微生態(tài)療法在特應(yīng)性皮炎的應(yīng)用及其治療機(jī)制

周園，姚煦

皮膚是人體最大的器官，其上定植著種類繁多、數(shù)量巨大的微生物群落。表皮屏障、免疫系統(tǒng)和皮膚菌群之間協(xié)同合作，共同維護(hù)人體的皮膚健康。皮膚菌群紊亂在特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)等炎癥性皮膚病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。在AD患者，致病性金黃色葡萄球菌(，)優(yōu)勢(shì)定植，皮膚共生菌多樣性下降，從而導(dǎo)致宿主皮膚屏障破壞以及免疫系統(tǒng)失衡?？诜蚓植繎?yīng)用抗生素適用于皮膚繼發(fā)性細(xì)菌感染，但是不能預(yù)防AD的復(fù)發(fā)。在AD患者中廣泛外用抗生素可導(dǎo)致特殊耐藥菌株的出現(xiàn)，同時(shí)容易破壞體表正常的微生態(tài)系統(tǒng)，進(jìn)一步加重AD患者的皮膚菌群紊亂。微生態(tài)療法基于AD患者致病性以及各類皮膚共生菌的作用機(jī)制，靶向修飾皮膚常駐菌群，選擇性殺滅或抑制致病菌，改善皮膚屏障并調(diào)節(jié)免疫平衡，為AD的預(yù)防與治療提供了全新的途徑。

1 S.aureus在AD的流行病學(xué)研究

約20%的健康人群存在的表皮定植，而在AD患者中的定植率可達(dá)30%～100%。近期針對(duì)95項(xiàng)基于培養(yǎng)學(xué)方法的觀察性研究的Meta分析結(jié)果顯示，AD患者皮損與非皮損處的攜帶率分別為70%和39%，并且的異常定植與AD皮損的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性。在嬰兒AD，有研究顯示的定植早于AD的發(fā)生，提示早期皮膚定植與嬰兒后期臨床AD的發(fā)生密切相關(guān)。菌株水平的宏基因組學(xué)分析結(jié)果進(jìn)一步顯示，AD患者定植的菌株呈單克隆性。與正常人皮膚分離的菌株相比，這種AD單克隆性分離株在小鼠表皮定植模型中誘導(dǎo)更嚴(yán)重的皮膚炎癥反應(yīng)，提示其更強(qiáng)的致病性。

2 S.aureus的致病機(jī)制

分泌的α毒素是一種水溶性細(xì)胞毒素，可以直接在KC表面形成穿孔，從而破壞皮膚屏障。合成并分泌10種主要的蛋白酶，包括1種絲氨酸蛋白酶(V8蛋白酶)、1種金屬蛋白酶、2種半胱氨酸蛋白酶(staphopain A和B)以及6種絲氨酸蛋白酶樣蛋白(SplA-F)。這些蛋白酶溶解并穿透宿主角質(zhì)層，進(jìn)一步破壞上皮屏障的完整性。此外，還可以刺激宿主KC產(chǎn)生內(nèi)源性蛋白酶，包括激肽釋放酶(kallikrein，KLK)6、KLK13和KLK14，提示破壞皮膚屏障的另一種機(jī)制。

脂蛋白通過激活人原代KC表面的Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)2/TLR6，誘導(dǎo)其產(chǎn)生胸腺基質(zhì)淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)，從而促進(jìn)AD中Th2型炎癥。Saito等研究發(fā)現(xiàn)脂蛋白可以被真皮樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)表面的TLR2識(shí)別，促使真皮DC的遷移以及下游效應(yīng)T細(xì)胞(effector T cell，Teff)的皮膚浸潤(rùn)，揭示了脂蛋白通過DC-Teff軸建立皮膚炎癥的新機(jī)制。蛋白酶SplD亦可作為細(xì)菌過敏原誘導(dǎo)產(chǎn)生SplD特異性IgE。與屋塵螨及其提取物等其他具有蛋白酶活性的過敏原不同，SplD并不誘導(dǎo)產(chǎn)生TSLP、IL- 25或GM-CSF，而是刺激宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL- 5、IL- 33等細(xì)胞因子，加重Th2型炎癥反應(yīng)。所有菌株均表達(dá)超抗原，如葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxin，SE)A、SEB、中毒性休克綜合征毒素(toxic shock syndrome toxin- 1，TSST- 1)等，引起細(xì)胞因子釋放、B細(xì)胞增殖并可作為過敏原誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性IgE。

酚溶性調(diào)節(jié)蛋白(phenol-soluble modulins，PSMs)是最重要的毒力因子之一，包括一組細(xì)胞毒性肽PSMα1- 4、PSMβ1- 2、PSMγ(亦稱為δ毒素)以及PSM-mec。Syed等發(fā)現(xiàn)PSMs在小鼠表皮定植模型中可誘導(dǎo)KC促炎細(xì)胞因子IL- 18的表達(dá)，證明了PSMs在介導(dǎo)的皮膚炎癥中的重要作用。在小鼠定植模型中，δ毒素誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒，促進(jìn)IgE水平升高和Th2型皮膚炎癥。PSMα則可以誘導(dǎo)KC產(chǎn)生IL- 1α和IL- 36α，募集γδ T細(xì)胞以及3型固有淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)生IL- 17，從而觸發(fā)皮膚炎癥反應(yīng)。

