗至中性→真空冷凍干燥→蓮子分離蛋白（Lotus Seed Protein Isolate，LSPI）

參考Sun等[10]的方法并修改。

蓮子粉→加去離子水→4 000 r/min離心10 min→收集上清液（清蛋白Lotus Seed Albumin，LSA）、沉淀→加NaCl→4 000 r/min離心10 min→收集上清液（蓮子球蛋白Lotus Seed Globulin，LSGlo）、沉淀→加體積分數(shù)70%乙醇→4 000 r/min離心8 min→收集上清液（蓮子醇溶蛋白Lotus Seed Prolamin，LSP）、沉淀→0.5 mol/L NaOH調(diào)pH值9.0→4 000 r/min離心10 min→收集上清液→0.5 mol/L HCl調(diào)pH值4.9→離心→4 000 r/min離心8 min→復溶水洗至中性→真空冷凍干燥→蓮子谷蛋白（Lotus Seed Glutein，LSGlu）

1.3.2 基礎指標

水分含量測定參照GB/T 5009.3-2016[11]，采用直接干燥法；灰分含量測定：參照GB/T 5009.4-2016[12]，采用重量法；蛋白質(zhì)含量測定：參照GB/T 5009.5-2016[13]，采用凱氏定氮法；脂肪含量測定：參照GB/T 5009.6-2016[14]，采用索氏抽提法；淀粉含量測定：參照GB/T 5009.9-2016[15]，采用酸水解法。

1.3.3 理化特性

1.3.3.1 等電點

將蛋白稀釋至濃度為1 mg/mL，用0.01 mol/L HCl或NaOH將蛋白溶液調(diào)至不同pH值3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6，在不同pH值下沉淀蛋白，待靜置一段時間后，8 000 r/min離心10 min，上清液在紫外280 nm測定，吸光度最小的即為蓮子蛋白的等電點。

1.3.3.2 溶解度

調(diào)蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，室溫下磁力攪拌60 min，用NaOH或HCl調(diào)溶液pH值至7.0，3 600 r/min離心20 min，收集上清液。取5 mL上清液采用凱氏定氮法測定蛋白含量。

1.3.3.3 乳化特性

參考Xiong等[16]的方法稍作修改。配制濃度10 mg/mL溶液，加入大豆油10 mL，10 000 r/min乳化2 min，乳化后吸取乳液50 μL，加入0.1% SDS約5 mL，在紫外500 nm測定吸光值A0。待靜置10 min，再次吸取乳液，測定吸光值A10。

式中：

EAI——乳化性，m2/g；

ESI——乳化穩(wěn)定性，%；

φ——油相體積分數(shù)；

c——初始蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.4 粒徑與電位

配制蛋白樣品濃度1 mg/mL，分散劑為Water，分散劑折射率1.330，采用Nanoseries ZS電位測定儀測定蛋白溶液電勢。測定溫度為25 ℃，pH值7.0。

1.3.5 SDS-PAGE凝膠電泳與分子量分布

取蛋白樣品2 mg，加入1×Loading buffer，按照試劑盒說明操作。參考Rutkevicius等[17]的方法并稍作修改。將蛋白用磷酸鹽緩沖液（2% SDS，pH值7.0）溶解配制成5 mg/mL的分散液，4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min后取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾并用體積排阻色譜測定和分析。標準蛋白及各蛋白樣品在相同色譜條件下進行體積排阻色譜分析（SEC-HPLC）。

1.3.6 巰基、二硫鍵與表面疏水性

配制蛋白溶液，依次加入β-巰基乙醇、尿素、TCA等溶液水浴，高速離心10 min除去有機相。溶解在磷酸鹽緩沖液中，再加入DNTB水浴，高速離心。紫外412 nm測定吸光度，以13 600 M-1cm-1消光系數(shù)計算總巰基（-SH）濃度。蛋白溶液溶解于EDTA、甘氨酸、SDS等磷酸鹽緩沖液中，高速離心10 min，取5 mL上清液加入0.1 mL Ellman試劑中，紫外412 nm處測定吸光度并計算游離巰基。總巰基和游離巰基濃度計算公式如下。

