基于核酸適配體的比色傳感策略用于牛奶中沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)

張倩雯，陶 晴，趙婷婷，張 彤，顏 娟,2,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306）

食品安全是遍及世界的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，其中由微生物導(dǎo)致的細(xì)菌感染事件是引發(fā)食品安全問(wèn)題的最主要原因，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，沙門(mén)氏菌感染主要來(lái)源于動(dòng)物食品，如肉類(lèi)、家禽、蛋類(lèi)和乳制品，常見(jiàn)的傳播路徑是被人類(lèi)糞便污染的綠色蔬菜或餐飲服務(wù)中受污染的食物。目前發(fā)現(xiàn)的近1 000 種沙門(mén)氏菌菌株，根據(jù)其抗原成分可分為甲、乙、丙、丁、戊等，其中鼠傷寒沙門(mén)氏菌（）是臨床上最常見(jiàn)的食源性致病菌，其引起的沙門(mén)氏菌病是世界各地一種主要的食源性細(xì)菌胃腸炎感染，伴隨的中毒癥狀主要有惡心、嘔吐、腹痛、頭痛、畏寒和腹瀉等，不僅對(duì)人體健康造成了危害，也是食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、疾病預(yù)防的巨大威脅。因此，對(duì)沙門(mén)氏菌的監(jiān)測(cè)具有重要的公共衛(wèi)生意義。目前常規(guī)檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法有傳統(tǒng)培養(yǎng)法、基于大型儀器檢測(cè)、免疫學(xué)分析法等。傳統(tǒng)培養(yǎng)法的一般步驟是前增菌、選擇性增菌、選擇性平板分離、生物化學(xué)篩選、血清學(xué)技術(shù)提供培養(yǎng)物菌種的鑒定，這種細(xì)菌培養(yǎng)程序耗時(shí)，至少2 d獲得最終報(bào)告，需要專(zhuān)業(yè)的工作人員，成本高，且靈敏度有限?；诖笮蛢x器檢測(cè)有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）分析法等，由于檢測(cè)儀器體積龐大、檢測(cè)成本高，需要復(fù)雜的準(zhǔn)備程序，存在一定的局限性。雖然免疫學(xué)分析方法能夠在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)時(shí)檢測(cè)致病菌，但與傳統(tǒng)方法相比，有一定的缺陷，例如對(duì)低濃度靶物質(zhì)的靈敏度差、抗體與相關(guān)抗原發(fā)生交叉反應(yīng)、某些抗體對(duì)其靶物質(zhì)的親和力低，必須由專(zhuān)業(yè)的操作人員進(jìn)行。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種靈敏、快速、簡(jiǎn)便的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法。

適配體傳感器的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用促進(jìn)了微生物檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展，核酸適配體是指利用指數(shù)富集的配體進(jìn)化技術(shù)從寡核苷酸合成文庫(kù)中篩選出能與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的DNA或RNA，長(zhǎng)度一般為25～60 個(gè)核苷酸，當(dāng)靶物質(zhì)存在時(shí)，適配體通過(guò)互補(bǔ)堿基間的配對(duì)、靜電作用、氫鍵作用等自發(fā)的適應(yīng)性折疊成發(fā)夾、假節(jié)、凸環(huán)和G2四分體等穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)以及空間構(gòu)象的多樣性是與靶物質(zhì)緊密結(jié)合的基礎(chǔ)。與抗體相比，適配體對(duì)目標(biāo)分子表現(xiàn)出更好的親和力和特異性；具有可逆變性、穩(wěn)定性、更好的經(jīng)濟(jì)效益、易于修飾等?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，適配體常被作為生物傳感器的組成部分，例如，Youn等用DNaseI輔助循環(huán)酶信號(hào)放大方法結(jié)合適配體及氧化石墨烯復(fù)合物，設(shè)計(jì)了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗生素適配體傳感器。Huang Rongrong等提出了一種基于適配體與靶標(biāo)結(jié)合構(gòu)象變化的熒光適配體傳感器定量檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的方法，以標(biāo)記熒光基團(tuán)的適配體作為分子識(shí)別元件，設(shè)計(jì)與其互補(bǔ)的單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)法實(shí)現(xiàn)對(duì)慢性乙型肝炎的診斷。Zhang Hui等基于適配體的特異性識(shí)別功能與納米粒子的拉曼增強(qiáng)光譜構(gòu)建了同時(shí)檢測(cè)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的生物傳感器。

