脫落酸通過提高抗氧化酶活性與基因表達(dá)參與富氫水增強(qiáng)番茄幼苗抗旱性

閆 梅，姚彥東，牟開萍，淡媛媛，李偉泰，廖偉彪

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

氫氣(H)作為一種新型氣體信號分子參與植物的生長發(fā)育過程。Zhu等觀察到H可促進(jìn)黃瓜不定根發(fā)生。同樣地，研究發(fā)現(xiàn)，50%富氫水(HRW)處理可顯著增加黃瓜幼苗的株高、莖粗、鮮重和葉面積。此外，H還可響應(yīng)植物非生物脅迫，并在植物抵御逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。Chen等研究表明，H可緩解黃瓜在干旱脅迫下誘導(dǎo)的氧化性損傷和植物生長抑制。脫落酸(ABA)是一種存在于植物體內(nèi)的具有倍半萜結(jié)構(gòu)的內(nèi)源植物激素，具有抑制細(xì)胞分裂，促進(jìn)葉和果實(shí)衰老和脫落等作用。研究表明，ABA作為一種脅迫響應(yīng)因子參與多種非生物脅迫響應(yīng)。在干旱脅迫下，60 μmol·LABA處理可通過降低細(xì)胞膜透性，提高過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)及谷胱甘肽還原酶(GR)活性來增強(qiáng)獼猴桃的抗旱性。

目前，關(guān)于H和ABA參與響應(yīng)植物非生物脅迫方面已有文獻(xiàn)報(bào)道，但關(guān)于兩者關(guān)系鮮有報(bào)道。在擬南芥中，外源ABA可誘導(dǎo)H的產(chǎn)生和釋放，而外源HRW則有效地提高了細(xì)胞內(nèi)H的產(chǎn)量，促進(jìn)氣孔關(guān)閉，從而增強(qiáng)擬南芥的抗旱性。隨后，Jin等研究發(fā)現(xiàn)，H可通過ABA影響紫花苜蓿葉片的質(zhì)外體pH和氣孔關(guān)閉。而關(guān)于H和ABA在響應(yīng)脅迫中的作用及關(guān)系鮮見文獻(xiàn)報(bào)道，尤其是關(guān)于兩者緩解植物干旱脅迫的機(jī)制和相互關(guān)系有待進(jìn)一步揭示。因此，本試驗(yàn)以番茄(L. cv. Micro-Tom)為試材，用PEG模擬干旱脅迫，研究外源HRW和ABA對干旱脅迫下番茄幼苗的影響及兩者的關(guān)系，為研究H和ABA調(diào)控植物抗旱提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)所用的番茄品種為Micro-Tom，購于海明公司。取適量籽粒飽滿、大小一致的Micro-Tom番茄種子用5%的次氯酸鈉消毒10 min，后放入溫水中浸泡6 h，在濾紙含無菌蒸餾水的培養(yǎng)皿中萌發(fā)。將萌發(fā)的番茄種子種于帶有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿，2 d后將幼苗種植于1/2 Hoagland營養(yǎng)液中，7 d后更換為全Hoagland營養(yǎng)液，每7 d更換一次營養(yǎng)液，更換3次后選擇整齊、大小一致的健壯幼苗進(jìn)行后續(xù)處理。參照Khanzada等的方法選取聚乙二醇6000(PEG-6000)模擬干旱濃度為15%；配置成濃度為50 μmol·L的氟啶酮(FLU，ABA合成抑制劑)溶液進(jìn)行葉面噴施。HRW濃度篩選設(shè)置6個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，分別為對照(CK)、PEG、25%、50%、75%、100%(HRW 根施)；ABA濃度篩選設(shè)置6個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，分別為對照(CK)、PEG、50、100、150、200 μmol·L(ABA葉面噴施)。從以上處理中篩選出抗旱性較好的最適HRW和ABA濃度后；接下來的試驗(yàn)中HRW和ABA單獨(dú)或者共同使用，即對照(CK)、PEG、PEG+HRW、PEG+ABA、PEG+HRW+ABA、PEG+HRW+FLU和FLU；處理6 d后，在上午9：00—10：00采集各處理植株第3、4功能葉片用于后續(xù)試驗(yàn)指標(biāo)的測定，重復(fù)3次，求平均值。生長室光照強(qiáng)度為200 μmol·m·s，白天(25±2)℃保持14 h，夜間(20±2)℃保持10 h。

