檢測(cè)烷基苯磺酸鑒別地溝油的免疫層析方法研究*

唐桂紅，陳華龍，江偉玲，吳帆敏，郭杰標(biāo)

(1 韶關(guān)市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 韶關(guān) 512026；2 韶關(guān)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005)

地溝油是煎炸老油、泔水油、廢棄油等劣質(zhì)食藥油的統(tǒng)稱(chēng)，含有甲苯、丙醛、苯并芘等危害健康的化學(xué)物質(zhì)[1]。為了禁止地溝油回流餐桌，開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確高效的地溝油鑒別技術(shù)，成為監(jiān)管部門(mén)和研究機(jī)構(gòu)關(guān)注的熱點(diǎn)。

目前，地溝油檢測(cè)主要有理化檢測(cè)法、光譜檢測(cè)法和色譜檢測(cè)法。其中物理質(zhì)檢測(cè)主要針對(duì)：凝固點(diǎn)、透明度、黏度、折射率和電導(dǎo)率[2]；化學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要針對(duì)：酸值、碘值、羥值[3]；光譜學(xué)方法包括：紫外光譜法[4]、紅外光譜法[5]、拉曼光譜法[6]、核磁共振法[7]、太赫茲時(shí)域光譜法[8]、地溝油高光譜透射法[9]；色譜學(xué)方法包括：氣相色譜檢測(cè)地溝油中的外源微量成分[10-11]、特殊脂肪酸酯[12]，液相色譜檢測(cè)地溝油中的膽固醇[13]、辣椒堿和辣椒素[14-15]、黃曲霉素[16]、陰離子型表面活性劑[17]。在以上檢測(cè)中，基于理化檢測(cè)方法的專(zhuān)屬性不顯著，容易發(fā)生誤檢和漏檢。而依賴(lài)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的光譜和色譜檢測(cè)操作復(fù)雜，難以現(xiàn)場(chǎng)操作。已在食品檢測(cè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用免疫層析法[18]，以靈敏特異、快速價(jià)廉的特點(diǎn)[19]，引起了研究人員的注意：吳倩等[20]基于檢測(cè)辣椒堿的免疫層析快速鑒別地溝油，李軍濤等[21]建立了檢測(cè)黃曲霉毒素B1免疫熒光層析法鑒別地溝油，都展示了滿(mǎn)意的效果。相比于辣椒堿和黃曲霉毒素B1，十二烷基苯磺酸在地溝油中的殘留更為普遍[17，22-24]，研發(fā)檢測(cè)該殘留物的免疫層析試劑更有應(yīng)用前景。

圖1 烷基苯磺酸類(lèi)表面活性劑熒光免疫層析檢測(cè)

本研究如圖1的原理，開(kāi)發(fā)快速檢測(cè)十二烷基苯磺酸的熒光免疫層析法(Fluorescent immunochromatographic assay, FICA)，為食品安全監(jiān)管部門(mén)提供基于十二烷基苯磺酸殘留，快速鑒別的地溝油的可靠工具。

1 材料與儀器

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔,廣州華東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(證號(hào)44007600002936);實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在麗珠集團(tuán)利民制藥廠動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.1.2 主要藥品及試劑

十二烷基苯磺酸鈉對(duì)照品，默克公司；牛血白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、四甲聯(lián)苯胺(TMB)、過(guò)氧化脲，上海生工生物工程有限公司；對(duì)氨基苯磺酸、對(duì)磺基苯甲酸、對(duì)甲基苯磺酸，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；羊抗兔IgG二抗酶結(jié)合物，美國(guó)Jackson公司；熒光微球(150 nm)，上海杰一生物有限公司；羊抗兔IgG二抗，美國(guó)SIGMA公司；NC膜、玻璃纖維膜、PVC襯板、吸水墊，美國(guó)Millipore公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器

酶標(biāo)板，廣州潔特；紫外/可見(jiàn)光掃描儀，美國(guó)Thermo公司；酶標(biāo)儀，芬蘭Labsystems公司；BioJetXYZ3000型噴膜儀和切條機(jī)，上海捷寧公司。