式中：

F總——總巰基（-SH）濃度，μmol/g；

F游離——游離巰基濃度，μmol/g；

73.53——Ellman試劑的摩爾消光系數(shù)，106/(1.36×104)=73.53；

D——稀釋系數(shù)（D1=2.03）；

C——樣品蛋白質(zhì)的最終質(zhì)量濃度，mg/mL。

二硫鍵濃度的計算方法見公式（5）。

式中：

F——二硫鍵（-S-S-）濃度，μmol/g。

此外，配制蛋白質(zhì)量濃度范圍0.05～10.8 mg/mL，并加入ANS作為熒光探針測定表面疏水性，激發(fā)波長390 nm，掃描范圍400～600 nm，狹縫寬度為5 nm，計算熒光強度對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的初始斜率，作為蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)（H0）。

1.3.7 蓮子蛋白分子特性

1.3.7.1 內(nèi)源熒光光譜

參考Maria等[18]的方法并作修改。配制蛋白溶液并稀釋，激發(fā)波長290 nm，掃描范圍240～480 nm，掃描速率1200 nm/min。測定蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.3.7.2 紫外分光光度（UV）

配制蛋白溶液并稀釋，掃描范圍200～400 nm，掃描速率50 nm/min，在石英比色皿中測定吸光度。

1.3.7.3 圓二色光譜（Circular Dichroism，CD）

參考Erickson等[19]的方法并作修改。配制蛋白溶液并稀釋，掃描速度2 s/min，掃描范圍190～250 nm。通過Dichro Web網(wǎng)站Contin程序分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)并進行計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各組實驗數(shù)據(jù)平行測定均3次，p＜0.05被認為數(shù)據(jù)之間具有顯著差異；研究結(jié)果采用Origin 8.5軟件作圖，微觀結(jié)構(gòu)圖由系統(tǒng)自帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮子主要成分及不同蓮子蛋白組分含量

蓮子中主要成分為碳水化合物71.12%、蓮子蛋白16.14%、其他為水分、灰分、少量脂肪等。蓮子分級蛋白中清蛋白含量占比最多為55.05%，其次為谷蛋白占24.70%，球蛋白與醇溶蛋白分別占5.58%和0.05%。蔡聯(lián)輝等[20]研究發(fā)現(xiàn)，“湘蓮”中含有清蛋白41.58%、球蛋白26.58%、醇溶蛋白6.0%、谷蛋白18.0%。這種分級蛋白含量上的差異性可能是因為“湘蓮”與福建“建蓮”的種質(zhì)資源不同。也有可能是因為蓮子在采收與貯藏的不同時期，淀粉、蛋白質(zhì)等含量均會有不同的變化，因而會產(chǎn)生一定的差異性。

2.2 溶解度與乳化特性

不同蓮子蛋白（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白）的溶解度與乳化特性對比如下表1所示。

表1 不同蓮子蛋白理化特性對比Table 1 Comparison of physicochemical properties of different lotus seed proteins

