自毒脅迫對(duì)黃瓜砧穗種子萌發(fā)和抗氧化特性的影響

肖雪梅 馬 寧 李 菊 王 瑞 胡琳莉 武 玥 郁繼華*

（1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2 省部共建干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070）

黃瓜（L.）是設(shè)施栽培的主要蔬菜種類(lèi)之一，隨著連作年限的增加，生產(chǎn)上出現(xiàn)品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低、病蟲(chóng)害加重等連作障礙問(wèn)題。前人研究表明，作物根系分泌的自毒物質(zhì)對(duì)其自身的毒害作用是引起連作障礙的主要原因之一（喻景權(quán)和杜堯舜，2000；Huang et al.，2013）。植物自身釋放的化感物質(zhì)對(duì)同種或同科植物產(chǎn)生的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)稱(chēng)為自毒現(xiàn)象（Rice &Kozlowski，2013；陳鋒等，2017）。黃瓜根系可以分泌包括苯甲酸、2，5-二羥基苯甲酸、肉桂酸和苯丙酸在內(nèi)的11 種酚酸類(lèi)自毒物質(zhì)（Yu &Matsui，1994），其中肉桂酸是主要的自毒物質(zhì)，常作為外源物質(zhì)來(lái)模擬自毒脅迫（Ye et al.，2006；Bu et al.，2018）。這些自毒物質(zhì)通過(guò)影響黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)、幼苗的離子吸收和光合作用，抑制黃瓜生長(zhǎng)（Yu &Matsui，1997；Yu et al.，2003；Bu et al.，2016）；還可引起根系氧化脅迫，促進(jìn)枯萎病的發(fā)生（Ye et al.，2006）；抑制細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)（Zhang et al.，2009）。因此，提升黃瓜對(duì)自毒脅迫的耐受性可一定程度增強(qiáng)其抵御連作障礙的能力。

通過(guò)嫁接換根措施可有效提高蔬菜作物的抗逆性，減輕連作障礙的產(chǎn)生。李玉洪等（2012）發(fā)現(xiàn)嫁接能提高苦瓜對(duì)枯萎病、蔓枯病、白粉病等病害的抗性，解決苦瓜生產(chǎn)中的連作障礙問(wèn)題；適宜的砧木嫁接可提高西瓜（Ning et al.，2013）和茄子（陳紹莉 等，2010；Chen et al.，2011）幼苗對(duì)自毒物質(zhì)的耐受性，增強(qiáng)其對(duì)土傳病害的抗性。甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜逆境生理研究團(tuán)隊(duì)前期研究采用二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)明確了黑籽南瓜（Bouché）嫁接通過(guò)調(diào)節(jié)光合作用、碳氮代謝途徑中關(guān)鍵基因的上調(diào)，增強(qiáng)黃瓜植株對(duì)自毒脅迫的耐受性（Xiao et al.，2020）。Ding 等（2007）研究證實(shí)黃瓜與黑籽南瓜幼苗的根系生長(zhǎng)對(duì)肉桂酸處理表現(xiàn)出不同的響應(yīng)，其中黃瓜根系中活性氧積累，膜脂過(guò)氧化程度加重，生物膜H-ATPase 活性降低，甚至根系活力喪失，而在黑籽南瓜中則沒(méi)有這種變化。黑籽南瓜這種較強(qiáng)的適應(yīng)性是否在發(fā)芽期就表現(xiàn)出來(lái)尚未得到證實(shí)，黃瓜、黑籽南瓜種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)對(duì)肉桂酸的響應(yīng)差異及相關(guān)的生理機(jī)制也尚不明確。因此，本試驗(yàn)以肉桂酸為外源物質(zhì)模擬自毒脅迫，探究黑籽南瓜和黃瓜種子萌發(fā)對(duì)自毒脅迫的響應(yīng)是否存在差異及其潛在的生理代謝和基因調(diào)控機(jī)制，以期進(jìn)一步從理論上說(shuō)明黃瓜自毒作用和調(diào)控機(jī)理，為科學(xué)防治黃瓜連作障礙提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以新春4 號(hào)黃瓜和黑籽南瓜種子為試驗(yàn)材料。供試種子購(gòu)買(mǎi)于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020 年9—12 月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院設(shè)施園藝實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選取健壯飽滿、形態(tài)一致的黃瓜和黑籽南瓜種子，經(jīng)溫湯浸種后將種子均勻擺放于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，黃瓜種子每皿30 粒，黑籽南瓜種子每皿20 粒。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明0.25 mmol · L是黃瓜種子萌發(fā)的中度肉桂酸脅迫濃度，因此本試驗(yàn)向培養(yǎng)皿滴加0.25 mmol · L肉桂酸（CA）溶液浸濕濾紙，以滴加等量蒸餾水為對(duì)照（CK），共4 個(gè)處理。每處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 皿，置于人工氣候箱在28 ℃黑暗條件下催芽。催芽期間每天補(bǔ)充適量的蒸餾水或0.25 mmol · L肉桂酸溶液。發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)為種皮裂開(kāi)、胚根露白，處理后2～5 d 每天記錄發(fā)芽種子數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率。前期試驗(yàn)結(jié)果表明黃瓜、黑籽南瓜種子萌發(fā)的起始時(shí)間分別為8 h 和32 h，發(fā)芽最快時(shí)間分別為11 h 和35 h，因此分別于黃瓜種子萌發(fā)的0、8、11、24、48 h 和黑籽南瓜種子萌發(fā)的0、32、35、48、72 h 取整株芽苗，每個(gè)重復(fù)取2 皿。將樣品用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干水分，液氮處理后，于-80 ℃保存，用于測(cè)定活性氧、丙二醛含量和抗氧化酶活性、基因表達(dá)量等指標(biāo)。分別于黃瓜催芽5 d 和黑籽南瓜催芽7 d 收集胚根，測(cè)定芽苗根系形態(tài)，每個(gè)重復(fù)取5 株。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 種子發(fā)芽指標(biāo)