本研究開(kāi)發(fā)了一種基于核酸適配體和納米金光學(xué)特性的生物傳感器用于鼠傷寒沙門(mén)氏菌的可視化比色檢測(cè)。采用適配體（5′-CTGACAGATTAAAAGTGGTTG GGCAACTTCTGCTTGCGAA）對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行定量，該適配體對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌親和力較好，值為4.41×10mol/L。檢測(cè)原理如圖1所示，首先，沙門(mén)氏菌適配體和與其序列互補(bǔ)的捕獲探針（capture probe，CP）通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則雜交制備而成雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）復(fù)合物。當(dāng)待測(cè)分析物中含有鼠傷寒沙門(mén)氏菌時(shí)，適配體與鼠傷寒沙門(mén)氏菌發(fā)生特異性結(jié)合，從而釋放出單鏈CP并吸附在納米金表面，避免了納米金粒子在鹽誘導(dǎo)作用下的聚集，此時(shí)納米金顆粒溶液保持酒紅色；而當(dāng)待測(cè)分析物中不含沙門(mén)氏菌時(shí)，由于dsDNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)剛性較好，對(duì)納米金顆粒吸附性能較差，導(dǎo)致其在鹽的誘導(dǎo)下發(fā)生團(tuán)聚，此時(shí)納米金溶液顏色由紅變紫。該顏色變化過(guò)程，無(wú)需額外儀器輔助，裸眼即可實(shí)現(xiàn)靶物質(zhì)的快速檢測(cè)，并通過(guò)進(jìn)一步分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)。

圖1 基于納米金比色法適配體傳感器檢測(cè)原理圖Fig. 1 Working principle of Au nanoparticle-based colorimetric aptasensor

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠傷寒沙門(mén)氏菌（，ATCC 19585）、非目標(biāo)菌為大腸桿菌（，ATCC 43889）、副溶血性弧菌（，ATCC17802）、金黃色葡萄球菌（，ATCC 25923）、李斯特菌（，ATCC 19115）均購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）；四氯金酸水合物（HAuCl·HO） 百靈威科技公司；8600-10醛基磁珠 美國(guó)Polysciences公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基；LB肉湯培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)瓊脂；亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基；Tris-HCl緩沖鹽溶液（pH 7.4）；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）；乙二胺四乙酸二鈉鹽二水（EDTA-2Na 2HO）；磷酸鹽緩沖液（20×PBS，pH 7.4～7.6）、雜交緩沖液1（25 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA-2Na，pH 8.8）、氯化鈉（NaCl）、雜交緩沖液2（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH 8）、吐溫20、瓊脂糖III、4S Red Plus核酸染色劑、電泳緩沖液（50×TAE、pH 8.4）和其他常規(guī)試劑以及DNA序列均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，純化方法為HPLC，DNA具體序列見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)用水通過(guò)Milli-Q系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）凈化。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的DNA序列Table 1 DNA sequences used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

HCM100-Pro恒溫振蕩金屬浴 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；5417R小型臺(tái)式冷凍型離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；TALOS F200X場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡 賽默飛世爾科技公司；Hema9600型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀珠海黑馬醫(yī)療儀器有限公司；LQ-5103A型電子天平上?，幮码娮涌萍加邢薰?；Lab dancer振蕩器 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司；Synergy2 SLFPTAD多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；BSC-1100IIA2-X生物安全柜 山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；FS5一體化穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀 英國(guó)愛(ài)丁堡儀器公司；瓊脂糖凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad公司；EOS 50D數(shù)字照相機(jī) 日本佳能公司。

1.3 方法

1.3.1 鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液的準(zhǔn)備

取凍存的鼠傷寒沙門(mén)氏菌種子液在亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)48 h，挑取單個(gè)菌落接種至胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（200 r/min、37 ℃、16 h）。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液用無(wú)菌Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline，TBS）離心洗滌3 次（8 000 r/min、5 min），棄上清液重懸在緩沖液中，經(jīng)稀釋至合適的倍數(shù)后涂布于亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基中計(jì)數(shù)（37 ℃、48 h）。最終用TBS稀釋至合適濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 納米金的制備

