枸杞環(huán)肽調(diào)控NLRP3及NF-κB信號(hào)通路減輕BaP誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞炎性損傷

趙傳欣，李葉婷，卜凡莉，鄭曼

（東營市人民醫(yī)院，山東東營 257091）

苯并芘（Benzopyrene，BaP）是重要的大氣污染物，化石燃料的燃燒及燒烤、油炸過程會(huì)產(chǎn)生大量的苯并芘[1]。苯并芘吸入或皮膚接觸會(huì)導(dǎo)致機(jī)體DNA損傷，造成呼吸系統(tǒng)及皮膚炎癥，持續(xù)大量苯并芘暴露會(huì)導(dǎo)致肺癌[2]、皮膚癌[3]等疾病。

炎癥是機(jī)體對(duì)外界刺激的一種防御反應(yīng)，大多數(shù)情況下是有益的，但當(dāng)炎癥朝著不受控制的情況發(fā)展就會(huì)損害機(jī)體健康[4]。支氣管炎是一種常見的氣道炎癥，臨床表現(xiàn)以咳嗽為主，常伴有咽痛、鼻塞等癥狀，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成很大影響[5]。同時(shí)，慢性支氣管炎還有可能發(fā)展成為慢性阻塞性肺疾病[6]、肺源性心臟病[7]等，嚴(yán)重危害患者的身體健康。研究發(fā)現(xiàn)，苯并芘暴露會(huì)誘發(fā)或加重支氣管炎、慢性支氣管炎及慢性阻塞性肺疾病等疾病[8]，但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于支氣管炎等相關(guān)呼吸道疾病尚未有良好對(duì)策。

枸杞是茄科枸杞屬植物，廣泛分布于亞、歐及北美干旱和半干旱地區(qū)[9]。在中國，枸杞作為藥物使用的歷史可追溯到2300年前，人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ姷蔫坭阶佣嗍怯蓪幭蔫坭降墓麑?shí)制成[10]。《本草綱目》記載，枸杞子能夠補(bǔ)肝明目；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，枸杞含有多種多糖、類胡蘿卜素、類黃酮、生物堿等活性物質(zhì)[11]，具有抗炎[12,13]、免疫調(diào)節(jié)[14]、抗氧化[15]等活性。人們前期的研究主要集中在枸杞中的多糖類物質(zhì)，同樣具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血壓等功能的糖肽、ACE抑制肽等肽類物質(zhì)很容易被忽視[16,17]，而針對(duì)枸杞環(huán)肽能否抑制BaP導(dǎo)致的氣道上皮細(xì)胞損傷的活性及機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建BaP暴露氣道上皮細(xì)胞模型并通過活性追蹤方法分離枸杞活性肽，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究其潛在的活性及機(jī)制，以期為枸杞活性肽類物質(zhì)的研究奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人支氣管上皮16-HBE細(xì)胞，中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；苯并芘，阿拉丁試劑有限公司；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清-FBS和青霉素-鏈霉素混合液，美國Gbico；BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；Human PGE2Elisa Kit、一氧化氮（NO）含量檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；Human IL-1β（白細(xì)胞介素-1β）和Human TNF-α（腫瘤壞死因子-α）ELISA試劑盒，北京四正柏生物科技有限公司；IκB、p-IκB、p65、p-p65、NLRP3、ASC、COX-2和iNOS的一抗抗體，美國CST。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IC超凈工作臺(tái)，蘇州；INCO2108 CO2培養(yǎng)箱，德國Memmert；2K15低溫高速離心機(jī)，美國Sigma公司；Waters R2487高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），美國沃特世；液質(zhì)聯(lián)用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC/MS），美國Agilent Technologies；組織勻漿器，Ultra-Turrax；IKALabortechnik，德國Staufen；Epics Altra型流式細(xì)胞儀，美國Beckman；3-30 K高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞活性肽的分離、鑒定

1.3.1.1 枸杞粗蛋白制備

將干枸杞（1.0 kg）勻漿與異丙醇按1:5（m/V）的比例混合，斷攪拌2 h。收集沉積物，冷凍干燥并儲(chǔ)存在-80 ℃。脫脂沉淀物（205 g）溶解在0.25 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH值7.3）中（10%，m/V）。離心（9 000g，12 min），上清液凍干，作為枸杞總蛋白。

