2種抗光肩星天牛楊樹樹皮和木質(zhì)部生化物質(zhì)分析

魏建榮，閆詩謠，李 臻，王 磊，劉宇婷，劉建鳳*

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生命科學(xué)與綠色發(fā)展研究院，河北 保定 071002；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 沙漠林業(yè)實驗中心，內(nèi)蒙古 磴口 015200；3.河北省地質(zhì)實驗測試中心，河北省礦產(chǎn)資源與生態(tài)環(huán)境監(jiān)測重點實驗室，河北 保定 071051)

楊樹是我國西北地區(qū)防護林的主栽樹種[1]。光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)(鞘翅目：天牛科)是楊樹的主要蛀干害蟲，廣泛發(fā)生于“三北”地區(qū)，在歐美也有發(fā)現(xiàn)[2-3]。西北地區(qū)早期楊樹防護林網(wǎng)一度被光肩星天牛毀滅[4-6]。新疆楊(Populusalbavar.pyramidalis)樹形高大，易繁殖、速生，是目前西北地區(qū)防護林的主栽樹種[7]，對光肩星天牛具有一定抗性，但也受到其危害，由于新疆楊主要是木質(zhì)部受害，樹皮外觀受害不太明顯[8-9]。

沙林楊(Populusdeltoides‘Shalinyang’)(原名北抗楊)是耐寒旱和生長速度較快的品種[9-11]。其樹形較為高大，樹干表面粗糙、干裂且有溝痕。觀察發(fā)現(xiàn)光肩星天牛主要危害沙林楊的樹皮，通過解剖受害木，發(fā)現(xiàn)天牛幼蟲的死亡率極高，但幼蟲死亡原因尚不清楚[9]。由于在試種早期發(fā)現(xiàn)沙林楊易受光肩星天牛侵害，在王志剛等[9]的研究報告之前，未有學(xué)者對沙林楊的抗蟲性進行研究。

楊樹體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)如酚類、黃酮類和單寧等，以及一些酶類對害蟲的生長發(fā)育、繁殖有不良影響，或致其死亡[12-19]。美洲黑楊抗蟲的主要機制是增加酚甙類物質(zhì)[17]，但具體的化合物種類不詳。為解析新疆楊和沙林楊的抗蟲機制，為后期培育新型抗蟲楊樹奠定基礎(chǔ)，本研究以二者為對象，選取未受害和受光肩星天牛危害的2種楊樹的樹皮和木質(zhì)部，測定其營養(yǎng)物質(zhì)、次生代謝物質(zhì)含量和防御酶活性，分析各物質(zhì)在不同處理間的異同。

1 材料與方法

1.1 采樣點

采樣地點位于內(nèi)蒙古磴口縣中國林科院沙漠林業(yè)實驗中心(40°20′22.20″N，106°56′29.91″E)。該地屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候，海拔1 000～1 080 m，年均降水量約103 mm，年均氣溫7.8 ℃左右。

1.2 材料

試驗林為新疆楊和沙林楊混交林分，模擬防護林栽植，共2行，行距2 m，每行交叉種植2種楊樹，株距1 m，樹齡4 a，生長良好。光肩星天牛在該處試驗林危害較輕，前期調(diào)查受害株率不超過5%，其中受害樹上的光肩星天牛排糞孔數(shù)為1～3個。由于對食葉害蟲開展化學(xué)防治，因此基本沒有其他害蟲危害。2018年9月砍伐當(dāng)年受害和未受害新疆楊與沙林楊各3株，木段截成60 cm長，保鮮膜包好運回實驗室，-20 ℃保存。對于未受害樹，確保樹干、枝上沒有天牛危害或產(chǎn)卵痕跡。由于初期沙林楊生長量大于新疆楊，因此在選擇樣樹時盡量挑選生長量接近的沙林楊和新疆楊，截取木段直徑均為8 cm左右。分別選擇未受害與受害樹的樹皮和木質(zhì)部作為供試材料，每種處理3個重復(fù)，每重復(fù)取15 g 樣品。對于受害樹段，樣品取自距離天牛排糞孔1～10 cm的部位，避開排糞孔和蟲道。

植物可溶性糖、蛋白、植物總酚、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)測試盒購自建成生物研究所。單寧和類黃酮購自上海仁捷生物科技有限公司。水楊苷、亞麻木酚素、毛蕊花糖苷、槲皮苷、白楊甙購自上海源葉生物科技有限公司(純度均大于≥95%)。

1.3 方法

1.3.1 可溶性糖和蛋白質(zhì)含量測定 可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法，將樣品制備后置于波長630 nm的可見光區(qū)下進行比色。蛋白含量采用考馬斯亮藍法，將樣品制備后置于波長595 nm的可見光區(qū)下進行比色(具體計算方法略)。