1)跟蹤微課程學(xué)習(xí)情況。通過(guò)將微課程上傳至教學(xué)平臺(tái)，不定時(shí)監(jiān)測(cè)學(xué)生的點(diǎn)擊學(xué)習(xí)情況。將點(diǎn)播次數(shù)較多的微課程通常是學(xué)生普遍認(rèn)為的難點(diǎn)，教師在課堂中統(tǒng)一講解解惑。

參考經(jīng)典的Frens方法，取1 mL 1%氯金酸溶液和49 mL去離子水同時(shí)加入圓底燒瓶中混勻，同時(shí)組裝好冷凝管，油浴加熱直到沸騰，再配制1%檸檬酸三鈉溶液，取3.5 mL加入至圓底燒瓶中攪拌混勻，反應(yīng)20 min后停止加熱，用磁力攪拌器攪拌圓底燒瓶?jī)?nèi)的物體至制備完成，用50 mL離心管分裝置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 Mbs@CP的組裝

取20 μL醛基化磁珠，磁響應(yīng)后移除上清液，加入36 μL 1×PBS（10 mmol/L NaHPO、1.75 mmol/L KHPO、0.14 mol/L NaCl、2.65 mmol/L KCl，pH 7.2～7.6）和4 μL 100 μmol/L的氨基修飾的CP，37 ℃孵育12 h磁分離后，用100 μL 1×PBS洗滌3 次，用100 μL 0.5%酪蛋白溶液室溫封閉1 h，磁分離后將沉淀重懸在100 μL 1×PBS中并放置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 熒光法驗(yàn)證適配體與靶標(biāo)的親和力

首先用磁珠連接的捕獲探針Mbs@CP（10 μL）與適配體（Apt）（10 μL）在雜交緩沖液中混合，90 ℃孵育5 min，冷卻至室溫完成雜交，洗滌棄掉上清液（未雜交上的Apt），再重懸在20 μL 1×PBS中制備Mbs@dsDNA，分別加入30 μL濃度梯度的鼠傷寒沙門(mén)氏菌溶液（10～1×10CFU/mL），30 μL 2×TBS（50 mmol/L Tris-HCl、0.28 mol/L NaCl、6 mmol/L KCl，pH 7.2～7.6）作為空白對(duì)照，37 ℃孵育完成識(shí)別與適配體的釋放。反應(yīng)結(jié)束后取上清液分別加入20 μL 2×TBS和20 μL 10×SYBR Green I混勻避光孵育30 min，完成孵育后用20 μL比色皿收集液體進(jìn)行熒光信號(hào)強(qiáng)度測(cè)定，設(shè)置激發(fā)光波長(zhǎng)為497 nm，縫隙寬度為3 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為525 nm，縫隙寬度為2 nm。

1.3.5 可行性驗(yàn)證

用該比色傳感體系同時(shí)檢測(cè)含鼠傷寒沙門(mén)氏菌的樣品和空白樣品，以驗(yàn)證該適配體傳感器的可行性。首先取2 個(gè)PCR離心管標(biāo)記為空白組（管1）、實(shí)驗(yàn)組（管2），同時(shí)加入5 μL CP（2 μmol/L）和5 μL Apt（2 μmol/L）振蕩混勻，在PCR儀中設(shè)置90 ℃雜交5 min，再取出離心管放置室溫冷卻完成雜交過(guò)程?？瞻捉M中加入10 μL TBS，實(shí)驗(yàn)組中加入10 μL鼠傷寒沙門(mén)氏菌溶液（1×10CFU/mL），于37 ℃孵育完成識(shí)別與適配體的釋放，取出后分別加入50 μL AuNPs（23 nmol/L）溶液混勻，最后加入7 μL NaCl溶液（0.2 mol/L）混勻靜置10 min。

1.3.6 體系靈敏度檢測(cè)

每管取10 μL 4 ℃?zhèn)溆玫膁sDNA，分別加入10 μL濃度梯度的鼠傷寒沙門(mén)氏菌溶液，10 μL 2×TBS作為空白對(duì)照，37 ℃振蕩孵育20 min完成識(shí)別與適配體的釋放，再各加入50 μL AuNPs（9.2 nmol/L）溶液混勻于37 ℃孵育20 min。反應(yīng)結(jié)束后分別加入7 μL NaCl溶液（0.2 mol/L）混勻靜置2 min，收集顯色溶液于96 孔板中用酶標(biāo)儀測(cè)定吸收光譜。