1.3.1.2 超濾、疏水層析

超濾色譜法：采用分子量為1 ku的超濾膜對(duì)枸杞總蛋白進(jìn)行超濾分離。收集LBP-A（Mw＜1 ku）和LBP-B（Mw＞1 ku）兩個(gè)組分，冷凍干燥。評(píng)價(jià)LBP-A和LBP-B對(duì)BaP暴露的16-HBE細(xì)胞的保護(hù)活性，收集具有最佳保護(hù)活性部分。

1.3.1.3 疏水色譜法

將LBP-A（27.3 g）溶解于用30 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH值7.3）制備的1.60 mol/L (NH4)2SO4中。苯基Sepharose CL-4B疏水色譜柱（3.0 cm×100 cm），30 mm磷酸鹽緩沖液（pH值7.3）2.5 mL/min的流速梯度[1.60、0.80和0 mol/L (NH4)2SO4]洗脫。300 nm監(jiān)測(cè)，收集10個(gè)組分（LBP-A-1～10，每個(gè)組分500 mL），并將組分進(jìn)行冷凍干燥。評(píng)價(jià)LBP-A-1～10對(duì)BaP暴露的16-HBE細(xì)胞的保護(hù)活性，收集具有最佳保護(hù)活性部分。

1.3.1.4 陰離子交換色譜法

將LBP-A-4溶液（3 mL，2.27 g/mL）上樣于DEAE-52纖維素陰離子交換柱（Sigma-Aldrich，上海，3.0 cm×100 cm），去離子水預(yù)平衡。2.0 mL/min的流量，0、0.20、0.40和0.80 mol/L (NH4)2SO4溶液梯度洗脫。300 nm監(jiān)測(cè)，收集10個(gè)組分（LBP-A-4-1～10，每個(gè)組分500 mL），并將組分進(jìn)行冷凍干燥。評(píng)價(jià)LBP-A-4-1～10對(duì)BaP誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞的保護(hù)活性，收集具有最佳保護(hù)活性部分。

1.3.1.5 凝膠過濾色譜法

LBP-A-4-4溶液（1.5 mL，366 mg/mL）上樣于Sephadex G-15柱（Sigma-Aldrich，上海，3.0 cm×100 cm），2.0 mL/min的流量用0.40 mol/L (NH4)2SO4溶液洗脫。300 nm監(jiān)測(cè)，收集10個(gè)組分（LBP-A-4-4-1～10，每個(gè)組分300 mL），并將組分進(jìn)行冷凍干燥。評(píng)價(jià)LBP-A-4-4-1～10對(duì)BaP暴露的16-HBE細(xì)胞的保護(hù)活性，收集具有最佳保護(hù)活性部分。

1.3.1.6 RP-HPLC法

LBP-A-4-4-1通過RP-HPLC（Agilent 1200 HPLC）分析制備，Zorbax，SB C-18柱（4.6×250 mm，5 μm）。洗脫溶劑體系為水-三氟乙酸（溶劑A；100:0.1，V/V）和乙腈-三氟乙酸（溶劑B；100:0.1，V/V）。以2.0 mL/min的流量從30%到60%的溶劑B梯度洗脫60 min，檢測(cè)波長設(shè)置為300 nm。將分離得到的化合物組分進(jìn)行冷凍干燥，最終分離獲得兩個(gè)枸杞肽類活性化合物枸杞活性肽-1（LBP-1）及枸杞活性肽-2（LBP-2）。

1.3.1.7 LBP-1～2的分子量測(cè)定及氨基酸序列分析

SCIEX500R Q-TOF質(zhì)譜儀（Framingham，美國）進(jìn)行HPLC-ESI-MS分析。質(zhì)譜條件：ESI源質(zhì)量范圍設(shè)為m/z50～1 500，以正離子模式采集Q-TOF-MS數(shù)據(jù)。MS分析條件為：CAD氣體流量7 L/min；干燥氣體溫度，550 ℃；離子噴涂電壓，5 500 V；去聚電位，80 V。軟件生成的數(shù)據(jù)文件：SCIEX OS 1.0。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%的FBS、1%的青霉素-鏈霉素混合液和89%的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合后配置成DMEN完全培養(yǎng)基用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；將16-HBE細(xì)胞接種于含有DMEM完全培養(yǎng)基的T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，隔日換液；待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期后即可以1:3的比例進(jìn)行傳代或收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

