茉莉花JsMYB108轉(zhuǎn)錄因子的原核表達(dá)及蛋白純化

萬(wàn) 超, 鄧婷榕, 胡 莉, 伍炳華, 袁 媛

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002)

茉莉[Jasminumsambac(L). Ait]為木犀科素馨屬常綠灌木，是一種著名的香料植物，在香精提取[1]、花茶窨制[2]、食品和藥品開發(fā)[3-4]等方面有著廣泛的應(yīng)用，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值.常見的茉莉花栽培品種有單瓣茉莉、雙瓣茉莉、多瓣茉莉3種類型，其中，雙瓣茉莉因其產(chǎn)量高、香氣濃郁而成為目前大面積栽培的主要品種[5].前人對(duì)雙瓣茉莉的香氣成分進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)萜類物質(zhì)是雙瓣茉莉的主要香氣成分[6-8]，因此，研究萜類物質(zhì)的合成和調(diào)控對(duì)于茉莉花的香氣、品質(zhì)及分子育種等方面至關(guān)重要.

茉莉花萜類合成途徑中的一些結(jié)構(gòu)基因及其啟動(dòng)子已經(jīng)得到克隆和分離[9-12]，這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有光響應(yīng)、激素響應(yīng)、生物鐘等順式作用元件，表明基因的表達(dá)很可能是受諸多因素調(diào)控的.轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控基因表達(dá)最重要的環(huán)節(jié)之一[13]，其中，MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族是植物轉(zhuǎn)錄因子中數(shù)量最多的家族之一，在許多物種中能參與植物香氣的調(diào)控.如：矮牽牛中MYB轉(zhuǎn)錄因子PhODO1(ODORANT1)可以直接作用于5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(PhEPSPS)基因，調(diào)控香氣合成，同時(shí)，PhODO1還可以與PhEOBⅠ(EMISSION OF BENZENOIDSⅠ)、PhEOBⅡ(EMISSION OF BENZENOIDSⅡ)協(xié)同調(diào)控苯丙烷類香氣代謝[14-16]，另一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子PhMYB4可以通過抑制肉桂酸4-羥化酶(PhC4H1、PhC4H2)基因轉(zhuǎn)錄水平從而調(diào)控花香的釋放[17]；簡(jiǎn)偉[18]通過表達(dá)番茄SlMYB75基因，發(fā)現(xiàn)果實(shí)中的醛類、苯丙烷類和萜類等芳香揮發(fā)物顯著增加；Reddy et al[19]發(fā)現(xiàn)薄荷腺毛特異性R2R3-MYB會(huì)與香葉基焦磷酸合成酶(GPPS)的順式元件結(jié)合并抑制其表達(dá)，在RNAi植株中單萜的釋放量更多，表明其負(fù)調(diào)控萜類的合成.

基于茉莉植株的花、葉轉(zhuǎn)錄組，本試驗(yàn)從花中克隆出一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子JsMYB108，其表達(dá)模式與茉莉香氣釋放規(guī)律一致且與萜烯合成酶基因JsTPS2表達(dá)特征同步，同時(shí)，JsMYB108轉(zhuǎn)錄因子能顯著提高植株莖段愈傷組織中JsTPS2基因的表達(dá)水平[20]，推測(cè)JsMYB108能參與萜烯香氣調(diào)控，但其調(diào)控機(jī)理卻并不明確.為深入理解JsMYB108調(diào)控茉莉香氣的分子機(jī)理，本試驗(yàn)將JsMYB108基因進(jìn)行原核表達(dá)，摸索并優(yōu)化了JsMYB108基因在大腸桿菌中的表達(dá)條件，在此基礎(chǔ)上，對(duì)JsMYB108重組蛋白進(jìn)行純化分離和檢測(cè).本試驗(yàn)結(jié)果可為將來(lái)研究JsMYB108蛋白與JsTPS2基因的互作及篩選JsMYB108互作蛋白提供參考.

