外施褪黑素對干旱脅迫的長序榆光合與碳氮磷積累及其化學計量比的影響1)

洪震洪琮浩徐艷 閆道良

(華東藥用植物園科研管理中心，麗水，323000)(北京林業(yè)大學)(省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室(浙江農(nóng)林大學))

由于人類活動的深刻影響及降雨頻率的總體偏少，導致干旱在全球范圍內發(fā)生的頻次和程度在加劇[1]。干旱脅迫是影響植物生理行為和生長的一個關鍵限制因子，可以影響植物的許多代謝和生理過程，其中干旱脅迫影響到的主要生理過程是光合作用[2]，干旱可以引起氣孔導度降低及關閉，顯著降低植物的光合作用和碳匯功能[3]，因此干旱脅迫是限制植物乃至陸地生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的主要環(huán)境因子。

長序榆(Ulmuselongata)隸屬榆科(Ulmaceae)榆屬(Ulmus)，落葉喬木，是我國特有的極小種群物種之一，同時，也是優(yōu)質的材用和造林樹種，并具有重要的科研價值，被列為國家Ⅱ級保護植物[4]。近年來，除了加大對長序榆的生境保護之外，人為繁育并擴大種群數(shù)量是加強長序榆保護和利用的重要舉措[5]。調查中發(fā)現(xiàn)，在栽培長序榆過程中，干旱脅迫尤其是脆弱階段的幼苗期遭遇干旱是影響長序榆正常生長發(fā)育的主要限制因子。同時，對長序榆進行水分適應性研究表明，長序榆更適宜生長在濕潤環(huán)境中，其在幼苗期的光合作用對水分缺失較敏感[6]，土壤水分缺少引起的干旱脅迫是長序榆生長的限制因子，因此，提高長序榆苗期的抗旱能力具有重要的理論和實踐意義。褪黑素是具有生理調節(jié)作用的小分子物質，可誘導植物提高對多種非生物脅迫的抵抗性[7]。眾多文獻研究報道集中在經(jīng)濟作物和蔬菜方面，如外源褪黑素緩解經(jīng)濟作物大豆對干旱及低溫的脅迫[8-9]，促進鹽漬黃瓜幼苗的生長等[10]。在林業(yè)生產(chǎn)中，林木同樣會面對各種非生物脅迫，研究表明，褪黑素對提高干旱脅迫下北美紅櫟葉片的抗氧化酶活性，消除積累的活性氧能力等方面具有明顯的作用[11]。因此，本文以1年生長序榆實生幼苗為研究材料，以聚乙二醇6000(PEG)模擬干旱脅迫，通過葉面噴施褪黑素溶液，測定了長序榆葉片表觀形態(tài)及植株生物量積累、光合作用主要參數(shù)、有機碳物質積累及對氮磷的積累和他們之間的計量關系，探討外源褪黑素對干旱脅迫下長序榆幼苗發(fā)育的緩解效應，以期為褪黑素的開發(fā)利用和長序榆的抗性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

長勢一致的1年生長序榆實生苗，株均高為(20±2.5)cm。把營養(yǎng)缽中的試驗小苗于4月中旬移栽進口徑為18 cm、高為20 cm的黑色塑料缽中，每塑料缽內裝有等量的混合基質河沙和蛭石(V(河沙)：V(蛭石)=3∶2)作為定植基質，每缽定植1株，緩苗2周后進行試驗處理。模擬干旱脅迫使用的試劑為PEG，處理液為用1/2MS營養(yǎng)液(大量元素)配制不同質量分數(shù)的PEG(質量分數(shù)0、10%和20%)作為模擬干旱脅迫的梯度，于干旱脅迫前3 d，每天19:00—19:30均勻足量葉面噴施濃度為100 μmol/L的褪黑素(褪黑素濃度的配置及干旱梯度設置，均經(jīng)過預試驗)。試驗設置6個處理組：CK(對照，營養(yǎng)液澆灌+葉面噴施自來水)、M(營養(yǎng)液澆灌+葉面噴施褪黑素)、P10(中度干旱，10% PEG澆灌)、MP10(葉面噴施褪黑素+10% PEG澆灌)、P20(重度干旱，20% PEG澆灌)和MP20(葉面噴施褪黑素+20% PEG澆灌)，每組5個重復，共30株小苗。干旱脅迫處理后，每隔3 d噴施1次褪黑素，共噴施5次，每隔5 d澆灌1次處理液，直到試驗結束。為保證基質內處理液的穩(wěn)定，每次澆灌足量的處理液，直到缽底有一定量的液體流出為準。所有處理的試驗材料至于室外自然條件下生長，上罩一層70%透光率的遮陽網(wǎng)，遇雨遮擋。處理45 d后采樣測定，分離根、莖、葉，烘干至恒質量測定生物量。