發(fā)芽率=萌發(fā)種子數(shù)/供試種子總數(shù)× 100%

芽苗根系形態(tài)采用WinPHIZO BASIC 2005 根系分析系統(tǒng)測(cè)定，記錄根系的總根長(zhǎng)、根表面積、根體積和根尖數(shù)等指標(biāo)。

1.3.2 活性氧和丙二醛含量 參照Hu 等（2012）的方法，過(guò)氧化氫（HO）含量用硫酸鈦法測(cè)定，超氧陰離子（O）產(chǎn)生速率用羥胺氧化反應(yīng)法測(cè)定，丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸法測(cè)定。

1.3.3 抗氧化酶活性 根據(jù)Gossett 等（1994）的方法，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）還原法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用過(guò)氧化氫分光光度法測(cè)定，抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性采用抗壞血酸紫外吸收法測(cè)定，谷胱甘肽還原酶（GR）活性采用NADPH 氧化法測(cè)定。

1.3.4 抗氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)量 抗氧化酶基因-、-、、、、表達(dá)量采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）法測(cè)定（Zhao et al.，2017）。取樣時(shí)間為黃瓜發(fā)芽8 h和黑籽南瓜發(fā)芽32 h。

總RNA 采 用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa）試劑盒〔寶生物工程（大連）有限公司〕提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性，并采用NanoDrop 2000 檢測(cè)RNA 濃度和純度。采用PrimeScriptRT Master Mix（TaKaRa）試劑盒〔寶生物工程（大連）有限公司〕將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。依據(jù)TaKaRa公司的SYBR System操作手冊(cè)，于LightCycler 96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（瑞士羅氏）上，采用兩步法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增?；蛱禺愋砸镄蛄幸?jiàn)表1，以基因?yàn)閮?nèi)參。根據(jù)得到的值，采用2方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因及其引物信息

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行最小顯著性差異法（LSD）分析，顯著水平＜0.05；采用Microsoft Excel 2010 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂酸對(duì)黃瓜砧穗種子發(fā)芽率和胚根形態(tài)的影響