將16-HBE細(xì)胞密度調(diào)整為每毫升1×105個(gè)細(xì)胞，于96孔板中每孔接種100 μL，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。分為4組，每組6個(gè)復(fù)孔，第1組細(xì)胞不做任何處理，第2～4組的細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的LBP-1、LBP-2，培養(yǎng)箱中孵育48 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，溫育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度，檢測(cè)LBP-1、LBP-2的細(xì)胞毒性。

將16-HBE細(xì)胞密度調(diào)整為每毫升1×105個(gè)細(xì)胞，于96孔板中每孔接種100 μL，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分為4組，每組6個(gè)復(fù)孔，第1組細(xì)胞不做任何處理，第2～4組加入終濃度為10 μmol/L的BaP，孵育12 h后，第3、4組分別加入終濃度為10 μmol/L的LBP-1及LBP-2，培養(yǎng)箱中孵育12 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL，溫育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度，評(píng)價(jià)LBP-1、LBP-2的保護(hù)活性。

1.3.4 ELISA檢測(cè)16-HBE細(xì)胞炎癥因子分泌

將16-HBE細(xì)胞密度調(diào)整為每毫升1×105個(gè)細(xì)胞，于24孔板中每孔接種1 mL，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分為4組：①空白對(duì)照組（Control），②B aP 組（BaP），③10 μmol/L LBP-1組，④50 μmol/L LBP-1組，每組3個(gè)復(fù)孔。①不做任何處理，②③④加入終濃度為10 μmol/L的BaP，孵育12 h后，③加入終濃度為10 μmol/L的LBP-1，④加入終濃度為50 μmol/L的LBP-1。再次孵育12 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，1 400 r/min離心5 min，收集上清液。參照IL-1β、TNF-α、NO和PGE2的ELISA試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎癥因子含量。

1.3.5 Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

將16-HBE細(xì)胞密度調(diào)整為每毫升3×105個(gè)細(xì)胞，于6孔板中每孔接種3 mL，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照方法1.3.4分組處理，收集細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。參考文獻(xiàn)方法，Western Blotting檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路及NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對(duì)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對(duì)LBP-1處理效應(yīng)進(jìn)行回歸分析。p＜0.05表明具有顯著差異，p＜0.01表明具有極顯著差異，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞環(huán)肽的分離鑒定

LBP-1：白色粉末，m/z564.245 0離子是[M+H]+，確定分子式為C29H33N5O7；m/z546.234 3離子是[M-H2O+H]+；m/z463.197 7離子是[M-Thr+H2O+H]+；m/z435.200 6離子是[M-Glu+H2O+H]+；m/z417.183 3離子是[M-Phe+H2O+H]+；m/z378.166 0離子是[M-Trp+H2O+H]+；m/z316.129 0離子是[Glu-Trp-H2O+H]+；m/z288.134 4離子是[Thr+Trp-H2O+H]+；m/z249.123 0離子是[Phe-Thr-H2O+H]+；m/z187.086 5離子是[Trp-H2O+H]+；m/z159.091 5離子是[Trp-COOH+H]+；m/z102.055 4離子是[Glu-COOH+H]+；m/z74.061 9離子是[Thr-COOH+H]+；最終，確認(rèn)LBP-1是環(huán)-(Trp-Glu-Phe-Thr)肽。