1.2 富氫水的制備

使用本實(shí)驗(yàn)室的制氫儀(QL-300，賽克賽斯)制備飽和氫氣。H以300 mL·min的流速在裝有1 L蒸餾水的容量瓶中持續(xù)通入30 min，即可得到飽和的富氫水(HRW)。在本試驗(yàn)中用便攜式測氫儀(Trustlex Co；Led，ENH-1000，日本)測定表明，HRW中H的濃度為0.45 mmol·L。

1.3 指標(biāo)測定

在試驗(yàn)6 d結(jié)束時(shí)分別采用直尺和游標(biāo)卡尺測量株高和莖粗，用分析天平稱量鮮重和干重。ABA含量測定采用高效液相色譜法，ABA的提取參照張玉瓊等的方法，略有改動(dòng)。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法測定，過氧化氫酶(CAT)活性用紫外吸收法測定，抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性是通過記錄抗壞血酸在290 nm處的氧化速率來測定。

用TaKaRa植物總RNA抽提純化試劑盒提取總RNA，之后以總RNA為模板，采用寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測、、和的基因表達(dá)量。以番茄作為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系為20 μL：2 μL cDNA，上下游引物共2 μL，10 μL 2×SYBR Green Master Mix SYBR，6 μL ddHO。引物序列如表1所示，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，50個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。基因相對表達(dá)水平用2-ΔΔC方法進(jìn)行分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量引物序列

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、制圖，采用Duncan檢驗(yàn)對各處理間的差異顯著性進(jìn)行分析(<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2對干旱脅迫下番茄幼苗生長的影響

從圖1可見，PEG處理對番茄幼苗株高、莖粗、鮮重和干重的增長具有顯著的抑制作用，主要表現(xiàn)為PEG處理的番茄幼苗株高、莖粗、鮮重和干重顯著低于對照。干旱脅迫下，25%、50%、75%和100% HRW處理6 d的番茄幼苗株高顯著高于PEG處理，其中75% HRW處理的番茄幼苗株高較PEG處理最顯著，較PEG處理顯著增加13.3%(圖1-A)。干旱脅迫6 d后，25%、50%和100% HRW處理的莖粗與PEG處理無顯著差異，而75% HRW處理的莖粗顯著大于PEG處理。與PEG處理相比，25%和75% HRW處理的番茄幼苗鮮重和干重顯著增加，其中75% HRW處理的干重較PEG處理顯著增加了20.8%(圖1-B)。因此，75% HRW作為提高番茄幼苗抗旱性的最適濃度用于后續(xù)試驗(yàn)。

同一指標(biāo)不同處理間沒有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。The bars of the same index with different letters showed the significant difference (P<0.05). The same as below.圖1 富氫水對干旱脅迫下番茄幼苗生物量的影響Fig.1 Effect of hydrogen-rich water on tomato seedlings biomass under drought stress

2.2 ABA對干旱脅迫下番茄幼苗生長的影響

如圖2所示，與對照相比，PEG處理的番茄幼苗株高、莖粗、鮮重及干重顯著降低。在干旱脅迫下，100、150和200 μmol·LABA處理的番茄幼苗株高顯著高于PEG處理，而50 μmol·LABA處理與PEG處理差異不顯著；50、100和150 μmol·LABA處理的番茄幼苗莖粗顯著高于PEG處理。其中150 μmol·LABA是提高干旱脅迫下番茄幼苗株高和莖粗的最佳處理，較PEG處理分別增加11.2%和15.8%(圖2-A)。在干旱脅迫6 d后，100、150和200 μmol·LABA處理的番茄幼苗鮮重顯著高于PEG處理，而50 μmol·LABA處理與PEG處理差異不顯著；150 μmol·LABA處理的干重顯著高于PEG處理，比PEG處理高20.8%，而50、100和200 μmol·LABA處理與PEG處理無顯著差異(圖2-B)。因此，150 μmol·LABA用于后期試驗(yàn)。