1.1 生長及光合指標測定

用千分之一電子秤稱量根和葉質量。選取葉位一致的長序榆葉片，利用Li-6400便攜式光合測定系統(tǒng)(LI-COR,Inc.,Lincoln,USA)測定葉片氣體交換參數(shù)。測定時間為上午08:00—11:00，測定時的葉室溫度設置為室外生長溫度，約(24±3)℃，葉室CO2摩爾分數(shù)約為400 μmol·mol-1，葉室氣體流速為500 μmol·s-1，光合有效輻射(PAR)為720 μmol·m-2·s-1。測定的氣體交換參數(shù)包括葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導度(C)、胞間CO2摩爾分數(shù)(Ci)和蒸騰速率(T)等。每個處理選5枚葉片，5次重復測定，并計算植物葉片的水分利用效率(WUE)=Pn/T。

1.2 碳氮磷與可溶性糖和淀粉測定

把長序榆的根、葉分開后置于烘箱內105 ℃殺青30 min，然后用烘箱70 ℃烘干至恒質量，粉碎、過篩處理后進行元素測定，分別用重鉻酸鉀-外加熱法、凱氏定氮法、鉬銻抗比色法，測定根、葉的有機碳、全氮、全磷的質量分數(shù)，可溶性糖和淀粉質量分數(shù)測定采用蒽酮比色法，非結構性碳水化合物質量分數(shù)=可溶性糖質量分數(shù)+淀粉質量分數(shù)。各指標均是5株重復處理樣本的統(tǒng)計值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗中所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel、SIGMAPLOT 12.5軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。使用鄧肯法進行多重比較(P<0.05)。所有數(shù)據(jù)是5次重復數(shù)據(jù)的“均值±標準差”。

2 結果與分析

2.1 外施褪黑素對干旱脅迫下長序榆葉片形態(tài)及生物量積累的影響

由圖1可見，施加PEG后，長序榆葉片受到不同程度的干旱傷害。10% PEG處理下，僅葉尖和葉緣受到輕微傷害。20% PEG處理下，葉片受損嚴重，邊緣1/2以上面積出現(xiàn)黃化失綠。噴施褪黑素后，有效地保護了干旱脅迫對長序榆葉片造成的損傷，黃化面積明顯減少。

由表1可見，中度干旱對葉和根生物量的積累沒有明顯的抑制作用，高度干旱則顯著降低了葉生物量的積累。施加褪黑素后，減輕了干旱對葉和根生物量積累的抑制作用，尤其在高度干旱脅迫下，褪黑素施加后明顯減緩了干旱對根生長的抑制作用，這說明了干旱脅迫下施加褪黑素增強了根生物量的積累，對于維持根正常功能的發(fā)揮有重要的意義。

圖1 干旱脅迫時噴施褪黑素的長序榆葉片形態(tài)特征

表1 干旱脅迫時噴施褪黑素的長序榆生長情況 g·株-1

2.2 外施褪黑素對干旱脅迫下長序榆光合特性的影響

由表2可見，與對照相比，施加褪黑素顯著提高了長序榆的凈光合速率Pn，而干旱脅迫則明顯降低了長序榆的Pn。施加褪黑素后，Pn和水分利用效率WUE雖有所增加，但和未施加相比，差異并不明顯。與對照相比，干旱脅迫顯著提高了長序榆的胞間二氧化碳濃度Ci。施加褪黑素后明顯降低了輕度脅迫下的Ci，但并不能明顯降低重度干旱脅迫下的Ci。相反，氣孔導度在干旱脅迫下明顯降低，施加褪黑素后雖然氣孔導度有所提高，但并不能明顯提高干旱脅迫下的氣孔導度(表3)。