2 方 法

2.1 人工免疫原的合成

如圖1根據(jù)改良活潑酯法，取2.0 mg對(duì)磺基苯甲酸溶于1.0 mL甲醇，加入2.5 mg NHS和3.5 mg EDC，室溫震蕩反應(yīng)過(guò)夜，生成對(duì)磺基苯甲酸活潑酯，10000 rpm離心10 min除去雜質(zhì)。上清液緩慢滴入含20 mg BSA的0.15 mol·L-1NaHCO3溶液(5 mL)，室溫磁力攪拌2 h，合成對(duì)磺基苯甲酸免疫抗原。反應(yīng)完全后，抗原液用生理鹽水透析72 h，期間換透析液六次，分裝于-20 ℃保存。

2.2 人工檢測(cè)抗原的合成

如圖1根據(jù)重氮法，取2.0 mg對(duì)氨基苯磺酸溶于1.0 mL甲醇，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到1.0，在冰浴中加入2.5 mg NaNO2震蕩反應(yīng)1 h，生成重氮化對(duì)氨基苯磺酸，緩慢滴入含40 mg OVA的pH 8.5 0.15 mol·L-1碳酸緩沖液(10 mL)，4 ℃磁力攪拌2 h，合成對(duì)氨基苯磺酸檢測(cè)抗原。反應(yīng)完全后，抗原液用生理鹽水透析72 h，期間換透析液六次，分裝于-20 ℃保存。

2.3 動(dòng)物免疫

以免疫抗原(對(duì)磺基苯甲酸-BSA偶聯(lián)物)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫。首免以完全弗氏佐劑乳化50 μg免疫抗原，背部多點(diǎn)皮下免疫。首免4周后，以不完全弗氏佐劑乳化50 μg免疫抗原加強(qiáng)免疫，之后每3周加強(qiáng)免疫一次，共3次。最后免疫6天后心臟取血，分離血清存放于-20 ℃。

2.4 抗體純化及特異性的評(píng)價(jià)

以辛酸-硫酸銨法純化抗體。參照前期工作的方法[25]，以十二烷基苯磺酸鈉、對(duì)甲基苯磺酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸鈉、對(duì)磺基苯甲酸、苯磺酸、苯甲酸、苯胺，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，分別繪制競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn)，計(jì)算對(duì)各藥物IC50值，計(jì)算交叉反應(yīng)率。

2.5 熒光微球的標(biāo)記

按前期工作的方法[26]，采用EDC活化法對(duì)羧基化熒光微球標(biāo)記抗體。取1.0 mL熒光微球稀釋在20 mL超純水中，加入0.05 mL新鮮配制的EDC溶液(10 mg·mL-1)，室溫?cái)嚢?0 min使羧基活化。將預(yù)活化微球分成三等份，分別加入抗苯磺酸抗體至終濃度0.20、0.30、0.40 mg·mL-1，輕微攪拌30 min使活化羧基與抗體的氨基連接。各種抗體濃度標(biāo)記的微球以16000 rpm低溫離心30 min，分別用含10% Triton X-100的PBS溶液重懸微球，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 免疫熒光微球?qū)游?FICA)試紙的組裝

將抗體標(biāo)記的熒光微球溶液噴在熒光微球釋放墊上，真空凍干后備用。用0.01 M PBS分別配制0.15、0.30、0.45、0.60 mg·mL-1的檢測(cè)抗原溶液，以及0.30 mg·mL-1的羊抗兔IgG二抗溶液。上述梯度濃度檢測(cè)抗原溶液和固定濃度二抗溶液形成四種組合，用噴涂設(shè)備分別在NC膜平行噴涂，構(gòu)成含不同測(cè)試線(xiàn)(T線(xiàn))和質(zhì)控線(xiàn)(C線(xiàn))四種NC膜，在37 ℃恒溫干燥后備用。