由表2 可知，黃瓜和黑籽南瓜種子萌發(fā)對(duì)肉桂酸處理的響應(yīng)不同。0.25 mmol · L肉桂酸處理可顯著抑制黃瓜種子的萌發(fā)，發(fā)芽率降低了7.8 百分點(diǎn)；而黑籽南瓜種子發(fā)芽率卻比對(duì)照略有升高，但未達(dá)到顯著水平。表明黑籽南瓜種子萌發(fā)對(duì)自毒脅迫的耐受性高于黃瓜。

表2 肉桂酸處理對(duì)黃瓜和黑籽南瓜種子發(fā)芽率和胚根形態(tài)的影響

黃瓜和黑籽南瓜芽苗胚根形態(tài)均不同程度受到肉桂酸的抑制。其中，黃瓜胚根的總根長(zhǎng)、根表面積、根體積和根尖數(shù)均比對(duì)照顯著下降，分別降低

了28.1%、22.2%、14.9%和46.6%；而黑籽南瓜僅根表面積顯著低于對(duì)照，降幅為17.2%，總根長(zhǎng)、根體積和根尖數(shù)均與對(duì)照無(wú)顯著差異。另外，無(wú)論有無(wú)肉桂酸脅迫，黑籽南瓜胚根各形態(tài)指標(biāo)均高于黃瓜，表明黑籽南瓜具有更發(fā)達(dá)的根系，可能是其對(duì)肉桂酸耐受性較高的原因之一。

2.2 肉桂酸對(duì)黃瓜砧穗種子萌發(fā)過(guò)程中活性氧和丙二醛含量的影響

如圖1 所示，黃瓜和黑籽南瓜種子中活性氧的積累對(duì)肉桂酸脅迫呈現(xiàn)不同的響應(yīng)水平。隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，黃瓜種子的HO含量呈不斷升高趨勢(shì)，O產(chǎn)生速率先升高后降低，且在發(fā)芽的各個(gè)時(shí)期肉桂酸處理下的含量均顯著高于對(duì)照。而黑籽南瓜種子中HO含量和O-.產(chǎn)生速率均隨發(fā)芽時(shí)間的推進(jìn)而呈增加趨勢(shì)，但HO含量?jī)H在發(fā)芽48 h 和72 h 顯著高于對(duì)照，增幅分別為10.4%和36.5%，O產(chǎn)生速率始終與對(duì)照無(wú)顯著差異。表明在同濃度肉桂酸脅迫下，黑籽南瓜比黃瓜積累較少的活性氧自由基。隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，黃瓜種子中MDA 含量在肉桂酸處理下不斷積累，在發(fā)芽48 h 時(shí)顯著高于對(duì)照，增加了26.2%；而黑籽南瓜種子中的MDA 含量在萌發(fā)過(guò)程中均與對(duì)照無(wú)顯著差異，且在發(fā)芽72 h 時(shí)驟降。