評價蛋白質(zhì)功能特性之一的指標是溶解度，間接反映出蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的改變情況，以及蛋白質(zhì)分子的電荷和疏水性的平衡[21]。如表1所示，清蛋白51.88%與球蛋白42.47%的溶解性比蓮子分離蛋白15.58%的溶解性更加優(yōu)異，而醇溶蛋白與谷蛋白的溶解性相比蓮子分離蛋白更差。這個結(jié)果與方菲菲[22]的研究結(jié)論有差異性，可能是因為選擇的蓮子品種不同。江西廣昌的“通芯白蓮”與福建的“建寧白蓮”氨基酸組成還存在較大差異。此外，課題組前期實驗表明[23]，雖然在蓮子分離蛋白中清蛋白含量占50%以上，但蓮子蛋白中疏水性氨基酸占比在35%左右，且其中谷氨酸含量最高。這也是蓮子蛋白溶解性較差的原因之一。蛋白質(zhì)溶解性也影響蛋白質(zhì)的其他功能特性，諸如乳化性與乳化穩(wěn)定性。由表1可知道蓮子蛋白的乳化性強弱依次為：分離蛋白＞清蛋白＞谷蛋白＞醇溶蛋白＞球蛋白，除分離蛋白外，蓮子分級蛋白相互間差異較小，乳化穩(wěn)定性幾乎無顯著差異（p＜0.05）。而分離蛋白、分級蛋白的溶解度與乳化性不同，可能是因為蛋白的理化特性與蛋白本身的物理特性相關，且受到蛋白中氨基酸殘基以及所帶電荷與分布狀況影響。蓮子分離蛋白中分子內(nèi)部疏水基團暴露，溶解性增強，提高了蛋白質(zhì)的乳化能力。而球蛋白分子空間結(jié)構(gòu)的作用力和化學鍵較弱，阻礙了油水界面上起到保護作用界面膜的形成，導致油滴表面的保護層變薄，小油滴逐漸聚集成大顆粒

[24]，從而引起乳化性和乳化穩(wěn)定性降低。

2.3 等電點、電位與粒徑

由圖1a可知，蓮子分離蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白的等電點分別為：4.9、4.8、5.0、4.8和4.9。張羽等[25]對“通芯白蓮”中蓮子蛋白進行研究，得到蓮子總蛋白的等電點為4.5；徐虹等[26]對蓮子紅皮蛋白進行研究，得到蛋白等電點為4.9；李向紅等[5]對“湘蓮”中蓮子蛋白與磨皮粉進行研究，得到蓮子蛋白質(zhì)的等電點為4.5；Zeng等[7]對“湘蓮”中蓮子分級蛋白進行了研究，發(fā)現(xiàn)等電點為4.9。這些實驗均表明，蓮子蛋白質(zhì)的等電點范圍在4.5～5.0之間，但由于品種或種質(zhì)資源不同，蓮子蛋白質(zhì)的等電點有一定區(qū)別。

圖1 不同蓮子蛋白電位、pH值與粒徑Fig.1 Potential, pH value and particle size of different lotus seed proteins

Zeta電位一般表示樣品在液體中表面所帶有的靜電荷的電位，是顆粒間相互排斥或吸引力強度的度量。由圖1a可知，蓮子清蛋白的Zeta電位絕對值最高，這可能與其結(jié)構(gòu)中含有較多的極性鍵有關[23]。結(jié)合d4,3、d3,2可以發(fā)現(xiàn)（表2），蓮子分離蛋白與清蛋白的粒度值分別為93.07 μm與75.47 μm，粒徑分布寬度基本一致，且均呈單峰分布（圖1b所示），說明蓮子蛋白顆粒大小集中且尺寸相近，更易形成穩(wěn)定體系。d4,3能夠體現(xiàn)粒度的均一性，而D50數(shù)據(jù)則表明顆粒的中位徑，說明有半數(shù)粒度小于或大于這個粒度標準，與d4,3結(jié)合可看出，D50與d4,3較一致，說明顆粒大小比較均一。結(jié)合溶解度數(shù)據(jù)（表1）可發(fā)現(xiàn)，清蛋白具有更高的溶解性。而球蛋白的粒徑呈未完全分開的多峰狀態(tài)（圖1b），說明粒度分布較大且分布不均勻，液滴為多分散性并且顆粒尺寸相差較大，處于一種不穩(wěn)定狀態(tài)（與圖1a中Zeta電位中電位絕對值低的結(jié)論一致）。溶液體系的穩(wěn)定性主要取決于顆粒的粒度和表面所帶電荷量，一般認為高電荷、小粒徑的溶液體系相對更穩(wěn)定。綜合上述分析發(fā)現(xiàn)，蓮子分離蛋白與清蛋白可能具有更好形成乳液的特性，因而表現(xiàn)出絕對值較高的電位、較小的粒徑，以及較好的溶解性與乳化性。