圖2 脫落酸對干旱脅迫下番茄幼苗生物量的影響Fig.2 Effect of ABA on tomato seedlings biomass under drought stress

2.3 HRW、ABA及ABA抑制劑FLU對干旱脅迫下番茄幼苗生長的影響

由圖3可知，相比于對照，PEG處理顯著抑制番茄幼苗的生長。與PEG處理相比，PEG+HRW、PEG+ABA和PEG+HRW+ABA處理均緩解了干旱脅迫對番茄幼苗生長的抑制，其株高、莖粗、鮮重和干重顯著增加。干旱脅迫6 d后，HRW處理的同時(shí)噴施ABA抑制劑FLU，抑制了HRW對番茄幼苗生長的緩解作用，番茄幼苗的株高、莖粗、鮮重和干重比PEG+HRW處理分別下降了8.7%、17.3%、13.5%和16.7%。HRW單獨(dú)處理較對照顯著增加番茄幼苗的株高和鮮重；FLU單獨(dú)處理與對照相比，顯著降低番茄幼苗的株高、莖粗和鮮重(圖3)。

圖3 不同處理對干旱脅迫下番茄幼苗生物量的影響Fig.3 Effect of various treatments on tomato seedlings biomass under drought stress

2.4 干旱脅迫下HRW對番茄幼苗ABA含量及其合成酶相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖4所示，在脅迫和非脅迫條件下，外源HRW處理顯著增加了番茄幼苗內(nèi)源ABA含量及相對表達(dá)量，其中HRW和PEG+HRW處理無顯著差異。HRW單獨(dú)或脅迫下處理的內(nèi)源ABA含量較對照分別增加了173.0%和164.5%；相對表達(dá)量較對照分別上調(diào)了227.0%和300.0%。與對照相比，PEG處理顯著增加了番茄幼苗內(nèi)源ABA含量及相對表達(dá)量。PEG+HRW處理的番茄幼苗葉片內(nèi)源ABA含量以及基因表達(dá)水平較PEG處理分別提高了17.8%和139.5%。

圖4 HRW處理對干旱脅迫下番茄幼苗ABA含量及關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of HRW treatments on ABA content and gene expression of key enzymes in tomato seedlings under drought stress

2.5 HRW、ABA及ABA抑制劑FLU對干旱脅迫下番茄幼苗葉片丙二醛含量的影響

由圖5可知，干旱脅迫下MDA含量較對照顯著增加了76.9%。與PEG處理相比，PEG+HRW、PEG+ABA和PEG+HRW+ABA處理的番茄幼苗葉片MDA含量分別降低了34.8%、32.6%和37.0%，但3個(gè)處理之間沒有顯著差異。PEG+HRW+FLU處理的番茄幼苗葉片MDA含量較PEG+HRW處理顯著增加了16.7%。HRW和FLU單獨(dú)處理下番茄幼苗葉片MDA含量略有下降，但與對照相比無顯著差異。

圖5 不同處理對干旱脅迫下番茄幼苗丙二醛含量的影響Fig.5 Effect of various treatments on malondialdehyde content of tomato seedlings under drought stress

