基于MLPA技術(shù)篩選帕金森病遺傳相關(guān)基因及其與中醫(yī)證型分布的關(guān)系和臨床診斷價值

施宗生 劉大同 孫培養(yǎng)

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是中老年人群中常見的一種神經(jīng)退行性變性疾病，主要的臨床表現(xiàn)為運動遲緩、靜止性震顫、姿勢步態(tài)障礙、肌強直等，同時常伴有抑郁、睡眠障礙、便秘等癥狀［1］。在中醫(yī)理論中，PD 屬于“顫證”的范疇［2］。據(jù)統(tǒng)計，PD 全球流行率約占總?cè)丝诘?.3%。60 歲以上發(fā)病率約為1%，并隨著年齡的增長而急劇增加，其中80 歲以上者占3%［3］。然而，目前對于PD的診斷標(biāo)準(zhǔn)仍然只有基于運動癥狀的鑒定，但是在長時間發(fā)生神經(jīng)退行性病變時，臨床的診斷受到個體發(fā)病特征及疾病嚴(yán)重程度不同的影響，造成診斷結(jié)果出現(xiàn)差異［4］，因此體液生物標(biāo)志物在臨床確診PD 具有重要意義?；驒z測可以明確病因，有助于診斷和鑒別診斷PD。PARKIN基因和α-突觸核蛋白（α-Synuclein，SNCA）基因等須應(yīng)用多重連接探針擴增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）和其他技術(shù)來完成基因拷貝數(shù)檢測［5］。本研究對106 例PD 患者進(jìn)行MLPA 檢測，篩選相關(guān)遺傳基因，并對其與中醫(yī)證型分布的關(guān)系與其診斷效能進(jìn)行分析。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2021年12月廬江縣中醫(yī)院確診的106 例PD 患者作為研究對象，記為PD組，同時選取同期年齡、性別等與PD 組相匹配的體檢健康志愿者50 名作為對照組。PD 組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《帕金森病抑郁中西醫(yī)結(jié)合診斷與治療專家共識（2021年版）》［6］中關(guān)于帕金森病者診斷標(biāo)準(zhǔn)，并確診；②年齡≥18 歲；③患者本人或家屬均對本研究知情同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有嚴(yán)重的肝、腎等器官功能障礙；②免疫功能障礙、缺陷等；③伴有嚴(yán)重的貧血、營養(yǎng)不良等；④存在顱外傷史、腦血管病史；⑤合并精神疾病等。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：為自愿者，無PD 家族史、無PD 癥狀。PD 組男76 例，女30 例，年齡47～81 歲，平均年齡（61.47±8.63）歲，病程1～9年，平均（5.14±2.22）年，合并疾?。焊哐獕?6 例、糖尿病13例，高血脂7 例。對照組男29 名，女21 名，年齡41～80 歲，平均年齡（62.44±3.14）歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具可比性，本研究已通過本院倫理委員會批注。

1.2 方法

抽取所有受試者外周靜脈血2～3 mL，送至杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司，采用MLPA 技術(shù)對帕金森相關(guān)基因包括SNCA、PARKIN、PINK1、PARK7、UCHLL、LRRK2、GCH1、ATP13A2基因等各外顯子是否存在變異。根據(jù)結(jié)果，采用熒光定量（qRT）-PCR 對相應(yīng)的mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平，及相關(guān)基因與中醫(yī)證型分布的關(guān)系，并繪制ROC 曲線檢驗其對帕金森的臨床診斷效能。

中醫(yī)癥候診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《中醫(yī)老年顫證診斷和療效評定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》［7］中的證型分類標(biāo)準(zhǔn)，配合應(yīng)用中醫(yī)四診，可將PD 分為痰熱動風(fēng)證、血瘀動風(fēng)證、氣血兩虛證、肝腎不足證和陰陽兩虛證。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用n（%）表示，組間比較用χ2檢驗；繪制ROC曲線檢驗診斷效能；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MLPA 技術(shù)帕金森病遺傳相關(guān)基因篩選結(jié)果

納入106 例PD 患者，通過MLPA 技術(shù)檢出36例（33.96%）PARKIN基因3 號、4 號外顯子缺失突變，14 例（13.21%）ARKIN基因2 號外顯子點突變，67 例（63.21%）α-突觸核蛋白（SNCA）基因1 號外顯子重復(fù)突變，其中15 例（14.15%）患者未檢出明確致病位點。

2.2 PARKIN、SNCA 基因突變情況及其與中醫(yī)證型分布的關(guān)系

PD 患者不同的基因突變在證型的分布上差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），PARKIN基因突變以肝腎不足證為主，占50.00%；而SNCA基因突變以血瘀動風(fēng)證為主，占52.24%。見表1。

表1 PARKIN、SNCA 基因突變情況及其與中醫(yī)證型分布的關(guān)系［n（%）］Table 1 PARKIN and SNCA gene mutations and their relationship with TCM syndrome type distribution［n（%）］

2.3 兩組PARKIN、SNCA mRNA 表達(dá)水平比較

PD 組外周靜脈血PARKINmRNA 表達(dá)水平低于對照組、SNCAmRNA 表達(dá)水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組PARKIN、SNCA mRNA 表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of PARKIN and SNCA mRNA expression levels between the two groups（±s）

表2 兩組PARKIN、SNCA mRNA 表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of PARKIN and SNCA mRNA expression levels between the two groups（±s）