圖1 肉桂酸處理對(duì)黃瓜和黑籽南瓜種子萌發(fā)過(guò)程中H2O2 含量、產(chǎn)生速率和MDA 含量的影響

2.3 肉桂酸對(duì)黃瓜砧穗種子萌發(fā)過(guò)程中抗氧化酶活性的影響

由圖2 可知，隨著發(fā)芽時(shí)間的推進(jìn)，黃瓜種子的SOD、CAT、APX 和GR 活性均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，APX 活性相比發(fā)芽初期有升高趨勢(shì)，并且肉桂酸處理的酶活性均先高于對(duì)照而后低于對(duì)照，但不同的酶活性出現(xiàn)的拐點(diǎn)不同。SOD和APX 活性均在發(fā)芽8 h 時(shí)顯著高于對(duì)照，而在發(fā)芽24 h 和48 h 時(shí)顯著低于對(duì)照，其中，48 h 時(shí)分別比對(duì)照降低了26.0%和65.2%；CAT 活性除發(fā)芽8 h 時(shí)顯著高于對(duì)照外，其余時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對(duì)照，在發(fā)芽11、24 h 和48 h 時(shí)分別比對(duì)照降低了11.5%、34.4%和33.3%；而GR 活性僅在發(fā)芽24 h 和48 h 時(shí)顯著低于對(duì)照，分別降低44.6%和26.7%。黑籽南瓜抗氧化酶活性對(duì)肉桂酸脅迫表現(xiàn)出不同的響應(yīng)水平。SOD、CAT 和GR 活性均在種子萌發(fā)過(guò)程的前期升高，后期降低，最終與對(duì)照無(wú)顯著差異，其中SOD 活性分別在發(fā)芽32、35 h 和48 h 時(shí)顯著高于對(duì)照，CAT 活性僅在發(fā)芽35 h 時(shí)顯著高于對(duì)照，GR 活性在發(fā)芽35 h 和48 h 時(shí)顯著高于對(duì)照。APX 活性在發(fā)芽的各個(gè)時(shí)期均受到肉桂酸的顯著影響，分別在發(fā)芽32、35、48 h 和72 h 時(shí)高于對(duì)照15.4%、14.3%、55.9%和118.5%。

圖2 肉桂酸處理對(duì)黃瓜和黑籽南瓜種子萌發(fā)過(guò)程中SOD、CAT、APX 和GR 活性的影響

2.4 肉桂酸對(duì)黃瓜砧穗種子萌發(fā)過(guò)程中抗氧化酶基因表達(dá)量的影響

如圖3 所示，除基因外，其他基因表達(dá)量在黃瓜種子遭受肉桂酸脅迫后下調(diào)，而在黑籽南瓜種子中上調(diào)。與對(duì)照相比，黃瓜種子萌發(fā)過(guò)程中的-、-、、和分別下調(diào)95%、73%、70%、91%和89%，而黑籽南瓜種子萌發(fā)過(guò)程中這5 個(gè)基因分別上調(diào)148%、272%、148%、199%和272%。然而，表現(xiàn)出相反的變化，其在黃瓜種子萌發(fā)過(guò)程中基因表達(dá)量比對(duì)照升高了60%，而在黑籽南瓜中降低了93%。

圖3 肉桂酸處理對(duì)黃瓜、黑籽南瓜種子萌發(fā)過(guò)程中抗氧化酶基因表達(dá)量的影響

3 討論

種子萌發(fā)是植物生命周期中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。蔬菜作物種子能否正常萌發(fā)與出苗率高低直接影響后期的作物產(chǎn)量和品質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示0.25 mmol · L肉桂酸處理顯著抑制了黃瓜的發(fā)芽，而黑籽南瓜的發(fā)芽未受到顯著影響，甚至稍有促進(jìn)?；形镔|(zhì)抑制植物種子萌發(fā)的研究已在多種作物中被報(bào)道，如萵苣、蘿卜和生姜 等（Butcko &Jensen，2002；Han et al.，2008；Yuan et al.，2012）。此外，本試驗(yàn)中初生芽苗的根系發(fā)育也受到肉桂酸處理不同程度的抑制，且黃瓜的抑制作用更大。因此，證實(shí)了種子萌發(fā)階段的黑籽南瓜比黃瓜對(duì)自毒脅迫的耐受性更強(qiáng)。