2.6 HRW、ABA及ABA抑制劑FLU對干旱脅迫下番茄幼苗抗氧化酶活性的影響

如圖6所示，干旱脅迫下番茄幼苗葉片SOD、CAT、APX的活性顯著高于對照，HRW和FLU單獨(dú)處理的番茄幼苗葉片的SOD和APX活性較對照差異不顯著。干旱脅迫6 d后，PEG+HRW、PEG+ABA和PEG+HRW+ABA處理的番茄幼苗葉片SOD和CAT活性顯著高于PEG處理，而PEG+HRW+FLU處理的SOD和CAT活性最低。與PEG處理相比，PEG+HRW、PEG+ABA和PEG+HRW+ABA處理的番茄幼苗葉片APX活性分別增加了25.4%、34.1%和40.8%。在PEG+HRW處理時(shí)噴施FLU可以顯著降低番茄幼苗葉片APX活性，較PEG+HRW處理降低了76.7%(圖6)。

圖6 不同處理對干旱脅迫下番茄幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.6 Effect of various treatments on antioxidant enzyme activity of tomato seedlings under drought stress

2.7 HRW、ABA及ABA抑制劑FLU對干旱脅迫下番茄幼苗抗氧化酶基因表達(dá)的影響

圖7表明，與對照相比，干旱脅迫下番茄幼苗葉片、和基因表達(dá)量顯著上調(diào)，分別為對照的98.0%、27.0%和73.0%。PEG+HRW、PEG+ABA和PEG+HRW+ABA處理的番茄幼苗葉片、和基因表達(dá)量較PEG處理顯著上調(diào)，但3個(gè)處理之間無顯著差異。與PEG+HRW處理相比，PEG+HRW+FLU處理的、和基因表達(dá)量顯著下調(diào)，較PEG+HRW處理分別下調(diào)了74.7%、73.7%和71.0%。HRW和FLU單獨(dú)處理的番茄幼苗葉片和基因表達(dá)量與對照相比無顯著差異(圖7)。

圖7 不同處理對干旱脅迫下番茄幼苗抗氧化酶基因表達(dá)的影響Fig.7 Effect of various treatments on the expression of antioxidant enzyme genes of tomato seedlings under drought stress

3 討論

H作為植物抵御逆境的重要生物調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)干旱脅迫中發(fā)揮著重要的作用。在本試驗(yàn)中，HRW濃度為75%時(shí)可顯著增加干旱脅迫下番茄幼苗的株高、莖粗、鮮重和干重，進(jìn)而促進(jìn)干旱脅迫下番茄幼苗的生長(圖1)。Xie等報(bào)道，HRW處理通過減少氣孔開度來增強(qiáng)擬南芥對干旱脅迫的耐受性。與PEG處理相比，PEG+50% HRW處理可促進(jìn)干旱脅迫下黃瓜不定根的發(fā)生。ABA是一種重要的植物激素，參與植物生長發(fā)育過程和脅迫響應(yīng)。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)150 μmol·LABA顯著提高了干旱脅迫下番茄幼苗的株高、莖粗、鮮重和干重(圖2)。本研究結(jié)果與Zhang等研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下施加外源ABA處理可顯著增加大豆幼苗的株高、莖粗、第一節(jié)間長和分枝數(shù)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下外源HRW和ABA共處理可增加干旱脅迫下番茄幼苗的株高、莖粗、鮮重和干重；而與PEG+HRW處理相比，PEG+HRW+FLU處理顯著降低了番茄幼苗的株高、莖粗、鮮重和干重(圖3)。說明H促進(jìn)干旱脅迫下番茄幼苗的生長可能需要ABA的參與。干旱脅迫可誘導(dǎo)紫花苜蓿ABA的合成，而H處理可顯著增加在干旱或非干旱脅迫下內(nèi)源ABA含量及合成基因的表達(dá)。這些結(jié)果與本研究結(jié)果一致，本試驗(yàn)結(jié)果表明，干旱脅迫下番茄幼苗內(nèi)源ABA含量和基因表達(dá)量較對照顯著增加，且外源HRW處理能顯著增加干旱脅迫下番茄幼苗內(nèi)源ABA含量和基因表達(dá)(圖4)。這些結(jié)果說明H可能參與誘導(dǎo)干旱脅迫下ABA的合成。

