豬OASL2基因克隆與序列分析

胡妍璇，楊佳純，袁 帥，劉 洋，余金麗，程思貝，沙惠陽，趙孟孟

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231)

先天性免疫是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道屏障，是機(jī)體抵抗病毒和細(xì)菌感染以及激活獲得性免疫的基礎(chǔ)。病毒已進(jìn)化出多種防御機(jī)制發(fā)揮免疫逃逸作用，從而抑制宿主的抗病毒反應(yīng)[1,2]，尋求更加有效的抗病毒策略對于疾病的防控至關(guān)重要。干擾素(Interferon，IFN)作為一種重要的天然免疫分子，可通過誘導(dǎo)一系列信號通路激活干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs)的表達(dá)。ISGs能夠通過阻斷病毒轉(zhuǎn)錄、降解病毒RNA、抑制蛋白翻譯或改變蛋白功能來控制病毒復(fù)制的許多階段，同時參與干擾素信號通路的免疫調(diào)節(jié)[7,8]。在主要的ISGs中，2′-5′寡腺苷酸合成酶(2′-5′ Oligoadenylate synthetase，OAS)是第一個被確定參與細(xì)胞固有抗病毒反應(yīng)的細(xì)胞蛋白[5]，它參與細(xì)胞生長、分化、凋亡、基因調(diào)控等生物進(jìn)程[6]，并且其胞內(nèi)活性與IFN表達(dá)量相關(guān)[7]，在抗病毒感染中發(fā)揮重要作用。

OAS首先在干擾素處理后的人體細(xì)胞中被鑒定，之后小鼠、豬、牛和犬等哺乳動物體內(nèi)的OAS也逐一被鑒定[8]。OAS可以分為OAS1、OAS2、OAS3和OASL四個家族成員，其中OAS1，OAS2，OAS3能催化三磷腺苷合成2′-5′寡腺苷酸(2′-5′ Oligoadenylates，2-5As)，2-5As作為第二信使激活核糖核酸內(nèi)切酶(RNase L)通路抑制病毒復(fù)制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。OASL不具有2-5As合成酶活性，但可以利用其C終端串聯(lián)的泛素樣結(jié)構(gòu)域(Ubiquitin-like，UBL)激活胞漿內(nèi)RNA受體/感受器視黃酸誘導(dǎo)基因I(Retinoic-acid-inducible gene I，RIG-I)通路控制病毒感染[6]。OAS家族與許多慢性代謝性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)[9,10]，例如OAS與I型糖尿病的發(fā)病相關(guān)[11]；OAS家族參與HIV-1感染的調(diào)控[12]；OASL可作為胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[13]；OAS1和OAS3依賴RNase L途徑抵抗登革熱病毒感染[14]；OAS2對日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的感染具有抑制作用[15]。因此，OAS具有廣泛的抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步研究OAS在動物機(jī)體中的作用，將為動物疾病的防治與臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

OASL作為OAS的家族成員，在哺乳動物細(xì)胞中表現(xiàn)出抗病毒活性， OASL在大多數(shù)病毒感染后在細(xì)胞內(nèi)上調(diào)并能顯著抑制病毒復(fù)制[16]。人OASL依賴OASL/RIG-I途徑抑制丙型肝炎病毒的復(fù)制[17]。OASL過表達(dá)能明顯降低細(xì)胞內(nèi)鴨坦布蘇病毒的滴度[18]。豬OASL與增強(qiáng)IFN-I信號通路的黑色素瘤分化相關(guān)基因5(Melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5)互作從而抑制豬瘟病毒的復(fù)制[19]。豬OASL不依賴RNase L通路抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)的復(fù)制[20]。迄今為止，有關(guān)OASL功能的研究主要以人和鼠為模型[21]，僅有少數(shù)豬OASL基因的功能及作用機(jī)制被證實(shí)，而有關(guān)豬OASL2基因的克隆及鑒定未見報道。因此，本研究對豬OASL2基因進(jìn)行克隆和序列分析，為后續(xù)深入研究豬OASL2基因的生物學(xué)功能以及抗病毒分子通路奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)由本實(shí)驗(yàn)室保存；TRIzol Reagent試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×TaqMaster Mix、DL10000 DNA Marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、pCE2 TA/Blunt-Zero克隆載體、DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞均購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank數(shù)據(jù)庫中OASL2序列，設(shè)計(jì)豬OASL2基因擴(kuò)增引物。引物序列如下：上游引物OASL2-F：5′-ATGGAGCTATTTTAC-3′；下游引物OASL2-R：5′-TCAACCAGAACCAGGATG-3′，引物由廣州天一輝遠(yuǎn)科技有限公司合成。