如圖2(a)所示，在60 mm×300 mm的PVC襯墊上，按順序粘貼樣品墊、熒光微球釋放墊、NC膜(T線(xiàn)和C線(xiàn))、吸收墊，用切條機(jī)縱向切成5 mm×60 mm的試紙條。

圖2 熒光微球試劑條裝配示意圖(a)和熒光免疫試紙條檢測(cè)結(jié)果的判定(b)

2.7 FICA檢測(cè)過(guò)程和結(jié)果判讀

用滴管在樣品墊加3～4滴樣品液，樣品液吸收墊運(yùn)動(dòng)，并帶動(dòng)在釋放墊上的標(biāo)記熒光微球移動(dòng)。烷基苯磺酸鈉和T線(xiàn)檢測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)性與金標(biāo)抗體結(jié)合，產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。熒光微球的結(jié)果判讀：如圖2(b)所示，C線(xiàn)和T線(xiàn)都顯熒光，樣品不含烷基苯磺酸鈉；C線(xiàn)顯色而T線(xiàn)不顯熒光，顯示樣品含烷基苯磺酸鈉；C線(xiàn)如不顯熒光，則表明試劑已經(jīng)失效。

2.8 FICA試紙檢測(cè)限優(yōu)化

調(diào)整抗體標(biāo)記濃度和抗原噴涂濃度，優(yōu)化FICA對(duì)SDBS的檢測(cè)靈敏度。用PBS配制800、400、200、100、50、25 ng·mL-1的烷基苯磺酸鈉溶液，按2.7步驟對(duì)從高濃度到低濃度進(jìn)行檢測(cè)，使T線(xiàn)熒光消失的最后濃度就是試紙條的最低檢測(cè)限。

2.9 FICA試劑檢測(cè)油脂中SDBS殘留結(jié)果驗(yàn)證

在100 mL的純凈食用油中，分別滴加含0.5、1.0、1.5、2.0 μg SDBS的5.0 mL水溶液，充分?jǐn)嚢韬笤?05 ℃烤箱加熱5 h蒸發(fā)水分。用5 mL的PBS溶液對(duì)5 mL油樣品充分震蕩抽提，在3000 rpm離心15 min破乳分層。取水相溶液按照2.7步驟檢測(cè)。每個(gè)添加濃度的油脂抽提5次進(jìn)行檢測(cè)，分別統(tǒng)計(jì)結(jié)果對(duì)檢測(cè)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3 結(jié)果與討論

3.1 抗體特異性的評(píng)價(jià)

如表1所示，抗體對(duì)十二烷基苯磺酸鈉具有很好的親和力。同時(shí)，對(duì)4-甲基苯磺酸、4-氨基苯磺酸、4-磺基苯甲酸、苯磺酸等含苯磺酸基團(tuán)的化合物，對(duì)ELISA檢測(cè)(基于4-磺基苯甲酸抗體和對(duì)氨基苯磺酸抗原)的競(jìng)爭(zhēng)抑制效應(yīng)明顯。證明本研究獲得的抗體，識(shí)別苯磺酸基團(tuán)的特異性良好，能夠用于苯磺酸類(lèi)表面活性劑的檢測(cè)。

表1 抗體對(duì)8種相關(guān)化合物的交叉反應(yīng)率

3.2 檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)包被濃度優(yōu)化

如圖3所示，當(dāng)熒光微球抗體包被濃度達(dá)到0.30 mg/mL、檢測(cè)抗原包被濃度達(dá)到0.45 mg/mL，檢測(cè)線(xiàn)的熒光信號(hào)趨于穩(wěn)定。在此基礎(chǔ)上可以對(duì)FICA試紙條檢出限進(jìn)行優(yōu)化。

圖3 抗體標(biāo)記濃度(a)和檢測(cè)抗原噴涂濃度(b)