表2 不同蓮子蛋白粒徑分析（μm）Table 2 Particle size analysis of different lotus seed proteins (μm)

2.4 分子量與凝膠電泳

圖2 不同蓮子蛋白分子量Fig.2 Molecular weight of different lotus seed proteins

由圖2可見，蓮子蛋白主要集中在10～26、34～55和95～130 ku之間。譜帶數(shù)目和分子量完全相同，電泳條帶的強弱存在較大差異，區(qū)別在于其含量的高低。在95～130與10～20 ku的蛋白質(zhì)含量逐漸變少。在10～55 ku處，清蛋白、球蛋白與其他蛋白在含量上有所不同。而蓮子分離蛋白在95～130 ku處與醇溶蛋白、谷蛋白不同，這可能是因為其中含有多種蛋白，其氨基酸含量也存在差異性。由體積排阻色譜法可以按分子大小順序進行分離。蛋白（可溶性部分）的洗脫峰集中于9～12 min之間，保留時間6 min左右的吸收峰為蛋白質(zhì)聚集體，15 min后的吸收峰歸屬為解離出的小分子多肽[27]。蓮子分離蛋白的最大洗脫峰在9.58 min，峰面積約占85%，分子質(zhì)量約130 ku。說明分離蛋白主要以120～140 ku的聚合體形式存在，這與上述SDS-PAGE分析具有一致性。球蛋白的信號峰較弱，表明其含量很低，分子質(zhì)量對應為26～55 ku。谷蛋白的信號峰強度較強（與球蛋白相比），說明其含量較大，對應分子質(zhì)量約為10～26 ku。

這與張羽[26]在分離提取蓮子水溶、鹽溶、酸溶、堿溶蛋白得到的十幾種亞基基本相吻合，與唐佩華[3]研究的廣昌白蓮鹽溶球蛋白也有一致性。但不同的是，張羽[26]選用的莆田蓮子水溶性蛋白更多，而唐佩華[3]選用的廣昌白蓮則鹽溶性蛋白更多。蓮子小分子量的蛋白的減少，可能是由于巰基交聯(lián)形成二硫鍵，將小分子量蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榇蠓肿恿康鞍?。但由于大分子量蛋白與淀粉形成復合體，溶解性降低，不易被完整提取，因而大分子量的可溶性蛋白含量也降低。這與分子量的分析具有一致性。

2.5 表面疏水性指數(shù)（H0）、巰基（-SH）、二硫鍵（-S-S-）

蛋白質(zhì)的溶解性和表面疏水性顯著影響著蛋白質(zhì)其他功能性質(zhì)的發(fā)揮[28]。圖3a、3b中蓮子清蛋白的表面疏水性指數(shù)（H0）值與-S-S-含量最低，醇溶蛋白與谷蛋白的-S-S-值最高，谷蛋白的-SH與-S-S-分別為16.18 μmol/g和9.14 μmol/g，蓮子分離蛋白、清蛋白（球蛋白）中游離巰基含量最高。-S-S-的含量對蛋白質(zhì)的溶解性與疏水性有一定影響。蛋白乳化性的強弱與其空間結(jié)構(gòu)有關，表面疏水性高且電勢較低（圖3a），將使其更容易在溶液中或在界面處發(fā)生蛋白聚集[29,30]。因而蓮子分離蛋白與清蛋白的乳化性較好與表面疏水性低和電位低有關。蛋白表面的疏水性氨基酸較多，這容易引起溶液的絮凝沉淀，而液滴表面固體顆粒大小分布、極性、微觀形貌等因素均對溶液穩(wěn)定有影響[31]。因此球蛋白的粒徑呈未完全分開的多峰狀態(tài)（圖1b），可能也與表面疏水性有關（圖3a）。結(jié)合上述理化特性、電位、粒徑等分析可以發(fā)現(xiàn)，清蛋白與球蛋白的親水性更強，醇溶蛋白與谷蛋白的疏水性更強，而蓮子分離蛋白由于其構(gòu)成復雜，雖易溶于水，但相比清、球蛋白親水性更弱，相比醇溶、谷蛋白疏水性更弱。