表2 干旱脅迫時噴施褪黑素的長序榆凈光合速率、水分利用效率和胞間CO2摩爾分數(shù)

由表3可見，干旱脅迫顯著增加了氣孔限制值(Ls)，重度脅迫下Ls達到最高。施加褪黑素后，明顯降低了中度干旱脅迫下的Ls，但并沒有明顯影響重度干旱脅迫下的Ls。與對照相比，干旱脅迫明顯抑制了長序榆的蒸騰速率(Trmmol)，施加褪黑素后雖然對Trmmol的影響有所提高，但并不明顯。

表3 干旱脅迫時噴施褪黑素的長序榆氣孔導度、氣孔限制值和蒸騰速率

2.3 外施褪黑素對干旱脅迫下長序榆碳水化合物質量分數(shù)的影響

對干旱脅迫下的長序榆研究表明，褪黑素顯著降低了干旱脅迫下長序榆根中可溶性總糖質量分數(shù)，如P10、P20處理下施加褪黑素比未施加的根中可溶性總糖質量分數(shù)分別下降了24.94%和34.33%，褪黑素對重度干旱脅迫下葉中可溶性總糖質量分數(shù)沒有明顯影響，相反，葉中的總淀粉質量分數(shù)則顯著增加，分別比未施加褪黑素提高了26.07%和23.28%。MP10處理下根中的總淀粉質量分數(shù)比P10增加了15.63%，MP20處理下卻比P20處理下總淀粉質量分數(shù)表現(xiàn)明顯下降(表4)。

表4 噴施褪黑素時長序榆可溶性總糖和淀粉質量分數(shù)

由表5可見，與對照相比，施加褪黑素顯著降低了葉中的非結構性碳水化合物質量分數(shù)，而MP20處理下非結構性碳水化合物質量分數(shù)卻比P20處理下提高了13.99%。在根中，MP10處理比P10處理下非結構性碳水化合物質量分數(shù)提高了7.80%，MP20處理下的非結構性碳水化合物質量分數(shù)卻顯著低于P20處理下的非結構性碳水化合物質量分數(shù)。以上結果說明，干旱脅迫下長序榆根和葉對褪黑素處理后非結構性碳水化合物質量分數(shù)積累存在各異。

表5 噴施褪黑素時長序榆非結構性碳水化合物質量分數(shù)

2.4 外施褪黑素對干旱脅迫下長序榆碳氮磷及其計量關系的影響

本研究通過對干旱脅迫下施加褪黑素對長序榆C、N、P元素在葉和根的含量及w(C)∶w(N)、w(C)∶w(P)和w(N)∶w(P)的計量特征不僅與器官有關，而且對褪黑素施加后的響應也存在差異。和對照相比，施加褪黑素明顯提高了葉和根中的C質量分數(shù)，施加褪黑素沒有影響P10脅迫下的C質量分數(shù)，卻顯著提高了P20脅迫下的C質量分數(shù)。干旱脅迫下，施加褪黑素后，提高了葉中的N和P質量分數(shù)，卻明顯降低了根中的N和P質量分數(shù)(表6)，這對于光合作用器官葉來說，維持N、P的穩(wěn)定，有利于葉發(fā)揮正常的生理代謝功能。

表6 噴施褪黑素時長序榆碳氮磷質量分數(shù)

與正常生長條件相比，植物在逆境下對元素的利用具有較高的效率，也即植物吸收單位的N、P，則會有更高的碳水化合物合成，表現(xiàn)為w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值提高，反之亦然。本研究結果表明，和對照相比，P10、P20干旱脅迫顯著提高了長序榆葉的w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值，而顯著降低了根中的w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值。在葉中，MP10、MP20處理下的w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值分別相比P10、P20來說，則有不同程度的降低，說明褪黑素對長序榆的干旱脅迫具有不同程度的緩解效應，同時，施加褪黑素后，w(N)∶w(P)比值表現(xiàn)不同程度的下降(表7)。從表7中還可以看出，干旱脅迫下，施加褪黑素使根中的w(C)∶w(N)、w(C)∶w(P)比值均表現(xiàn)不同程度的提高，這有利于根系積累更多的能量物質以吸收N、P供給葉片的需要。