1.3.2 次生代謝物質(zhì)含量測定 采用高效液相色譜法進行分析。稱取2 g樣品磨碎，加入10 mL預(yù)冷50%乙醇溶液，4 ℃浸提過夜。3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，過濾后靜置待測。色譜條件：RIGOLL 3000高效液相色譜儀(Kromasil C18反相色譜柱250 mm×4.6 mm×5 μm)，柱溫30 ℃，流速1 mL·min-1，進樣10 μL。流動相分別是甲醇和1%甲酸水溶液，按一定梯度進行洗脫。檢測器波長設(shè)置為275 nm。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取各次生代謝物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇溶解后，配置成5～6個不同質(zhì)量濃度(1～200 μg·mL-1)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用色譜依次檢測各標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，計算得到各物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可計算各次生代謝物質(zhì)含量。總酚苷含量為5種次生代謝物質(zhì)含量之和。

利用單寧在堿性環(huán)境下與磷鉬酸反應(yīng)生成藍色化合物的性質(zhì)進行測定；利用福林酚比色法測定總酚含量；利用類黃酮與鋁離子在堿性亞硝酸鹽溶液中形成紅色絡(luò)合物的性質(zhì)測定類黃酮含量(具體方法略)。

1.3.3 防御酶活性測定 參考南京建成生物工程研究所的試劑說明書進行檢測(具體計算方法略)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性糖與蛋白含量

由表1可知，可溶性糖含量在樣品間差異顯著(F=6.56，df=7,16,P<0.01)，未受害新疆楊樹皮最高。受害沙林楊木質(zhì)部的糖含量最低(P<0.05)。樣品間蛋白質(zhì)含量差異顯著(F=3.21，df=7,16,P<0.05)，受害新疆楊木質(zhì)部顯著高于未受害沙林楊木質(zhì)部。

表1 2種楊樹樹皮與木質(zhì)部的可溶性糖和蛋白質(zhì)含量

2.2 次生代謝物質(zhì)

不同次生代謝物質(zhì)在樣品間的含量差異明顯，一般在樹皮中的含量顯著高于木質(zhì)部中的含量(表2)。水楊苷含量在2樹種未受害樹皮間沒有差異；受害新疆楊樹皮高于受害沙林楊樹皮(P<0.05)；未受害的木質(zhì)部高于受害木質(zhì)部(P<0.05)。沙林楊樹皮的亞麻木酚素含量均顯著低于新疆楊樹皮的含量(P<0.05)；未受害木質(zhì)部的含量高于受害木質(zhì)部的含量(P<0.05)。未受害樹皮的毛蕊花糖苷含量間無顯著差異；受害樹皮的含量顯著低于未受害樹皮(P<0.05)；受害后，沙林楊樹皮的含量低于新疆楊樹皮(P<0.05)，新疆楊木質(zhì)部含量最低(P<0.05)；受害沙林楊木質(zhì)部含量比未受害時略高，但不顯著(P>0.05)。未受害沙林楊樹皮槲皮苷含量最高，受害后新疆楊樹皮中含量顯著高于沙林楊樹皮(P<0.05)。受害新疆楊樹皮和木質(zhì)部中的白楊甙含量均分別高于未受害樹皮和木質(zhì)部，沙林楊受害后含量未見升高。總酚苷含量是上述5種酚苷含量之和，在樹皮中的含量遠超木質(zhì)部中含量(F=713.90，df=7,16,P<0.01)。其中未受害新疆楊樹皮的含量高，受害沙林楊木質(zhì)部最低。

表2 2種楊樹樹皮與木質(zhì)部的次生代謝物質(zhì)含量

未受害樣品單寧含量比受害樣品高，其中未受害新疆楊樹皮最高。受害樣品的總酚含量均顯著低于未受害樣品(P<0.05)，未受害沙林楊木質(zhì)部的含量最高(P<0.01)，2種樹受害木質(zhì)部的含量均低(P<0.01)。受害樣品的類黃酮含量均顯著高于未受害樣品的含量(P<0.01)。

綜合分析，未受害沙林楊樹皮中的槲皮苷、白楊苷以及新疆楊樹皮中亞麻木酚素和類黃酮的含量較高，可能參與了沙林楊或新疆楊樹皮的組成型化學(xué)防御。總酚在未受害的沙林楊木質(zhì)部中含量較高，其作用還有待證實。受害后，2種樹皮除單寧和類黃酮外含量相似處，其他次生代謝物在新疆楊中的含量較高，沙林楊木質(zhì)部中毛蕊花糖苷的含量高于新疆楊木質(zhì)部。類黃酮在受害樹體內(nèi)的含量高，可能與受害有一定相關(guān)性。另外，還需結(jié)合幼蟲分別在不同樹種的樹皮和木質(zhì)部取食時間長短來評估次生代謝物的作用。