LBP-2：白色粉末，m/z497.284 3離子是[M+H]+，確定分子式為C26H36N6O4；m/z469.289 7離子是[M-CO+H]+；m/z398.216 4離子是[M-Val+H2O+H]+；m/z384.201 2離子是[M-Leu+H2O+H]+；m/z380.205 3離子是[M-Val+H]+；m/z350.216 8離子是[M-Phe+H2O+H]+；m/z285.132 5離子是[His-Phe-2H2O+H]+；m/z261.158 2離子是[Leu-Phe-2H2O+H]+；m/z237.133 2離子是[His-Val-2H2O+H]+；m/z212.116 9離子是[Val-Leu-2H2O+H]+；m/z138.065 6離 子 是[His-H2O+H]+；m/z110.070 8離子是[His-COOH+H]+；m/z86.097 5離子是[Leu-COOH+H]+；最終，確認(rèn)LBP-2是環(huán)-(Leu-Val-His-Phe)肽。

2.2 LBPs對(duì)16-HBE細(xì)胞的保護(hù)作用

圖2 LBP-1、LBP-2的細(xì)胞毒性及對(duì)16-HBE細(xì)胞的保護(hù)活性Fig.2 Cytotoxicity of LBP-1 and LBP-2 and their protective activity on 16-HBE cells

本研究檢測(cè)了LBP-1、LBP-2的細(xì)胞毒性。結(jié)果如圖2a，LBP-1、LBP-2的濃度低于1.0 mmol/L時(shí)，16-HBE細(xì)胞活力與空白對(duì)照組相比均無顯著差異（p＞0.05）。表明，LBP-1、LBP-2的濃度低于1.0 mmol/L時(shí)，無顯著細(xì)胞毒性，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)將LBP-1、LBP-2的濃度設(shè)置為低于1.0 mmol/L。

由圖2b可知，相比于空白對(duì)照組，經(jīng)10 μmol/L的BaP處理12 h后，16-HBE細(xì)胞的活力降低24.84%（p＜0.01）；而經(jīng)LBP-1及LBP-2處理12 h后，BaP暴露導(dǎo)致的16-HBE細(xì)胞活力降低被顯著抑制。相比于BaP組，LBP-1、LBP-2組細(xì)胞活力分別提高了17.83%（p＜0.01）及12.78%（p＜0.05）?？紤]到LBP-1的保護(hù)活性比LBP-2更佳，因此選擇LBP-1進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 LBP-1抑制BaP誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞炎癥因子分泌

圖3 LBP-1對(duì)BaP誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞炎癥因子分泌的影響Fig.3 Effect of LBP-1 on the secretion of inflammatory factors in 16-HBE cells induced by BaP

促炎因子是一類由機(jī)體的免疫和非免疫細(xì)胞合成和分泌的小分子多肽類物質(zhì)，它們調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理功能，并在創(chuàng)傷、疼痛、感染等應(yīng)激過程中起重要作用。促炎性細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等[14]。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌，以應(yīng)對(duì)感染或其他外界刺激引起的細(xì)胞損傷[15]，同時(shí)它也可由如上皮細(xì)胞等許多其他類型的細(xì)胞和組織分泌[18]；IL-1β與TNF-α類似，是一種促炎細(xì)胞因子[19]。本研究中，BaP暴露使16-HBE細(xì)胞IL-1β與TNF-α分泌顯著增加，而LBP-1干預(yù)后，BaP誘導(dǎo)的IL-1β與TNF-α過量分泌被顯著抑制。

BaP會(huì)導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[20]，結(jié)果如圖3所示，BaP暴露會(huì)誘發(fā)16-HBE細(xì)胞炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-6）的過量分泌。相比于空白對(duì)照組，BaP暴露使16-HBE細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-18和IL-6炎性細(xì)胞因子分泌分別增加了556.15%（p＜0.01）、690.72%（p＜0.01）、476.53%（p＜0.01）和286.45%（p＜0.01）。表明，BaP暴露會(huì)造成16-HBE細(xì)胞炎性損傷，并誘發(fā)炎癥因子大量分泌。研究表明，多種生物活性肽具有抑制炎癥的功能[21]，本研究中，50 μmol/L的LBP-1處理后，相比于BaP組，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β的質(zhì)量濃度分別降低了34.93%（p＜0.05）及27.41%（p＜0.05）；IL-18和IL-6的質(zhì)量濃度降低了31.05%（p＜0.05）、35.28%（p＜0.02）。本文推測(cè)，BaP暴露造成的16-HBE細(xì)胞炎性損傷被LBP-1顯著減輕。