表7 噴施褪黑素時長序榆碳氮磷間計量關系

3 討論與結論

植物的形態(tài)特征與生物量積累是植物響應外界環(huán)境變化的最直接表現(xiàn)。在干旱脅迫下，植物往往通過降低株高，減少葉面積、增加根生物量等策略來維持自身的生長發(fā)育[12]。通過PEG模擬的干旱脅迫表明，長序榆的葉片隨著脅迫程度的不斷增加，黃化現(xiàn)象越嚴重，這會直接影響葉片功能的正常發(fā)揮，導致植株的生長發(fā)育受到抑制。噴施褪黑素后緩解了干旱脅迫下葉片的黃化現(xiàn)象，同時減輕了干旱對葉和根生物量積累的抑制作用，尤其在重度干旱脅迫下，對長序榆的根生物量積累的抑制有明顯的緩解作用，說明外源褪黑素對干旱脅迫下植物生長策略的改變具有一定的解除作用，從而有效緩解干旱脅迫對長序榆生長發(fā)育的抑制作用。這與施加外源褪黑素能有效緩解干旱脅迫對葉綠素的破壞作用，提高植物光合作用，延緩葉片衰老，促進根系生長及代謝產(chǎn)物積累的研究相一致[11，13-16]。

光合作用是植物碳物質合成，促進植物生長發(fā)育和根、莖、葉等各構件形成的物質和能量基礎，是綠色植物體重要的代謝過程。植物受到干旱脅迫會關閉氣孔，減少水分蒸騰，同時也阻止了外界CO2進入細胞，植物的光合碳固定能力下降，最終使植物的生長受到抑制[17]。本試驗研究表明，長序榆在正常生長條件下，施加褪黑素明顯提高了葉片的凈光合速率，而在干旱脅迫下施加褪黑素沒有明顯提高葉片的凈光合速率和水分利用效率。本研究還發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，胞間二氧化碳摩爾分數(shù)均比對照有明顯增加，這與對大豆進行干旱脅迫導致胞間二氧化碳摩爾分數(shù)下降的研究結果并不一致[16]，說明極小種群植物長序榆可能存在與大豆等植物適應干旱脅迫下不同的CO2來源機制(非氣孔因素)，值得進一步深入研究。同時，施用褪黑素均能提高葉片氣孔導度，降低氣孔限制值，從而有利于胞間二氧化碳摩爾分數(shù)的積累，提高CO2吸收速率及碳物質固定能力，表明施用褪黑素可以緩解干旱導致氣孔因素影響CO2吸收的限制，促進長序榆碳同化能力的增強。

植物光合碳同化過程中形成的碳水化物是植物基礎的代謝物質和最主要的滲透調節(jié)物質，同時也與植物對逆境的生存策略密切相關，這類碳水化物主要包括可溶性總糖和淀粉[18]。它們累積量的大小可以很好地反映植物體內碳供應與碳需求的平衡關系[19]。研究表明，樹體不同器官通過調配可溶性總糖和淀粉相對含量以適應環(huán)境及季節(jié)變化[20]。本研究結果表明，干旱脅迫沒有明顯影響長序榆葉片的可溶性總糖質量分數(shù)，顯著降低了葉片中的淀粉含量，但干旱脅迫明顯增加了根部的可溶性總糖質量分數(shù)，顯著降低了其中的淀粉含量，說明干旱脅迫下長序榆可能通過促進葉片和根內的淀粉向可溶性總糖轉化，以平衡呼吸作用等生理過程對可溶性總糖的消耗，借以調節(jié)體內細胞的滲透勢和水分平衡來適應干旱環(huán)境。噴施褪黑素后明顯降低了干旱脅迫下根中可溶性總糖質量分數(shù)。在干旱脅迫下，淀粉質量分數(shù)的變化表現(xiàn)為褪黑素施加后葉片中含量增加，根中則表現(xiàn)低質量分數(shù)脅迫(P10)提高，高質量分數(shù)(P20)脅迫降低的現(xiàn)象，說明外源施加褪黑素可能通過調節(jié)葉片和根中的可溶性總糖和淀粉的相對含量，維持葉片和根的不同生理功能，研究結果有助于加深理解外源褪黑素通過碳調配機制緩解干旱對長序榆的不利影響。