1.3.7 特異性分析

取5 個(gè)PCR離心管，分別加入10 μL 4 ℃?zhèn)溆玫膁sDNA，以及準(zhǔn)備好的其他4 種常見(jiàn)的非目標(biāo)致病菌菌液（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、副溶血性弧菌，1×10CFU/mL，10 μL）和鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液（1×10CFU/mL，10 μL），混勻后于37 ℃水浴中孵育完成適配體的識(shí)別與釋放，再各加入50 μL AuNPs（9.2 nmol/L）溶液振蕩混勻后于37 ℃水浴中孵育20 min，取出后分別加入10 μL NaCl溶液（0.2 mol/L）混勻靜置2 min，收集顯色溶液于96 孔板中用酶標(biāo)儀測(cè)定吸收光譜。

1.3.8 實(shí)際樣品分析

通過(guò)高速離心分離牛奶樣品（10 000 r/min，20 min），去除上層脂肪和下層沉淀，吸取中間液體用超濾膜進(jìn)行過(guò)濾處理，最后將過(guò)濾所得的溶液稀釋1 倍備用。通過(guò)添加鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液制備不同濃度梯度的樣品溶液（1×10～1×10CFU/mL）并放置4 ℃?zhèn)溆?，用該適配體傳感器檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法對(duì)牛奶樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 適配體與靶標(biāo)的親和力驗(yàn)證

適配體與靶標(biāo)之間的高效識(shí)別是構(gòu)建適配體生物傳感器的基礎(chǔ)，因此首先通過(guò)熒光法驗(yàn)證該Apt與鼠傷寒沙門(mén)氏菌的親和力。如圖2A所示，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，制備Apt與氨基化捕獲探針NH-CP的dsDNA復(fù)合物。該dsDNA復(fù)合物在室溫下通過(guò)其標(biāo)記的氨基與磁珠表面的醛基即可形成較為穩(wěn)定的席夫堿結(jié)構(gòu)。當(dāng)檢測(cè)體系中存在鼠傷寒沙門(mén)氏菌時(shí)，Apt與鼠傷寒沙門(mén)氏菌發(fā)生特異性識(shí)別并被釋放至溶液的上清液中，收集上清液并加入熒光染料SYBR Green I。Apt與沙門(mén)氏菌結(jié)合后，自身序列含有配對(duì)堿基從而形成部分DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，SYBR Green I嵌入其中后熒光大大增強(qiáng)。通過(guò)測(cè)定上清液中SYBR Green I的熒光強(qiáng)度變化，考察該適配體與鼠傷寒沙門(mén)氏菌的結(jié)合性能。如圖2B所示，隨著鼠傷寒沙門(mén)氏菌濃度（1×10～1×10CFU/mL）增加，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，且相對(duì)熒光強(qiáng)度（-）/逐漸升高（圖2C）。其中，代表空白組熒光信號(hào)值，代表實(shí)驗(yàn)組熒光信號(hào)值。結(jié)果表明，該適配體與不同濃度鼠傷寒沙門(mén)氏菌的響應(yīng)關(guān)系良好，表明兩者具有良好的親和性能，可應(yīng)用于構(gòu)建適配體生物傳感器。

圖2 熒光法驗(yàn)證靶標(biāo)與適配體親和力原理（A）、不同濃度鼠傷寒沙門(mén)氏菌熒光光譜（0～1×107 CFU/mL）（B）和相對(duì)熒光強(qiáng)度與鼠傷寒沙門(mén)氏菌濃度關(guān)系（C）圖Fig. 2 Schematic diagram of affinity between target and aptamer by fluorescence method (A), fluorescence spectra of S. typhimurium at different concentrations ( 0–1 × 107 CFU/mL) (B), and relationship between relative fluorescence intensity and S. typhimurium concentration(C)