1 材料與方法

1.1 植物材料

以雙瓣茉莉3年生植株為材料.取當(dāng)天夜間21：00開放的花朵，用剪刀剪下后用錫箔紙包好投入液氮中速凍,置冰箱(-80 ℃)保存?zhèn)溆?

1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以茉莉花瓣為材料，參照EasyPure?Plant RNA Kit試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書的步驟提取RNA.按照One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書的步驟進(jìn)行第一鏈cDNA的合成.以cDNA為模板，設(shè)計(jì)含有BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物JsMYB108-F(5′-gagagaGGATCCATGGAGCATCATGTTAAAGGAGATGG-3′，下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn))、JsMYB108-R(5′-gagagaGTCGACCTACTGTTGTAGGAAATTCCACATG-3′，下劃線為SalⅠ酶切位點(diǎn))擴(kuò)增JsMYB108的編碼序列.擴(kuò)增體系：1 μL上游引物、1 μL下游引物、12.5 μL FastPfu PCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、8.5 μL H2O、2 μL cDNA.PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min.

使用BamHⅠ和SalⅠ同時(shí)酶切pGEX-4T-1載體和JsMYB108擴(kuò)增產(chǎn)物.酶切體系：1 μLBamHⅠ、1 μLSalⅠ、200 ng PCR產(chǎn)物或1 μg pGEX-4T-1載體、2 μL快切酶緩沖液，用無(wú)菌水補(bǔ)足至10 μL.于37 ℃酶切2 h后回收目的基因片段和酶切后的原核表達(dá)載體，使用T4連接酶于16 ℃連接過夜.連接體系：1.5 μL載體酶切產(chǎn)物、3.5 μL目的基因酶切產(chǎn)物、1 μL T4連接酶、1 μL連接酶緩沖液、3 μL無(wú)菌水.取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，涂布于含50 mg·L-1氨芐的LB平板上，37 ℃下過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，將陽(yáng)性菌液送至福州鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序.

1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

1.3.1 不同IPTG濃度下的誘導(dǎo)表達(dá) 測(cè)序正確的重組質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)后，涂布于含50 mg·L-1氨芐的LB平板上，于37 ℃過夜培養(yǎng).從平板上挑取單克隆至5 mL含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r·min-1過夜培養(yǎng).

取1 mL過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液，加入到50 mL含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)至D600 nm約為0.5時(shí)，加入不同濃度(0.1、0.2、0.5、1.0 mmol·L-1)的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，以不加IPTG的菌液為對(duì)照.各濃度IPTG誘導(dǎo)的菌液均為5 mL，于37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h.

1.3.2 不同溫度下的誘導(dǎo)表達(dá) 將菌液培養(yǎng)至D600 nm約為0.5時(shí)，于0.1 mmol·L-1IPTG、不同溫度(37、28、20 ℃)下進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)結(jié)束后收集菌體.其中，37、28 ℃誘導(dǎo)4 h，20 ℃誘導(dǎo)過夜.

1.4 SDS-PAGE檢測(cè)

于10 000 r·min-1離心1 min后收集誘導(dǎo)后的菌液，用200 μL PBS緩沖液(含8 g·L-1NaCl、0.2 g·L-1KCl、0.24 g·L-1KH2PO4、1.44 g·L-1Na2HPO4)重懸菌體.取50 μL懸菌液加入10 μL 6×Protein loading buffer(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，混勻，沸水浴10 min，于12 000 r·min-1離心5 min.取10 μL上清點(diǎn)樣至10% SDS-PAGE膠(參照北京索萊寶科技有限公司SDS-PAGE試劑盒說明書的步驟制備)上，用InstaBlue protein stain solution(美國(guó)APE BIO公司)染色，用凝膠成像分析儀(美國(guó)BIO RAD公司)觀察結(jié)果.