非結構性碳水化合物的含量可反映植物的碳供給狀況，是植物抵御干旱和應對干旱脅迫的生存策略[21]。在干旱脅迫下，非結構性碳水化合物在根、莖、葉中的分配格局是植物對環(huán)境適應能力的綜合體現(xiàn)[22]。本研究表明，干旱脅迫降低了根、葉中的非結構性碳水化合物質量分數(shù)，施加褪黑素提高了干旱脅迫下葉中的非結構性碳水化合物質量分數(shù)和中度干旱脅迫下(P10)根中的非結構性碳水化合物質量分數(shù)，總碳質量分數(shù)在施加褪黑素后根、葉中均有所增加，說明外源褪黑素通過增強干旱脅迫下長序榆葉片的凈光合速率以維持葉片的碳源功能，同時把適量的碳源向根轉移，使根中的總碳質量分數(shù)增加，確保根系的生理代謝功能以吸收更多的水分來適應干旱。

N、P是植物生長發(fā)育的重要大量元素，也是蛋白質、核酸等主要大分子物質的結構成分。在正常情況下，植物體內的N、P質量分數(shù)及其化學計量關系維持在一個穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。在干旱脅迫下，植物通過調節(jié)碳氮同化、分配和轉移，以此適應環(huán)境的脅迫[23]。研究表明，施用褪黑素能夠促進‘夏黑’葡萄對N和其他微量元素的吸收[24]，從而提高植物對干旱等不良環(huán)境的抗性。本研究中，干旱脅迫降低了葉片中N、P質量分數(shù)，增加了根中N、P質量分數(shù)，表明干旱脅迫會改變N、P在根、葉中的分配，把更多的養(yǎng)分元素轉移至根，增強植物對干旱環(huán)境的適應。干旱脅迫下噴施褪黑素提高了長序榆葉片對N、P元素的吸收，但卻降低了根中N、P質量分數(shù)，這有助于葉片正常光合功能的發(fā)揮，提高光合效率，增加光合碳物質的積累，緩解干旱脅迫對長序榆的損傷。w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)可以反映植物對N、P的利用效率，在逆境下植物對N、P的利用效率往往高于正常生長情況下的[25]。本研究表明，干旱脅迫下，葉片中的w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值均有不同程度的提高，根中w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值則表現(xiàn)相反的情況，說明葉片作為植物的主要光合器官，通過對N、P的高效利用，以積累更多的碳物質用于呼吸等重要的生理過程，保證新陳代謝過程碳物質及能量的供給。在干旱脅迫下施加褪黑素w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值在根、葉呈現(xiàn)不同的變化。葉中的w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值在中度干旱脅迫下均表現(xiàn)明顯下降的趨勢。而重度干旱脅迫下，兩者的比值的變化并不明顯；在根中，w(C)∶w(N)比值均表現(xiàn)明顯增加，C∶P比值則是在中度干旱脅迫下表現(xiàn)增加，而重度干旱脅迫下同樣沒有明顯的變化。本研究結果表明，褪黑素通過調控N、P在根、葉中的分配及各器官對它們的利益效率，調控植物對干旱脅迫的適應。對于褪黑素在代謝組水平及分子水平對干旱調控的作用機制有待于下一步深入研究。

綜上所述，干旱脅迫下，長序榆的生長受到不同程度的抑制。葉片噴施褪黑素能通過保護葉綠素，提高凈光合速率緩解干旱脅迫對生長的抑制作用；施加褪黑素后調節(jié)了根、葉中可溶性糖和淀粉含量的再分配，葉中的N、P質量分數(shù)增加，w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值降低，相反，根中的N、P下降，w(C)∶w(N)和w(C)∶w(P)比值升高，褪黑素施加后通過調節(jié)根、葉中N、P的利用效率，緩解干旱脅迫對長序榆的抑制作用。