2.4 LBP-1對(duì)16-HBE細(xì)胞PGE2、NO分泌及COX-2、iNOS表達(dá)的影響

iNOS在細(xì)胞中通常不表達(dá)，但會(huì)響應(yīng)細(xì)胞的炎癥刺激（如細(xì)胞因子）而產(chǎn)生，一旦表達(dá)就會(huì)產(chǎn)生高水平的NO，而高水平的NO則會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，對(duì)炎癥和宿主免疫產(chǎn)生持久影響[22]；花生四烯酸從生物膜中釋放出來后，被迅速氧化成不穩(wěn)定的PGG2，隨后被還原為PGH2，這兩個(gè)過程均由COX-2催化，隨后，PGH2會(huì)被一組末端合成酶迅速轉(zhuǎn)化為PGE2[23]，而COX-2在許多組織中可通過促炎因子誘導(dǎo)高表達(dá)，從而產(chǎn)生大量的PGE2[24]，同時(shí)PGE2在炎癥的初期會(huì)促進(jìn)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞從血流中流入組織，導(dǎo)致感染或組織損傷部位腫脹和水腫，從而促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展[25]。本研究中，BaP暴露使16-HBE細(xì)胞iNOS與COX-2表達(dá)顯著增加，同時(shí)，NO及PGE2含量顯著升高。而LBP-1干預(yù)后，BaP誘導(dǎo)的iNOS與COX-2高表達(dá)及NO、PGE2過量分泌被顯著抑制。提示LBP-1具有預(yù)防BaP暴露所致的氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而緩解和改善細(xì)胞活力減弱細(xì)胞損傷。

圖4 LBP-1對(duì)BaP誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞NO、PGE2分泌及iNOS、COX-2表達(dá)的影響Fig.4 Effects of LBP-1 on the secretion of NO and PGE2 and the expression of iNOS and COX-2 in 16-HBE cells induced by BaP

結(jié)果如圖4a、4b所示，BaP暴露會(huì)誘發(fā)16-HBE細(xì)胞NO、PGE2的過量分泌。相比于空白對(duì)照組，BaP暴露使16-HBE細(xì)胞NO、PGE2分泌分別增加475.34%（p＜0.01）、414.77%（p＜0.01）。而50 μmol/L的LBP-1處理后，相比于BaP組，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO、PGE2的濃度分別降低了51.15%（p＜0.01）及27.46%（p＜0.01）。COX-2及iNOS是細(xì)胞合成PGE2和NO的關(guān)鍵酶，BaP誘導(dǎo)的PGE2和NO過量分泌被LBP-1顯著抑制。從海馬中純化出的一種生物活性肽可以抑制iNOS和COX-2的表達(dá)，從而抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥[26]，BaP及LBP-1對(duì)COX-2和iNOS表達(dá)的影響的結(jié)果如圖4c、4d所示，BaP暴露使16-HBE細(xì)胞中iNOS和COX-2表達(dá)顯著升高。10 μmol/L LBP-1處理后，16-HBE細(xì)胞iNOS及COX-2的表達(dá)量有所下降，但不具有顯著性差異。而50 μmol/L LBP-1處理后，16-HBE細(xì)胞iNOS及COX-2的表達(dá)顯著下降。相比于BaP組，50μmol/L LBP-1組iNOS及COX-2表達(dá)降低81.72%（p＜0.01）和41.70%（p＜0.05）。LBP-1可通過抑制BaP誘導(dǎo)的COX-2及iNOS的表達(dá)進(jìn)而抑制PGE2及NO的過量分泌。

2.5 LBP-1抑制BaP誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞NLRP3和NF-κB信號(hào)通路激活

圖5 LBP-1對(duì)BaP暴露誘導(dǎo)16-HBE細(xì)胞NF-κB、NLRP3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響Fig.5 Effect of LBP-1 on the expression of NF-κB and NLRP3 signaling pathway related proteins in 16-HBE cells induced by BaP exposure