1.5 重組蛋白可溶性的檢測(cè)

確定JsMYB108可成功誘導(dǎo)表達(dá)后，摸索誘導(dǎo)表達(dá)可溶性蛋白的條件.設(shè)置誘導(dǎo)溫度為37、28、20 ℃，其中，37、28 ℃誘導(dǎo)4 h，20 ℃誘導(dǎo)過夜.誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后用2 mL PBS緩沖液重懸菌體，取50 μL懸菌液加入10 μL 6×Protein loading buffer，剩余菌液使用冰浴超聲破碎2 min后于12 000 r·min-1離心5 min.取50 μL上清加入10 μL 6×Protein loading buffer，沉淀用1.95 mL PBS重懸后取50 μL加入10 μL 6×Protein loading buffer.將以上樣品沸水浴10 min，于12 000 r·min-1離心5 min，采用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的可溶性.

1.6 JsMYB108蛋白的大量誘導(dǎo)及純化

1.6.1 誘導(dǎo) 基于上述誘導(dǎo)溫度的選擇，取5 mL過夜培養(yǎng)的菌液加入到500 mL含50 mg·L-1氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床培養(yǎng)至D600 nm約為0.5后，加入500 mmol·L-1IPTG至終濃度為0.1 mmol·L-1，于20 ℃過夜誘導(dǎo)后收集全部菌體.使用30 mL Binding buffer(含1×PBS、1% Triton X-100)重懸菌體，加入100 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)至終濃度為1 mmol·L-1，冰浴超聲破碎10 min(功率50%，每超聲10 s休息10 s).超聲結(jié)束后于4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min.

1.6.2 純化 將離心后的蛋白上清加入到GST預(yù)裝親和樹脂層析柱(上海生工生物工程股份有限公司)中，控制流速為0.5～1 mL·min-1，收集流出液；待上清全部過柱后，用5 mL Binding buffer(含1×PBS、1% Triton X-100)清洗層析柱，收集流出液；用Elute buffer(含50 mmol·L-1Tris、5 mmol·L-1GSH)配制濃度分別為10、20、30 mmol·L-1的還原型谷胱甘肽(GSH)溶液，用于洗脫的每個(gè)GSH體積為5 mL，收集洗脫液，用于SDS-PAGE檢測(cè).

1.7 重組蛋白的Western blotting檢測(cè)

取50 μL純化后的重組蛋白加入10 μL 6×Protein loading buffer，沸水浴10 min；于12 000 r·min-1離心5min，取10 μL上清點(diǎn)樣至10% SDS-PAGE膠上.電泳結(jié)束后將凝膠用Trans blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)BIO RAD公司)轉(zhuǎn)移至NC膜(美國(guó)Ge. Healthcare公司)上，用5%脫脂牛奶室溫封閉3 h；使用GST單克隆抗體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)于4 ℃孵育過夜，用PBST(含1×PBS、1‰ Tween 20)洗膜30 min；使用HRP標(biāo)記的GST抗體于室溫下孵育1 h，用PBST(含1×PBS、1‰ Tween 20)洗膜30 min.洗膜結(jié)束后于膜上滴加2 mL eECL顯色液(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，用凝膠成像分析儀觀察結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 pGEX-4T-1-JsMYB108原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以茉莉花cDNA為模板，JsMYB108-F和JsMYB108-R為引物，擴(kuò)增獲得長(zhǎng)約900 bp的特異性條帶(圖1A)，與預(yù)期大小相符，測(cè)序長(zhǎng)度為864 bp，與JsMYB108編碼序列相符.回收擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切后進(jìn)行回收，結(jié)果(圖1B)顯示回收成功.

A：JsMYB108基因編碼序列的擴(kuò)增；B：JsMYB108基因酶切回收后的產(chǎn)物(M：DL2000 Marker).