1.2.2 細(xì)胞總RNA提取

將PAMs培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，取上清液250 μL置于DEPC水處理過的1.5 mL滅菌離心管中，參照TRIzol Reagent RNA提取試劑盒說明書操作步驟，提取細(xì)胞總RNA。

1.2.3 cDNA合成

將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得豬OASL2基因cDNA片段，具體操作步驟參照HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書，產(chǎn)物在-20 ℃條件下保存。

1.2.4 PCR擴(kuò)增

將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μL：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL，模板cDNA 2 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 sec，60 ℃ 15 sec，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃充分延伸5 min。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠檢測，電泳后分析凝膠成像結(jié)果。

1.2.5 豬OASL2基因的克隆與測序

回收目的片段，按照FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit試劑盒操作說明進(jìn)行純化，將純化產(chǎn)物與pCE2 TA/Blunt-Zero載體連接，連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌經(jīng)氨芐抗生素篩選后通過PCR技術(shù)鑒定，陽性菌液送至廣州天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。

1.2.6 豬OASL2基因序列分析

利用在線ExPASy Proteomic Server軟件預(yù)測豬OASL2基因編碼氨基酸的基本理化性質(zhì)；參照GenBank數(shù)據(jù)庫，采用DNA Star軟件進(jìn)行豬OASL2基因序列分析；利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。參考序列信息見表1。

表1 參考序列信息

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂凝膠電泳分離鑒定，在633 bp左右可見明亮的條帶(圖1)，條帶大小與目的片段預(yù)期結(jié)果相符。測序結(jié)果顯示豬OASL2基因編碼區(qū)全長633 bp，表明該基因克隆成功。

M，DL10 000 DNA Marker；1，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2，菌液PCR結(jié)果

2.2 序列分析結(jié)果

2.2.1 堿基分布

豬OASL2基因序列全長633 bp，編碼211個氨基酸，其中腺嘌呤138個，占總堿基數(shù)的21.80%；鳥嘌呤178個，占總堿基數(shù)的28.12%；胸腺嘧啶147個，占總堿基數(shù)的23.22%；胞嘧啶170個，占總堿基數(shù)的26.86%。

2.2.2 基本理化性質(zhì)

豬OASL2基因相對分子質(zhì)量為23.94 ku，理論等電點(diǎn)為8.160；強(qiáng)堿性(K，R)、強(qiáng)酸性(D，E)、疏水性(A、I、L、F、W、V)與極性(N、C、Q、S、T、Y)特性的氨基酸數(shù)量分別為27、24、81和46。

2.2.3 核苷酸及氨基酸相似性比對

運(yùn)用MegAlign軟件進(jìn)行OASL序列相似性比對，核苷酸相似性比對結(jié)果顯示(圖2)，豬OASL2與豬OASL1相似性最高，為98.1%，與其它物種的核苷酸相似性為52.3%～72.0%；氨基酸相似性比對結(jié)果顯示(圖3)，豬OASL2與其它物種的氨基酸相似性為9.8%～58.1%，與豬OASL1相似性最高，為97.6%，與核苷酸相似性比對結(jié)果一致，說明豬OASL2基因在同一種屬內(nèi)保守度較高。

圖2 核苷酸相似性比對

圖3 氨基酸相似性比對

2.2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA 4.0軟件繪制豬OASL2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示：豬OASL2與豬OASL1位于同一進(jìn)化分支，與相似性比對結(jié)果一致；與牛OASL在同一個亞分支，親緣關(guān)系較近；與雞、小鼠、大鼠的親緣關(guān)系遠(yuǎn)。