分泌PSMs的過程受到輔助基因調(diào)節(jié)(accessory gene regulator，Agr)群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控。Agr系統(tǒng)包括RNAII和RNAIII兩個(gè)相鄰的轉(zhuǎn)錄本，其中RNAIII可同時(shí)上調(diào)α毒素及多種蛋白酶的表達(dá)。Nakamura等在未發(fā)生AD的患兒中觀察到Agr基因突變且功能異常的菌株，提示功能完整的Agr系統(tǒng)是表皮定植并誘導(dǎo)AD樣皮膚炎癥的必要條件。因此，干預(yù)上游Agr系統(tǒng)是限制AD患者中定植與毒力的重要靶點(diǎn)。

3 微生態(tài)療法

3.1 皮膚特定菌群移植

AD患者皮膚菌群多樣性下降，對(duì)人體有益的皮膚共生菌減少。Paetzold等將含有多種細(xì)菌的混合溶液應(yīng)用至健康志愿者皮膚，結(jié)果顯示受試者皮膚菌群的組成變得與供體更相似，證明了皮膚菌群移植在調(diào)節(jié)皮膚微生物組成中的可行性。包括表皮葡萄球菌(，)在內(nèi)的多種凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase-negative Staphylococci，CoNS)可產(chǎn)生抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)特異性殺滅，并與宿主內(nèi)源性AMP LL- 37發(fā)揮協(xié)同抗菌作用。在AD患者和健康人群皮膚分離得到大量CoNS菌株，高通量篩選針對(duì)的抗菌活性株，結(jié)果顯示具有抗菌活性的CoNS菌株在AD患者中明顯減少，而在AD患者中重新引入活性CoNS菌株則可以有效降低的定植。在隨后進(jìn)行的一項(xiàng)隨機(jī)雙盲臨床試驗(yàn)中，Nakatsuji等從AD患者非皮損處篩選獲得具有抗菌活性的CoNS，在體外擴(kuò)增后進(jìn)行自體菌群移植，重新應(yīng)用至AD患者皮膚表面，隨訪結(jié)果顯示該療法患者耐受性良好，定植降低，AD患者疾病嚴(yán)重程度明顯改善。Myles等將從健康人獲得的皮膚共生菌黏液玫瑰單胞菌(，)應(yīng)用于AD小鼠模型以及AD患者，均獲得一定的治療效果。

Teme79小鼠自發(fā)形成Th17細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚炎癥。皮膚微生物組比較分析發(fā)現(xiàn)其疾病活動(dòng)指數(shù)與皮膚科氏葡萄球菌(，)數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。局部應(yīng)用分離自小鼠或人體的可有效預(yù)防或改善Teme79小鼠的皮膚炎癥，而在MC903誘導(dǎo)的AD小鼠模型中同樣有效。進(jìn)一步研究則顯示可激活宿主糖皮質(zhì)激素相關(guān)通路并誘導(dǎo)皮膚抗炎基因的表達(dá)。這提示作為微生物制劑在治療皮膚炎癥中的巨大潛力。

此外，多種CoNS可產(chǎn)生信號(hào)分子自體誘導(dǎo)肽(autoinducing peptides，AIPs)競(jìng)爭(zhēng)性抑制的Agr系統(tǒng)，但這存在高度的菌株依賴性。山羊葡萄球菌()可分泌一種八肽的AIP(YSTCSYYF)，阻斷Agr毒力系統(tǒng)，減輕感染引起的小鼠皮膚壞死性損傷和表皮致病菌負(fù)荷。另一種CoNS人葡萄球菌(，)則通過分泌AIP(SYNVCGGYF)抑制Agr毒力，預(yù)防介導(dǎo)的小鼠表皮損傷和皮膚炎癥。隨后該團(tuán)隊(duì)根據(jù)各種CoNS菌株對(duì)生長(zhǎng)及毒力因子的抑制能力，進(jìn)一步分離篩選出菌株ShA9。外用ShA9治療AD患者后，所有菌株的毒力因子PSMα的表達(dá)均被抑制，定植減少。同時(shí)部分患者的被ShA9直接殺滅，該部分患者皮損得到有效改善。該項(xiàng)一期臨床試驗(yàn)的成功揭示了皮膚菌群移植在AD治療中的安全性及潛在價(jià)值。