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，取單克隆使用載體上的測(cè)序引物(F:5′-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGT-3′，R:5′-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3′)進(jìn)行PCR鑒定，獲得約1 100 bp的片段(圖2)，測(cè)序顯示序列正確，表明pGEX-4T-1-JsMYB108重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

M：DL2000 Marker；1～5：陽(yáng)性條帶.

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

2.2.1 IPTG濃度對(duì)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響 將轉(zhuǎn)化了pGEX-4T-1-JsMYB108質(zhì)粒的大腸桿菌于37 ℃、不同濃度(0.1、0.2、0.5、1.0 mmol·L-1)IPTG下誘導(dǎo)4 h.結(jié)果(圖3)顯示：與對(duì)照相比，4個(gè)濃度IPTG誘導(dǎo)后的菌液均在55 ku附近出現(xiàn)一條差異條帶(59 ku)，與預(yù)期的重組蛋白大小相符，表明JsMYB108能在大腸桿菌中成功表達(dá)；4個(gè)濃度IPTG誘導(dǎo)下的蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異，說明IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響.

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1：未誘導(dǎo)的菌體蛋白；2、3、4、5分別為0.1、0.2、0.5、1.0 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)下的菌體蛋白.

2.2.2 溫度對(duì)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響 設(shè)定IPTG濃度為0.1 mmol·L-1，分別于37、28、20 ℃下進(jìn)行誘導(dǎo)，其中，37、28 ℃誘導(dǎo)4 h，20 ℃誘導(dǎo)過夜.SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果(圖4)顯示：37、28、20 ℃下JsMYB108重組蛋白均能成功表達(dá)，表明37、28、20 ℃這3種溫度均可誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，且表達(dá)量無(wú)顯著差異(圖4).

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3、5:未誘導(dǎo)的菌體蛋白；2、4、6分別為在28、37、20 ℃下用0.1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)的菌體蛋白.

2.3 重組蛋白的可溶性檢測(cè)

分別于37、28、20 ℃誘導(dǎo)JsMYB108表達(dá)，將誘導(dǎo)表達(dá)所得的菌液超聲破碎后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)37 ℃誘導(dǎo)下的重組蛋白主要存在于沉淀中，28 ℃誘導(dǎo)下的重組蛋白在上清中的含量較少(圖5A).20 ℃誘導(dǎo)下，重組蛋白在上清中的含量比37、28 ℃更高(圖5B)，表明20 ℃適合后續(xù)大量誘導(dǎo)和純化.

A：28、37 ℃下用0.1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)的重組蛋白在上清和沉淀中的表達(dá)情況(M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、5:未誘導(dǎo)的菌體蛋白；2、3、4分別為在28 ℃下用0.1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)的菌體蛋白、上清、沉淀；6、7、8分別為在37 ℃下用0.1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)的菌體蛋白、上清、沉淀)；B：20 ℃下用0.1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)的重組蛋白在上清和沉淀中的表達(dá)情況(M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：未誘導(dǎo)的菌體蛋白；2、3、4分別為在20 ℃下用0.1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)的菌體蛋白、上清、沉淀).

2.4 重組蛋白的大量誘導(dǎo)和純化

基于以上誘導(dǎo)溫度的選擇，在20 ℃下對(duì)重組蛋白進(jìn)行大量誘導(dǎo)，取上清進(jìn)行蛋白純化.上清中的蛋白經(jīng)過GST親和樹脂層析柱吸附后，依次使用10、20、30 mmol·L-1GSH進(jìn)行洗脫.不同濃度GSH洗脫后的洗脫液經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)顯示，用20 mmol·L-1GSH洗脫后，重組蛋白能被成功洗脫，條帶較為單一(圖6)，表明重組蛋白成功純化.

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:未誘導(dǎo)的菌體蛋白；2：0.1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)后的菌體蛋白；3：超聲破碎后的菌體蛋白上清；4：流出液；5：洗滌液；6、7、8分別為用10、20、30 mmol·L-1 GSH洗脫后的重組蛋白.