組別PD 組對照組t 值P 值n 106 50 PARKIN mRNA 0.91±0.11 1.02±0.16 5.007 0.000 SNCA mRNA 1.00±0.15 0.86±0.09 5.781 0.000

2.4 PARKIN、SNCA mRNA 表達(dá)對PD 的臨床診斷價值

繪制PARKIN、SNCAmRNA 診斷PD 的ROC曲線，結(jié)果如下，PARKIN、SNCAmRNA 及兩針聯(lián)合對PD 診斷ROC 曲線下面積（AUC）分別為0.727、0.859、0905（P均＜0.05），敏感度分別為0.745、0.632、0.745，特異性分別為0.700、0.920、0.900；兩者聯(lián)合診斷效能優(yōu)于PARKIN或SNCAmRNA 單項診斷。見表3、圖1。

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curve

表3 PARKIN、SNCA mRNA 診斷PD 的ROC 曲線結(jié)果Table 3 ROC curve results of PARKIN and SNCA mRNA for PD diagnosis

3 討論

本研究中，依據(jù)相關(guān)評定標(biāo)準(zhǔn)并配合應(yīng)用中醫(yī)四診，將PD 分為痰熱動風(fēng)證、血瘀動風(fēng)證、氣血兩虛證、肝腎不足證和陰陽兩虛證。本研究采用MLPA 技術(shù)對PD 遺傳基因進(jìn)行篩選，并分析其與中醫(yī)證型分布的關(guān)系和臨床診斷價值，為臨床的診斷與治療提供參考。

MLPA 技術(shù)檢測結(jié)果顯示，納入106 例PD 患者中檢出36 例（33.96%）PARKIN基因3 號、4 號外顯子缺失突變，14 例（13.21%），PARKIN基因2 號外顯子點突變，67 例（63.21%）α-突觸核蛋白（SNCA）基因1 號外顯子重復(fù)突變，其中15 例（14.15%）患者未檢出明確致病位點。根據(jù)相關(guān)研究報道，PD 的病理改變，可能是由SNCA 蛋白聚集小體造成的，SNCA 蛋白的分解代謝受損促進(jìn)了其有毒低聚物的形成，而SNCA基因則被認(rèn)為是PD 的一個致病基因［8］。SNCA基因的基因突變，及其多態(tài)性可能使SNCA 蛋白個過高表達(dá)，造成α-sunuclein 蛋白的異常聚集，從而導(dǎo)致患者神經(jīng)功能障礙和神經(jīng)元死亡［9］。有研究發(fā)現(xiàn)線粒體質(zhì)量控制過程被確定為PD 關(guān)鍵參與者，PARKIN基因的缺失突變導(dǎo)致通過稱為線粒體自噬對功能失調(diào)的線粒體去除不足［10］。同時有研究通過體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗，PARKIN 蛋白可通過抑制線粒體的凋亡，降低α-sunuclein 蛋白表達(dá)，從而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用，降低PD 的發(fā)生［11］。同時，本研究對患者外周血中PARKIN與SNCAmRNA 表達(dá)水平進(jìn)行檢查，結(jié)果顯示，PD 患者中PARKINmRNA表達(dá)水平顯著降低、SNCAmRNA 表達(dá)水平顯著升高，結(jié)果與研究［12］一致。

PD 在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論中歸于“顫證”、“震顫”等范疇，于近現(xiàn)代，在中醫(yī)經(jīng)典的基礎(chǔ)上，一些豐富經(jīng)驗的中醫(yī)結(jié)合多年臨床經(jīng)驗，總結(jié)了顫證的病因、病機，劉翠芳等［13］總結(jié)為肝腎不足、氣血虧虛、血瘀等；許玉珉等［14］認(rèn)為顫證病機在腎虛兼血瘀。本研究對PARKIN基因、SNCA基因的突變情況與PD 中醫(yī)證型分布關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PD 患者不同的基因突變在證型的總體分布上存在差異，PARKIN基因突變以肝腎不足證為主，占50.00%；而SNCA基因突變以血瘀動風(fēng)證為主，占52.24%。有研究表明，PARKIN可激活線粒體的自噬，而PARKIN基因缺失，PARKIN 蛋白表達(dá)降低，線粒體受損、細(xì)胞凋亡增加，造成肝腎功能損傷［15］。PD 中SNCA基因的重復(fù)突變，導(dǎo)致α-sunuclein 蛋白異常聚集從而引起神經(jīng)系統(tǒng)變性，其宏觀表現(xiàn)為血瘀等病理產(chǎn)物的形成［16］。同時本研究對PARKINmRNA 與SNCAmRNA 表達(dá)水平對PD 臨床診斷效能進(jìn)行分析，結(jié)果表明，二者均具有良好的診斷效能，而兩者聯(lián)合診斷價值更高。然而，經(jīng)過研究表明，PARKIN基因的突變多出現(xiàn)在早發(fā)型PD 中，且隨著年齡的增長，該基因位點突變率對著降低。因此仍需擴大樣本量，對不同地區(qū)、環(huán)境的患者，增加相關(guān)基因的檢測，旨在得到更客觀、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

綜上所述，PD 患者PARKIN基因、SNCA基因存在突變，且其與中醫(yī)證型分布存在密切關(guān)系，繪制ROC 曲線分析，PARKINmRNA 與SNCAmRNA表達(dá)水平對PD 具有一定的臨床診斷價值，為PD的前期診斷及治療提供參考。