圖3 （a）不同蓮子蛋白表面疏水性性指數(shù)（H0），（b）巰基與二硫鍵摩爾質(zhì)量濃度Fig.3 (a) Surface hydrophobicity index (H0), (b) Sulfhydryl and disulfide bond molar mass concentration

2.6 蛋白分子特性

2.6.1 熒光光譜

圖4 不同蓮子蛋白熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of different lotus seed proteins

熒光光譜用以研究蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化。由圖4可以看出，240～480 nm波長處的內(nèi)熒光掃描光譜可以用來表征色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）與苯丙氨酸（Phe）殘基周圍的微環(huán)境變化情況。谷蛋白中的色氨酸可在310 nm處激發(fā)產(chǎn)生熒光[32]。圖4中顯示熒光峰的位置在314 nm～321 nm之間，5種蛋白質(zhì)不同的熒光峰值與熒光強度說明蛋白質(zhì)中氫鍵連接、疏水相互作用形式不同。醇溶蛋白、谷蛋白相比蓮子分離蛋白波長紅移，內(nèi)部的色氨酸（Trp）殘基暴露更多，表面疏水性增加，因而熒光強度增強。然而，蓮子分離蛋白、清蛋白（球蛋白）的波長藍移，說明部分芳香殘基存始終處于更加疏水性的狀態(tài)[33]，鍵合的緊密度致使其不易展開側(cè)鏈，因而屏蔽了發(fā)射光，檢測不到色氨酸（Trp）的位點或降低了可檢測到的自發(fā)熒光。

2.6.2 紫外分光光度

由圖5可知，蛋白的最大紫外吸收波長在270～280 nm處。蛋白的紫外吸收主要是由于其蛋白內(nèi)的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）殘基所引起的。其紫外光的強弱說明蛋白質(zhì)中的酪氨酸更多的暴露于極性環(huán)境中，而色氨酸更多地趨向于埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部[33]。蛋白結(jié)構(gòu)逐步舒展開，發(fā)色基團與芳雜環(huán)疏水基團也更多向外暴露，從而引起紫外吸收的增加[34]。蓮子分離蛋白的最高紫外吸收峰出現(xiàn)在279 nm處，環(huán)境中的極性狀態(tài)發(fā)生改變而肽鏈上的Trp、Tyr殘基所帶的雜環(huán)π→π*電子躍遷是引發(fā)吸收峰出現(xiàn)的關鍵因素之一，蛋白肽鏈逐漸展開，π→π*和n→π*電子躍遷能量逐漸減小，因而會導致紫外吸收的相對減弱[35]。

圖5 不同蓮子蛋白紫外光譜Fig.5 UV spectra of different lotus seed proteins

2.6.3 圓二色光譜

圖6 不同蓮子蛋白圓二色光譜Fig.6 CD spectra of different lotus seed proteins

在CD光譜中，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的不同，所產(chǎn)生的圓二色譜譜帶位置、吸收強度也不相同。圖6中可以觀察到可溶性蛋白，在200～210 nm左右波長處有一個明顯的負峰，是典型的富含α-螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，屬于α-螺旋中肽鏈的π→π*躍遷，此結(jié)果與Ren[36]的研究一致。在208 nm左右波長處有不同峰形的變化，且峰位置發(fā)生不同偏移，說明蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)單元含量不同，這與紫外掃描結(jié)果一致，蛋白質(zhì)四種二級結(jié)構(gòu)的不同含量，表明蓮子蛋白中不同分級蛋白的空間結(jié)構(gòu)組成存在較大差異。