自毒物質(zhì)會(huì)作用于幼胚細(xì)胞，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響植物種子萌發(fā)。其最直接的結(jié)果就是導(dǎo)致種子中電解質(zhì)的外滲，丙二醛含量的積累，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。Bu 等（2016，2018）研究發(fā)現(xiàn)，肉桂酸的衍生物苯丙酸通過(guò)破壞黃瓜種子細(xì)胞膜的完整性，引起電解液滲透率增加和丙二醛含量升高，從而抑制其正常的萌發(fā)。同樣的研究結(jié)果在甜瓜植株水浸液對(duì)其種子萌發(fā)的影響中被證實(shí)（Zhang et al.，2020）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著種子萌發(fā)時(shí)間的推進(jìn)，黃瓜種子中MDA 含量逐漸增加，在發(fā)芽48 h時(shí)顯著高于對(duì)照，而黑籽南瓜始終與對(duì)照差異不顯著。表明黑籽南瓜遭受肉桂酸傷害的程度較輕。相似的結(jié)果在黃瓜、黑籽南瓜幼苗期對(duì)肉桂酸脅迫的響應(yīng)研究中亦被報(bào)道（Ye et al.，2006）。活性氧作為重要的信號(hào)分子，在種子萌發(fā)以及植物抗逆性方面具有重要的調(diào)控作用。如果細(xì)胞內(nèi)積累過(guò)多的活性氧則會(huì)破壞細(xì)胞膜以及細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)，改變調(diào)節(jié)細(xì)胞生物活性所必需的氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)，影響植物種子萌發(fā)以及生長(zhǎng)發(fā)育（Pergo et al.，2011）。已有研究表明，作為非生物脅迫的一種，自毒作用能影響植物種子萌發(fā)過(guò)程中活性氧的產(chǎn)生與清除，進(jìn)而調(diào)控植物種子萌發(fā)（Bu et al.，2018）。正常條件下活性氧的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡中，但受到自毒脅迫時(shí)，這種平衡關(guān)系被打破，種子萌發(fā)就會(huì)受到抑制。本試驗(yàn)結(jié)果表明，肉桂酸處理可顯著促進(jìn)黃瓜種子HO和O-.的積累，且隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)積累量增加。而黑籽南瓜僅在種子萌發(fā)后期顯著促進(jìn)HO的積累。說(shuō)明黑籽南瓜遭受的氧化損傷程度較黃瓜輕。

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套自我防御體系，在遭遇逆境時(shí)可清除過(guò)量的活性氧分子，以維持正常的生命活動(dòng)。有關(guān)自毒脅迫對(duì)植物抗氧化系統(tǒng)的影響出現(xiàn)兩種不同的觀點(diǎn)，有的報(bào)道稱(chēng)SOD、POD、CAT、APX、GR 活性在自毒物質(zhì)處理下升高（Bai et al.，2009；Li et al.，2011）；另有一些研究結(jié)果顯示，自毒脅迫引起這些抗氧化酶活性下降（Bu et al.，2016）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，肉桂酸處理下的黃瓜SOD、CAT、APX 和GR 活性隨萌發(fā)時(shí)間的推進(jìn)均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，但發(fā)芽后期黃瓜的抗氧化酶活性低于對(duì)照，在發(fā)芽48 h 分別比對(duì)照降低了26.0%、33.3%、65.2%和26.7%；而黑籽南瓜的抗氧化酶活性高于或接近于對(duì)照。分析其原因，初期抗氧化酶活性的升高可能是植物遭受逆境脅迫出現(xiàn)的應(yīng)激反應(yīng)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶系統(tǒng)遭受破壞，導(dǎo)致酶活性下降。黃瓜、黑籽南瓜種子中的抗氧化酶基因的表達(dá)結(jié)果表明，肉桂酸處理可引起-、-、、和基因在黃瓜中的下調(diào)和黑籽南瓜中的上調(diào)。類(lèi)似的結(jié)果在Li 等（2014）的研究中也有報(bào)道，該研究發(fā)現(xiàn)黑籽南瓜嫁接通過(guò)上調(diào)抗氧化酶基因的表達(dá)提高黃瓜對(duì)高溫和低溫的適應(yīng)性。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步從分子水平論證了黑籽南瓜對(duì)肉桂酸耐受性高于黃瓜的原因。

4 結(jié)論

肉桂酸處理可顯著抑制黃瓜的種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)，而對(duì)黑籽南瓜幾乎沒(méi)有影響。此外，自毒脅迫引起黃瓜丙二醛和活性氧的過(guò)度積累，而對(duì)黑籽南瓜影響不大。這可能是由于黑籽南瓜具有較發(fā)達(dá)的根系，抗氧化酶活性的升高和抗氧化酶基因表達(dá)的上調(diào)，增強(qiáng)了其對(duì)活性氧的清除能力，維持了生物膜的穩(wěn)定性。