2.2 比色傳感策略的可行性驗(yàn)證

基于適配體的納米金比色法用于鼠傷寒沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)的可行性驗(yàn)證，結(jié)果如圖3A所示，管1為空白對(duì)照組，檢測(cè)體系中不含沙門(mén)氏菌；管2為實(shí)驗(yàn)組，檢測(cè)體系中含有沙門(mén)氏菌。裸眼觀察到管1相比管2，納米金顏色明顯偏紫，說(shuō)明管1中納米金聚集，管2中納米金分散良好。分別對(duì)兩管中膠體金狀態(tài)進(jìn)一步通過(guò)透射電子顯微鏡進(jìn)行表征。空白組的納米金顆粒大部分聚集成團(tuán)（圖3B），而實(shí)驗(yàn)組中納米金與其相比，在視野里則較為分散（圖3C）。該結(jié)果證實(shí)表明該比色傳感策略可應(yīng)用于鼠傷寒沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)。

圖3 比色法驗(yàn)證適配體傳感器可行性（A）及空白組（B）、實(shí)驗(yàn)組（C）納米金透射電子顯微鏡表征Fig. 3 Colorimetric validation of the aptasensor’s feasibility (A), and transmission electron micrographs of Au nanoparticles in blank (B) and experimental groups (C)

2.3 dsDNA復(fù)合物的制備優(yōu)化

ssDNA與dsDNA與納米金之間的不同吸附力是納米金比色策略的基礎(chǔ)，因此確保檢測(cè)體系中含有更多dsDNA復(fù)合物是提升該傳感方法性能的關(guān)鍵因素之一。因此，以雜交緩沖液、雜交溫度及時(shí)間作為影響因素，優(yōu)化dsDNA復(fù)合物的制備。

選擇并對(duì)比兩種雜交緩沖液：緩沖液1（25 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA-2Na，pH 8.8）和緩沖液2（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH 8）用于dsDNA的制備。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳圖對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行表征。如圖4A所示，泳道1和泳道2分別是CP與Apt的條帶，泳道3和泳道4分別是緩沖液1和緩沖液2所得產(chǎn)物。與泳道4相比，泳道3中條帶更亮。因此，選定緩沖液1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 2 種不同雜交緩沖液（A）和不同溫度（B）條件下制備dsDNA瓊脂糖凝膠電泳表征Fig. 4 Agarose gel electropherograms of dsDNA prepared in two different hybridization buffers (A) and at different temperatures (B)

在4 種不同的雜交溫度及時(shí)間下，分別為37 ℃孵育1 h、45 ℃孵育1 h、60 ℃孵育1 h、90 ℃孵育5 min，再冷卻至室溫放置1 h，制備dsDNA復(fù)合物。結(jié)果如圖4B所示，4 個(gè)泳道都出現(xiàn)dsDNA條帶，并且泳道4與泳道1～3的條帶相比，其dsDNA的條帶更加明顯。這可能是因?yàn)楦邷叵?，DNA序列本身的二級(jí)結(jié)構(gòu)均被打開(kāi)，利于兩者的充分雜交。因此，選擇90 ℃、5 min再室溫、1 h作為雜交溫度和時(shí)間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 適配體比色傳感策略對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的響應(yīng)性能分析結(jié)果

在優(yōu)化的條件下，設(shè)置一組具有濃度梯度的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液（10～10CFU/mL）驗(yàn)證該比色適配體傳感器的檢測(cè)性能。直徑為（13±2）nm的納米金粒子在520 nm左右波長(zhǎng)處吸收可見(jiàn)光，顏色呈現(xiàn)紅色膠體溶液狀；而當(dāng)納米金聚集后，干擾其局域表面等離子體共振，使得紫外-可見(jiàn)吸收光譜發(fā)生紅移至620 nm附近，并且膠體金溶液因聚集程度不同而呈現(xiàn)紫色、藍(lán)色或灰色懸液。觀察納米金顏色和測(cè)定溶液紫外-可見(jiàn)吸收光譜的變化可用于分析該傳感器對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)響應(yīng)性能。實(shí)驗(yàn)中，分別測(cè)定波長(zhǎng)520 nm和620 nm處的吸光度，用/表征納米金顆粒的團(tuán)聚程度。如圖5A所示，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著鼠傷寒沙門(mén)氏菌濃度增大，納米金顆粒的團(tuán)聚程度逐漸減弱即分散性越來(lái)越好，與此相對(duì)應(yīng)的是，裸眼觀察到體系顏色逐漸由藍(lán)紫變?yōu)榫萍t（插圖）。當(dāng)鼠傷寒沙門(mén)氏菌在一定濃度范圍（10～10CFU/mL）內(nèi)，納米金的團(tuán)聚程度與其濃度的對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)良好的線性響應(yīng)（圖5B），線性方程為=-0.129 98+1.244 11（=0.992 62）?；贚OD=3/，計(jì)算可得檢出限為124 CFU/mL。另外，通過(guò)將該方法與與其他檢測(cè)方法相比（表2）發(fā)現(xiàn)，該適配體傳感器檢測(cè)靈敏度高、樣品消耗量小、操作簡(jiǎn)便、成本低廉、易于觀察檢測(cè)結(jié)果，更具現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。