核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）是細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通常以p50-p65異二聚體的形式與其抑制性蛋白（inhibitorκB，IKB）結(jié)合而呈非活化狀態(tài)；NF-κB通過刺激因子（腫瘤壞死因子、淋巴毒素、環(huán)境污染物等）的活化進(jìn)而誘導(dǎo)多種基因的表達(dá)，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)[27]。因此，NF-κB信號(hào)通路是經(jīng)典的炎癥通路，也是抗炎藥物的經(jīng)典靶點(diǎn)。NLRP3也叫NOD樣受體蛋白3，屬于炎性復(fù)合體的傳感蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到感染刺激時(shí)，被激活的NLRP3形成NLRP3炎性小體，在炎性小體的作用下，促進(jìn)下游炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的釋放從而引起炎癥反應(yīng)[28]。

因此本文檢測(cè)了LBP-1對(duì)BaP暴露誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞NF-κB和NLRP3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響。Bap可通過激活NF-κB信號(hào)通路從而導(dǎo)致炎癥[20]，如圖5a、5b和5c、5d所示，BaP暴露會(huì)使IκBα和p65表達(dá)降低，誘導(dǎo)IκBα和p65磷酸化；與此同時(shí)，BaP暴露使NLRP3及ASC表達(dá)顯著增高。說明，BaP暴露激活了NF-κB和NLRP3信號(hào)通路?；钚噪囊部赏ㄟ^NF-κB信號(hào)通路抑制炎癥[26]，本研究中50 μmol/L的LBP-1處理16-HBE細(xì)胞后，BaP暴露導(dǎo)致的NF-κB和NLRP3信號(hào)通路激活被顯著抑制。IκBα和p65表達(dá)升高，IκBα和p65磷酸化水平降低，NLRP3及ASC表達(dá)也被顯著抑制。通過結(jié)果推測(cè)，LBP-1可通過抑制NF-κB和NLRP3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制BaP暴露導(dǎo)致的16-HBE細(xì)胞NF-κB和NLRP3信號(hào)通路激活，進(jìn)而發(fā)揮抗炎活性。

3 結(jié)論

多環(huán)芳烴化合物（PAHs）及其衍生物已經(jīng)被證明在環(huán)境污染所引起的癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用。苯并芘及其代謝產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)生物有機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而表現(xiàn)出較強(qiáng)的致癌性，在慢性肺炎及肺部腫瘤的形成過程中發(fā)揮重要作用。本研究構(gòu)建BaP誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞損傷模型，通過活性追蹤方式從枸杞中分離獲得具有保護(hù)活性的環(huán)肽類化合物。發(fā)現(xiàn)枸杞環(huán)肽-1（LBP-1，環(huán)-(Trp-Glu-Phe-Thr)肽）能夠顯著抑制BaP暴露導(dǎo)致的細(xì)胞活力降低，進(jìn)一步的研究顯示LBP-1能夠抑制BaP暴露誘發(fā)的炎性細(xì)胞因子分泌，抑制IκBα磷酸化及ASC高表達(dá)。本文推測(cè)LBP-1抗BaP誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞炎癥損傷可能是通過抑制BaP暴露誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子分泌及介導(dǎo)的NF-κB/NLRP3信號(hào)通路激活有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)BaP暴露會(huì)激活NF-κB信號(hào)通路，同時(shí)NLRP3炎癥小體的NLRP3及ASC蛋白表達(dá)增加，而LBP-1處理后，BaP暴露誘導(dǎo)的p65與IκBα磷酸化及NLRP3炎癥小體激活收到顯著抑制。說明，LBP-1可通過調(diào)控NLRP3及NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)揮抗BaP誘發(fā)的氣道上皮細(xì)胞炎性損傷?？傊?，LBP-1可通過抑制BaP誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞NF-κB/NLRP3信號(hào)通路激活及iNOS、COX-2酶活性從而抑制炎癥因子IL-1β、NO等的釋放，進(jìn)而有效抑制炎癥反應(yīng)。本研究為將為新型活性枸杞活性肽的開發(fā)及抗環(huán)境污染物多環(huán)芳烴誘導(dǎo)的呼吸道損傷藥物研發(fā)提供新的研究思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。