表3 不同蓮子蛋白二級結(jié)構(gòu)含量對比Table 3 Comparison of the secondary structure content of different lotus seed proteins

二級結(jié)構(gòu)實驗分析結(jié)果如上表3所示。清蛋白、球蛋白的負峰強度相對較弱，說明α-螺旋結(jié)構(gòu)含量少，β-折疊結(jié)構(gòu)含量多，β-折疊含量高會增加蛋白質(zhì)的柔韌性和擴展性，使分子結(jié)構(gòu)更具柔性化[37]。醇溶蛋白中β-折疊與轉(zhuǎn)角含量最大，其次為α-螺旋與無規(guī)則。Zeng等[7]對蓮子分級蛋白結(jié)構(gòu)研究表明，蓮子清蛋白和球蛋白的螺旋體在13%～16%，37%為折疊體，無規(guī)則卷曲僅占不到15%。α-螺旋中的氫鍵是維持其結(jié)構(gòu)的主要原因，一部分轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序結(jié)構(gòu)，導致更多疏水片段暴露于分子表面，溶解性提高。β-折疊比例增加的同時α-螺旋結(jié)構(gòu)也逐漸減小，結(jié)構(gòu)之間的相互轉(zhuǎn)化，便有結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)化[38]。α-螺旋相對含量低可能與蛋白分子間部分電荷發(fā)生中和反應有關，因而產(chǎn)生靜電作用，會影響氫鍵的穩(wěn)定性。β-折疊相對含量降低可表明蛋白質(zhì)疏水性增強。且β-折疊比α-螺旋結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，這可能是導致醇溶蛋白、谷蛋白溶解性與乳化性較低的原因之一。

3 結(jié)論

本研究制備并對比研究了5種不同蓮子蛋白的結(jié)構(gòu)及理化特性。其結(jié)果表明，蓮子中蛋白質(zhì)占總質(zhì)量的16.14%，五種蛋白的等電點均處于4.9左右。理化特性研究結(jié)果表明，溶解性最好的是清蛋白51.88%（溶解度為51.88%），乳化特性最好的是蓮子分離蛋白（乳化性與乳化穩(wěn)定性分別為82.35%、96.02%）。這些研究發(fā)現(xiàn)與其他研究存在種質(zhì)與品質(zhì)等差異性，因而導致理化特性有所不同。分離蛋白與清蛋白的Zeta電位絕對值較高，粒徑更小，單峰分布明顯，表明分離蛋白與清蛋白的粒度小，更容易形成穩(wěn)定體系。分子量研究結(jié)果表明，蓮子分離蛋白主要以120～140 ku的較大聚合體形式存在，清蛋白含有更多的羥基基團，醇溶蛋白、谷蛋白的二硫鍵含量較多。巰基氧化成二硫鍵可增強凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，疏水氨基酸的暴露可影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。溶解性和乳化性隨之增強，溶解度與乳化性變化趨勢一致。這些有關蓮子蛋白的研究結(jié)果與其他研究學者的研究具有一致性，但同樣也存在種質(zhì)資源不同的差異性。諸如有別于鹽溶性蛋白較多的廣昌白蓮、水溶性蛋白較多的莆田蓮和其他湘蓮等。光譜分析表明，與醇溶蛋白和谷蛋白相比，清蛋白和球蛋白的熒光強度更弱，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量少，β-折疊結(jié)構(gòu)含量多，反映其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有高度的柔韌性與擴展性。通過分析不同蓮子蛋白理化特性與多尺度結(jié)構(gòu)，以期為蓮子蛋白類的應用研究提供理論參考。