2.2.5 氨基酸序列比對

通過MegAlign軟件將16種OASL基因翻譯為氨基酸進(jìn)行多序列比對，分析結(jié)果顯示各物種OASL基因編碼的氨基酸序列長度不同，在不同的氨基酸位點(diǎn)存在缺失、插入及替換現(xiàn)象，提示抗原性存在差異(圖5)。豬OASL2在N端有一個NTase結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域發(fā)揮抗病毒功能，在C末端沒有UBL結(jié)構(gòu)域，但在NTase結(jié)構(gòu)域中包含與其他OAS家族蛋白相同的P-loop、D-box以及保守位點(diǎn)LLRL，在N端的203個氨基酸與豬OASL1一致。

圖4 OASL2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 氨基酸序列比對

3 討論

本試驗(yàn)成功從PAMs細(xì)胞中克隆豬OASL2基因，對不同物種OASL進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示豬OASL2與豬OASL1的核苷酸、氨基酸相似性最高，與系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果保持一致，證實(shí)該序列來源于豬體，說明豬OASL2在同一物種內(nèi)具有較高保守性，與其它物種存在差異，提示豬OASL2的免疫學(xué)特性與其它物種存在差異。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，部分氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異，這一部分是否影響豬OASL2抗病毒效應(yīng)還有待進(jìn)一步研究。另外，豬OASL2包含一個N端NTase結(jié)構(gòu)域，這一典型結(jié)構(gòu)域在抗病毒效果中發(fā)揮重要作用[21]；在C末端沒有UBL結(jié)構(gòu)域，但在NTase結(jié)構(gòu)域中包含與其他OAS家族蛋白相同的P-loop、D-box以及保守位點(diǎn)LLRL；在N端的203個氨基酸殘基與豬OASL1一致?？傊?，對豬OASL2基因的生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測有利于揭示其可能參與的生物進(jìn)程，為進(jìn)一步研究豬OASL2基因參與抗病毒天然免疫提供理論依據(jù)。

OAS蛋白家族發(fā)揮抗病毒效應(yīng)主要通過OAS/RNase L經(jīng)典通路、RNase L非經(jīng)典通路兩種方式實(shí)現(xiàn)[22,23]，此外，OAS還可能利用多重途徑發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。人OASL通過RIG-I信號通路實(shí)現(xiàn)抗病毒的方式已被證實(shí)[18]，人OASL通過C終端串聯(lián)的UBL與RIG-I相互作用進(jìn)而激活I(lǐng)FN-I通路發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[24]，說明C端的UBL在發(fā)揮抗病毒效應(yīng)中起關(guān)鍵作用。通過氨基酸序列分析可知，豬OASL2基因提前表達(dá)終止密碼子產(chǎn)生截短的OAS蛋白缺失C終端串聯(lián)的UBL[25]，這有異于人OASL。因此，可以初步推斷豬OASL與人OASL發(fā)揮抗病毒的作用機(jī)制存在差異。有研究報道豬OASL蛋白不具有酶活性和泛素樣區(qū)域，但仍然具有較強(qiáng)的抗JEV活性，表明豬OASL2不是與RIG-I互作發(fā)揮抗病毒效應(yīng)，而是通過其它途徑來抵抗病原體感染，這在Helle Kristiansen[20]的研究中得到證實(shí)。此外有報道闡述OASL可以直接與MAD5以及環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶互作發(fā)揮抗病毒作用[19,26]。研究豬OASL2基因的遺傳特性和免疫學(xué)特點(diǎn)，篩選豬OASL2基因抑制病毒的功能位點(diǎn)以及探索其抗病毒的分子機(jī)理將成為下一步研究的方向。

4 結(jié)論

豬OASL2基因CDS序列全長為633 bp，編碼211個氨基酸，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，豬OASL2基因NTase結(jié)構(gòu)域包含與其它OAS家族蛋白相同的P-loop、D-box以及保守位點(diǎn)LLRL。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究豬OASL2基因的免疫學(xué)特點(diǎn)及抗病毒感染機(jī)制提供理論依據(jù)，也為后續(xù)開展對豬OASL基因家族組成、結(jié)構(gòu)功能及其表達(dá)調(diào)控的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。