3.2 噬菌體與內(nèi)溶素療法

來源于噬菌體的內(nèi)溶素療法可以選擇性根除皮膚定植。內(nèi)溶素是噬菌體產(chǎn)生的針對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞壁水解酶。噬菌體及其內(nèi)溶素具有高度特異性，選擇性殺死致病菌而不影響其他皮膚共生菌。Staphefekt是商品化的重組噬菌體內(nèi)溶素，專門針對(duì)皮膚局部用藥。早期病例報(bào)告表明外用Staphefekt可緩解傳統(tǒng)治療無效的AD皮損癥狀。但在隨后的100名中重度AD患者中進(jìn)行的Staphefekt與安慰劑對(duì)照的隨機(jī)雙盲臨床試驗(yàn)中，治療組與對(duì)照組在定植、臨床療效、生活質(zhì)量等方面沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。作者分析這可能與未合理篩選定植增加的AD患者、外用皮質(zhì)類固醇激素減輕皮損嚴(yán)重程度而掩蓋Staphefekt療效等因素有關(guān)。

Shimamori等從污水樣本中分離出一種新型噬菌體SaGU1，可在體外廣泛殺滅來源于AD患者皮膚的多種臨床分離株，但不影響皮膚共生菌的存活。SaGU1與聯(lián)用可減少耐噬菌體的出現(xiàn)，增強(qiáng)SaGU1的殺菌作用。在二硝基甲苯致敏聯(lián)合定植的AD小鼠模型中，外用SaGU1或均可顯著減少定植并降低血清IgE水平，但兩者尚未發(fā)現(xiàn)明顯協(xié)同作用。對(duì)于存在定植增加的AD患者，噬菌體療法以及噬菌體聯(lián)合皮膚共生菌是AD治療的一種新選擇。

3.3 S.aureus疫苗

鑒于可以產(chǎn)生多種表面抗原及毒力因子，靶向單個(gè)抗原的疫苗無法刺激機(jī)體產(chǎn)生充分的免疫反應(yīng)以達(dá)到預(yù)防感染的作用。目前針對(duì)的多個(gè)疫苗在臨床試驗(yàn)中均未見到顯著成效。基于抗體的主動(dòng)疫苗接種對(duì)其他機(jī)會(huì)性細(xì)菌(如肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌)有效，但對(duì)無效。如何刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的細(xì)胞與體液免疫是疫苗研發(fā)的重點(diǎn)與難點(diǎn)。越來越多的證據(jù)表明不同的T細(xì)胞亞群通過協(xié)調(diào)下游細(xì)胞吞噬反應(yīng)，限制在不同部位的定植與感染。由Th1細(xì)胞分泌的γ干擾素所介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞反應(yīng)在血液感染的清除與免疫記憶的產(chǎn)生中至關(guān)重要，而產(chǎn)生IL- 17的γδT細(xì)胞和Th17細(xì)胞則在皮膚部位發(fā)揮作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)皮膚引流淋巴結(jié)中存在產(chǎn)生腫瘤壞死因子和γ干擾素的γδT細(xì)胞，可以預(yù)防后續(xù)的皮膚侵襲。由于不同部位的T細(xì)胞亞群的組織特異性，下一代抗疫苗應(yīng)靶向特定Teff亞群并誘導(dǎo)產(chǎn)生充分的抗毒素中和抗體。盡管抗疫苗尚未在AD患者中進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但這可能代表了一種調(diào)節(jié)AD皮膚菌群的新方法。

4 現(xiàn)狀與展望

皮膚菌群紊亂在AD的致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，包括的定植增加以及皮膚共生菌群的相對(duì)減少。微生態(tài)療法靶向調(diào)整皮膚菌群組成已成為AD局部治療的新興策略。微生態(tài)療法的最終目的不是完全根除致病菌，而是恢復(fù)其菌群多樣性，實(shí)現(xiàn)皮膚菌群的生態(tài)平衡。

目前“有益”皮膚共生菌移植在AD中的治療作用已初現(xiàn)曙光，疫苗、噬菌體及其衍生的內(nèi)溶素療法亦方興未艾。然而，許多研究仍處于初步階段，微生態(tài)療法治療AD的長(zhǎng)期安全性及有效性尚未可知。值得注意的是，現(xiàn)有的皮膚菌群移植多立足于單一菌種或菌株，而非真正意義上的微生物群體移植。皮膚表面是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，真實(shí)世界中單一菌種的作用有限，這從二期臨床試驗(yàn)的失敗中可見一斑。利用宏基因組學(xué)深入分析健康人群與AD患者的菌群差異、菌株異質(zhì)性，準(zhǔn)確定義“健康菌群”的概念，同時(shí)進(jìn)一步了解與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用機(jī)制。這是定向修飾皮膚菌群從而達(dá)到AD精準(zhǔn)治療的理論基礎(chǔ)。

對(duì)于已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的微生物制劑，仍需進(jìn)一步優(yōu)化患者選擇、藥物活性和治療持續(xù)時(shí)間，克服停藥后的快速重新定植，以實(shí)現(xiàn)最終可能成為常規(guī)的安全、可持續(xù)的臨床治療選擇，真正開創(chuàng)AD治療的后生物制劑時(shí)代。