2.3 防御酶

由表3可見，部分防御酶活性在楊樹受害后有不同程度提高。如受害沙林楊木質(zhì)部的SOD活性最高，未受害沙林楊樹皮的活性最低(P<0.01)。受害沙林楊樹皮PAL活性顯著低于受害新疆楊樹皮活性(P<0.01)，而受害沙林楊木質(zhì)部更低。未受害沙林楊樹皮的PPO活性最高，受害沙林楊木質(zhì)部的活性最低。受害沙林楊體內(nèi)的POD活性均顯著提高(P<0.01)。

表3 2種楊樹樹皮與木質(zhì)部的防御酶活性

對上述4種防御酶在2種楊樹樹皮和木質(zhì)部中的活性分析表明，受害沙林楊的SOD酶和POD酶活性增強與光肩星天牛幼蟲的危害有關(guān)，受害新疆楊木質(zhì)部中的PAL和PPO酶活性增強與天牛幼蟲危害有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

光肩星天牛危害后的沙林楊木質(zhì)部可溶性糖含量較低，可能是天牛幼蟲在木質(zhì)部存活率低的原因之一，木質(zhì)部的毛蕊花糖苷含量比較高，可能與沙林楊抗蟲性有關(guān)。類黃酮含量升高與2種楊樹受害有一定相關(guān)。沙林楊樹皮和木質(zhì)部中POD和SOD酶的活性增高與天牛幼蟲危害有關(guān)，且POD酶可能參與了沙林楊的抗蟲反應(yīng)。受害新疆楊木質(zhì)部中的PAL和PPO酶升高也與天牛鉆蛀危害有關(guān)。

3.2 討論

新疆楊是我國西北地區(qū)廣泛栽植的優(yōu)良防護林樹種，對光肩星天牛有較強的耐受性，雖然沙林楊樹皮受害較為嚴(yán)重，但木質(zhì)部受害輕于新疆楊[9]，2種楊樹的抗蟲機理明顯不同。不同樹木所含物質(zhì)的質(zhì)和量不同，將直接影響植食性昆蟲的寄主選擇、生長發(fā)育和存活[20-21]。

光肩星天牛在沙林楊木質(zhì)部內(nèi)的蟲道遠少于新疆楊木質(zhì)部[9]，本研究中沙林楊受害后其木質(zhì)部只有毛蕊花糖苷的含量高于受害新疆楊木質(zhì)部，且略高于其受害后的樹皮和未受害時的木質(zhì)部，據(jù)此推斷毛蕊花糖苷與沙林楊抗蟲性相關(guān)。白楊甙是毛白楊的主要抗光肩星天牛物質(zhì)[14]，本研究中受害新疆楊樹皮和木質(zhì)部中的白楊甙含量也較高，但考慮到天牛幼蟲在新疆楊木質(zhì)部的高存活率和在沙林楊木質(zhì)部的低存活率[9]，認(rèn)為白楊甙在此并未起到抗蟲作用。類黃酮與光肩星天牛的危害有關(guān)，但能否起到防御作用，還有待進一步研究。

未受害新疆楊樹皮中的防御酶活性高，說明其具有潛在的抗病蟲性，這可能是光肩星天牛在新疆楊上產(chǎn)卵較少的原因之一[22]。SOD酶活性在2種楊樹的受害樹皮和木質(zhì)部內(nèi)均有不同程度的增強，說明其參與了2種楊樹的誘導(dǎo)性防御。沙林楊受害后其樹皮和木質(zhì)部POD酶活性均有提高，說明POD酶參于了沙林楊對光肩星天牛幼蟲的抗性反應(yīng)。

樹木種類、年齡和生長環(huán)境的不同會影響樹皮的厚度和粗糙度。同等胸徑的新疆楊樹皮比沙林楊樹皮薄。由于次生代謝物質(zhì)在樹皮內(nèi)的含量遠高于其在木質(zhì)部的含量，因此天牛幼蟲在樹皮內(nèi)取食的時間越長，攝入的次生代謝物質(zhì)量就越多。雖然新疆楊樹皮所含次生物質(zhì)的量較大，但由于幼蟲取食少量即鉆入木質(zhì)部，因此幼蟲的存活率反而比較高。沙林楊樹皮較厚，幼蟲取食時間較長而攝入較多的次生代謝物質(zhì)，生長發(fā)育會受到較大影響，可能致最終無法完成發(fā)育而死亡。

本研究只檢測了部分次生代謝物質(zhì)和防御酶類，也可能還有其他一些未檢測次生代謝類物質(zhì)會影響光肩星天牛的生長發(fā)育。如果能通過生測試驗確定哪些次生代謝物質(zhì)可以起到關(guān)鍵抗蟲作用，則在未來的抗蟲育種工作中，可提前在苗期檢測這些物質(zhì)，縮短育苗、選苗周期。