MDA作為膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，其累積可加劇膜的損傷。因此，可通過測定MDA含量了解膜脂過氧化的程度和植物的抗逆性。結(jié)果顯示，在干旱條件下，番茄幼苗葉片中的MDA含量顯著上升，這與Yuan等的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源HRW和ABA處理可顯著降低干旱脅迫下番茄幼苗葉片中的MDA含量，從而降低干旱脅迫對番茄幼苗造成的脂質(zhì)過氧化程度，保護(hù)干旱脅迫下番茄幼苗的細(xì)胞膜(圖5)。祝長龍等研究發(fā)現(xiàn)，外源ABA處理可以抑制干旱脅迫下美國紅楓的MDA積累，這與我們的研究結(jié)果一致。此外，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下HRW和ABA共處理的MDA含量減少量比HRW或ABA單獨(dú)處理多，但是這種作用被FLU逆轉(zhuǎn)。目前，關(guān)于H和ABA共處理緩解干旱脅迫的機(jī)制還不夠清楚。本研究結(jié)果表明，ABA可能通過降低MDA含量參與H增強(qiáng)番茄幼苗的抗旱性。

研究報(bào)道，在緩解紫花苜蓿鎘脅迫中，H提高了SOD、POD和APX等酶活性。Li等發(fā)現(xiàn)，H可以通過增加抗氧化酶活性來發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用，正向調(diào)節(jié)ABA依賴的干旱響應(yīng)。本試驗(yàn)研究結(jié)果也表明，HRW處理能夠顯著增加干旱脅迫下番茄幼苗的SOD、CAT和APX活性(圖6)。在干旱脅迫第6和8天，ABA處理可顯著增加三倍體百慕大草的SOD、CAT和POD活性。這些結(jié)果與本研究結(jié)果一致，即干旱脅迫下外源ABA可顯著提高番茄幼苗的SOD、CAT和APX活性。此外，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下HRW和ABA共處理的番茄幼苗葉片SOD、CAT和APX活性高于HRW或ABA單獨(dú)處理。但是，HRW緩解干旱脅迫的作用被FLU抑制。因此，本研究結(jié)果表明ABA可能通過提高番茄幼苗的抗氧化酶活性來參與H響應(yīng)干旱脅迫。

在干旱脅迫下，與對照相比，番茄幼苗葉片中的、和基因表達(dá)顯著上調(diào)。這與李州等的研究結(jié)果一致，即在輕度水分脅迫下，白三葉的、和基因表達(dá)量比對照顯著上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，與PEG處理相比，干旱脅迫下，外源HRW處理顯著上調(diào)了番茄幼苗、和基因表達(dá)量(圖7)。Xu等也研究表明，HRW處理可通過提高SOD、CAT和APX活性和相應(yīng)的基因表達(dá)來緩解鹽脅迫對水稻種子萌發(fā)的抑制。本試驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PEG+ABA處理能夠顯著增加干旱脅迫下番茄幼苗葉片中的、和基因表達(dá)。Guo等研究表明，外源ABA能夠顯著增加低溫脅迫下辣椒葉片中SOD、POD活性及相應(yīng)的基因表達(dá)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下HRW和ABA共同處理的、和等基因表達(dá)高于HRW 或ABA單獨(dú)處理；而HRW對上述基因表達(dá)的促進(jìn)作用被FLU逆轉(zhuǎn)。因此，本研究結(jié)果表明，H上調(diào)、和基因表達(dá)量來增強(qiáng)番茄幼苗的抗旱性可能需要ABA參與。

綜上所述，ABA參與H增強(qiáng)番茄幼苗的抗旱性可能是通過促進(jìn)干旱脅迫下番茄幼苗葉片ABA的合成、抑制MDA的積累以及上調(diào)、和的基因表達(dá)量，進(jìn)而增加了干旱脅迫下SOD、POD和APX的活性，有效緩解了干旱脅迫對番茄幼苗造成的氧化性傷害，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。因此，本試驗(yàn)為闡明H和ABA在響應(yīng)脅迫中的關(guān)系及機(jī)制提供了理論依據(jù)。