圖5 適配體傳感器檢測(cè)不同濃度鼠傷寒沙門(mén)氏菌表征圖（A）和納米金團(tuán)聚程度與鼠傷寒沙門(mén)氏菌濃度的線性響應(yīng)圖（B）Fig. 5 Results of aptasensor detection of S. typhimurium at different concentrations (A) and linear relationship between aggregation degree of Au nanoparticles and S. typhimurium concentration (B)

表2 檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌不同方法的性能比較Table 2 Performance comparison of different methods for the detection of S. typhimurium

2.5 特異性分析結(jié)果

特異性的識(shí)別對(duì)于評(píng)估分析實(shí)際樣品至關(guān)重要。用該核酸適配體傳感器檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌（1×10CFU/mL）與其他4 種常見(jiàn)的致病菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、副溶血性弧菌，1×10CFU/mL），驗(yàn)證本方法對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的檢測(cè)特異性。如圖6所示，管1～4都為對(duì)照菌，管5為鼠傷寒沙門(mén)氏菌。管5與其他4 管相比呈現(xiàn)明顯酒紅色，表明納米金顆粒分散性較好，且顏色對(duì)比明顯，表明該適配體傳感器對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌具有良好的檢測(cè)特異性。

圖6 適配體傳感器的特異性分析Fig. 6 Specificity analysis of the aptasensor

2.6 牛奶中沙門(mén)氏菌檢測(cè)性能分析結(jié)果

為測(cè)試該適配體傳感器的實(shí)際應(yīng)用性能，采用本方法檢測(cè)牛奶樣品中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌。通過(guò)在牛奶中添加不同量的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液制備不同濃度的鼠傷寒沙門(mén)氏菌牛奶加標(biāo)樣品。根據(jù)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)牛奶樣品進(jìn)行預(yù)處理和檢測(cè)，重復(fù)3 次。如表3所示，測(cè)得鼠傷寒沙門(mén)氏菌的回收率為92.0%～116.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5%，表明本方法具有很好的準(zhǔn)確性和特異性，可用于牛奶等相關(guān)實(shí)際樣品中鼠傷寒沙門(mén)氏菌的檢測(cè)。

表3 牛奶樣品中鼠傷寒沙門(mén)氏菌的檢測(cè)Table 3 Recoveries of S. typhimurium in spiked milk samples

1×102 1.163×102 116.4 1.1 1×104 1.003×104 100.3 1.8 1×106 1.059×106 105.9 3.1 1×108 9.196×108 92.0 4.7

3 結(jié) 論

發(fā)展了一種基于核酸適配體的納米金比色傳感策略用于鼠傷寒沙門(mén)氏菌的可視化快速檢測(cè)，通過(guò)對(duì)該方法的可行性、檢測(cè)性能（檢出限為124 CFU/mL）、特異性以及實(shí)際樣品的檢測(cè)性能等方面的驗(yàn)證，該適配體傳感器具有以下優(yōu)勢(shì)：1）利用納米金顏色特征作為檢測(cè)信號(hào)，不需要連接復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)換器，實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；2）該適配體傳感器的特異性好，對(duì)非目標(biāo)菌不產(chǎn)生比色信號(hào)，可應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)，并且能較大程度地避免二次污染產(chǎn)生的干擾信號(hào)；3）良好的通用性，只需改變適配體序列，即可實(shí)現(xiàn)不同食品安全污染物的檢測(cè)?？傊?，該適配體傳感器檢測(cè)結(jié)果直觀，通過(guò)顏色對(duì)比即可實(shí)現(xiàn)對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的定性、定量檢測(cè)，檢測(cè)成本低、快速便捷，在食品安全快速檢測(cè)方面具有潛在的應(yīng)用前景。