3.3 FICA試紙條檢測(cè)限優(yōu)化結(jié)果

圖4 熒光免疫層析試劑(FICA)對(duì)SDBS標(biāo)準(zhǔn)溶液的最低檢測(cè)限驗(yàn)證結(jié)果

為了使試劑的檢測(cè)性能更穩(wěn)定，優(yōu)化的FIAC試紙條選用了0.30 mg/mL抗原噴涂T線(xiàn)，選用0.45 mg/mL抗體標(biāo)記的熒光微球作為檢測(cè)信號(hào)。FIAC試紙條檢測(cè)SDBS靈敏度驗(yàn)證結(jié)果如圖4所示，檢測(cè)結(jié)果顯示不含烷基苯磺酸鈉的結(jié)果，C線(xiàn)和T線(xiàn)都顯熒光。含25 ng/mL烷基苯磺酸鈉的樣品，檢測(cè)線(xiàn)很大程度被抑制。烷基苯磺酸鈉濃度等于或大于50 ng/mL，檢測(cè)線(xiàn)全部被抑制。因此，本FICA試劑對(duì)烷基苯磺酸鈉完全競(jìng)爭(zhēng)抑制的檢測(cè)限是50 ng/mL，完全滿(mǎn)足檢測(cè)油脂中烷基苯磺酸鑒別地溝油的要求。

3.4 FICA試劑檢測(cè)油脂SDBS檢出限的驗(yàn)證結(jié)果

在100 mL油脂的添加不同殘留量的SDBS，使用本研究開(kāi)發(fā)的FICA試劑進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，SDBS添加量為0.5 μg/100 mL和1.0 μg/100 mL的油脂，全部均未檢出陽(yáng)性結(jié)果；SDBS添加量為1.5 μg/100 mL油脂，5個(gè)樣品檢出弱3個(gè)陽(yáng)性結(jié)果，2個(gè)陽(yáng)性結(jié)果；SDBS添加量為2.0 μg/100 mL油脂，5個(gè)樣品全部檢出陽(yáng)性結(jié)果。

圖5 熒光免疫層析試劑(FICA)對(duì)添加梯度SDBS標(biāo)準(zhǔn)品的油脂檢測(cè)限驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)3.3的FICA試劑的檢測(cè)限驗(yàn)證結(jié)果換算，如果PBS溶液對(duì)油脂中的SDBS抽提率為100%，對(duì)試劑油脂的檢出限應(yīng)該是0.5 μg/100 mL。由于SDBS是帶有長(zhǎng)鏈烷烴的表面活性劑，較強(qiáng)的油溶性使其水溶劑抽提率不會(huì)太高[24]，所以FICA試劑對(duì)油脂的檢測(cè)限2.0 μg/100 mL，換算成國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)單位20 μg/kg是合理的。參考高效液相色譜-熒光法測(cè)定地溝油中SDBS的檢出限為1.0 mg/kg[17]，都能夠可靠鑒定地溝油。本實(shí)驗(yàn)研發(fā)的通過(guò)檢測(cè)油脂中SDBS的FIAC試劑，能夠勝任鑒別地溝油的檢測(cè)任務(wù)。

4 結(jié) 論

烷基苯磺酸相對(duì)分子量只有326.49，是只有免疫反應(yīng)性而沒(méi)有免疫原性的半抗原，而其免疫原性主要是“苯磺酸”基團(tuán)。本研究應(yīng)用改良活潑酯法合成突出“苯磺酸”基團(tuán)的人工免疫原，免疫動(dòng)物獲得抗“苯磺酸”抗體。競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)證明抗體對(duì)含“苯磺酸基團(tuán)”的化合物具有良好的親和力，而對(duì)不含“苯磺酸基團(tuán)”的化合物沒(méi)有交叉反應(yīng)性。以該抗體標(biāo)記熒光微球，結(jié)合4-氨基苯磺酸合成的突出“苯磺酸”基團(tuán)的抗原，制備了免疫熒光微球?qū)游?FICA)試紙條，對(duì)SDBS標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最低檢測(cè)限為50 ng/mL，對(duì)添加SDBS油脂的最低檢測(cè)限為20 μg/kg。本實(shí)驗(yàn)研發(fā)的通過(guò)檢測(cè)油脂中SDBS的FIAC試劑，能夠勝任鑒別地溝油的檢測(cè)任務(wù)。