2.5 純化蛋白的Western blotting檢測(cè)

純化后的JsMYB108重組蛋白采用GST單克隆抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè).結(jié)果表明，純化后的重組JsMYB108蛋白與GST單克隆抗體有雜交條帶，且條帶大小與實(shí)際相符合(圖7).說明純化后的蛋白為JsMYB108重組蛋白.

M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1為JsMYB108重組蛋白與GST抗體雜交后的條帶.

3 討論

蛋白質(zhì)廣泛參與多種生命活動(dòng)，研究蛋白質(zhì)的功能，體外獲得蛋白至關(guān)重要.原核表達(dá)是生物工程領(lǐng)域用于體外獲得蛋白常用的手段之一，目的基因能否在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)受到多種因素影響，如基因本身特性、溫度、表達(dá)菌株等[21-22].高溫誘導(dǎo)時(shí)，大腸桿菌生長(zhǎng)速度較快，蛋白更容易形成包涵體[23].本試驗(yàn)結(jié)果表明，JsMYB108重組蛋白是否能成功表達(dá)與IPTG濃度無(wú)顯著關(guān)系，因此在確定重組蛋白能成功表達(dá)后，為純化JsMYB108重組蛋白，需盡可能地使其在上清中富集.通過比較JsMYB108融合蛋白在20、28、37 ℃下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在37 ℃誘導(dǎo)條件下，重組蛋白主要在包涵體中，相比28 ℃的誘導(dǎo)條件，20 ℃下誘導(dǎo)的重組蛋白在上清中的含量更高，這更有利于純化重組蛋白.常用的原核表達(dá)載體標(biāo)簽有GST、His、HA等，GST標(biāo)簽?zāi)芴岣吣康牡鞍椎目扇苄訹24]，有利于重組蛋白的表達(dá)和純化.本試驗(yàn)在前期研究中，曾用PQE30(His標(biāo)簽)進(jìn)行JsMYB108的表達(dá)，但并未成功，后期換用pGEX-4T-1載體后，成功表達(dá)并純化了GST-JsMYB108重組蛋白.玉米ZmAGO18b基因構(gòu)建到pET-28a中能夠被誘導(dǎo)表達(dá)，而構(gòu)建到pGEX-6p載體后基本沒有檢測(cè)到目的蛋白[25]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相反，可能與基因本身的特性有關(guān).

轉(zhuǎn)錄因子在植物次生代謝方面具有重要的調(diào)控作用，其可以與基因啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)[26]，因此，體外獲得轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于研究其對(duì)基因的調(diào)控機(jī)理有著重要意義.本試驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，JsMYB108能顯著提高茉莉花JsTPS2基因轉(zhuǎn)錄水平，推測(cè)JsMYB108可能直接作用于JsTPS2基因啟動(dòng)子，這需要后期利用凝膠阻滯(EMSA)試驗(yàn)做進(jìn)一步分析，本試驗(yàn)中JsMYB108重組蛋白的成功獲得可為這些研究提供參考.

GST沉淀技術(shù)在篩選互作蛋白及研究蛋白互作方面有著廣泛的應(yīng)用.如：李褚喆等[27]和樊晶等[28]應(yīng)用GST沉淀技術(shù)分別驗(yàn)證了擬南芥AtARRE與ABI5蛋白、RCARs與UGT7186蛋白的相互作用；原貴波等[29]利用GST沉淀技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)，篩選出37個(gè)番茄SIVQ6互作蛋白，祁靜靜等[30]利用相同的技術(shù)篩選出17個(gè)與柑橘抗?jié)儾∞D(zhuǎn)錄因子CsAP2-09特異性結(jié)合的蛋白.本試驗(yàn)獲得了GST-JsMYB108蛋白，也可為篩選茉莉花中其他與JsMYB108轉(zhuǎn)錄因子互作的蛋白提供參考.