H2S暴露對保育豬氧化還原狀態(tài)及硫化氫代謝的影響

陳 磊，劉 真，謝彥嬌，苗啟翔，駱城增,3，張宏福，唐湘方*

(1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193； 2.蘭州大學草地農業(yè)科技學院，蘭州 730020； 3.新疆農業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830052)

隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；?、集約化發(fā)展程度不斷提高，畜舍中飼養(yǎng)密度的增加使得舍內硫化氫、氨氣等有害氣體含量增多，嚴重威脅著人畜的健康，對畜禽生產性能產生不良影響[1-2]。硫化氫(H2S)作為畜舍中具有刺激性氣味的有害氣體之一，主要來源于飼料中含硫物質在動物體內的消化以及糞尿、墊料、飼料殘渣中含硫有機物的厭氧分解。我國《規(guī)模豬場環(huán)境參數(shù)及環(huán)境管理》(GB/T17824.3—2008)[3]規(guī)定豬舍空氣中H2S不宜超過10 mg·m-3，美國職業(yè)安全與健康管理局(OSHA)[4]規(guī)定H2S允許暴露的限值為30 mg·m-3。然而實際生產中，如豬舍清糞等環(huán)節(jié)，糞便的攪動使豬舍H2S濃度在攪拌源附近或者通風不足的區(qū)域常突破OSHA規(guī)定的最高限值[5-6]，嚴重威脅著畜禽和養(yǎng)殖人員的健康以及生命安全。據(jù)報道，30 mg·m-3H2S暴露會使人類眼部受到刺激，并產生疲勞、頭痛等癥狀[7]。在畜禽中的研究發(fā)現(xiàn)，20 mg·m-3H2S暴露誘導肉雞產生氧化應激，造成肝[8]、氣管[9]、空腸[10]等多組織損傷。16 mg·m-3H2S暴露也會引起肉羊的氧化應激，降低其免疫功能和抗氧化能力[11]。以豬為研究對象，15 mg·m-3H2S暴露，會對斷奶仔豬生長、免疫，甚至腸道菌群產生不利影響[12]，而30 mg·m-3H2S暴露還能引起肺部炎癥、免疫抑制和細胞死亡等[13]，但H2S對豬氧化還原狀態(tài)影響的報道較少。

相比外源性H2S的毒性作用，內源性H2S作為一種氣體信號分子，在生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，研究其代謝對于理解其生物學功能至關重要[14]。哺乳動物體內H2S主要由胱硫醚β-合酶(CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(CSE)和3-巰基丙酮酸硫轉移酶(3-MST)催化產生[15]。隨著內源H2S的產生，它必須被快速代謝清除，防止在體內積累產生毒性作用。哺乳動物H2S分解代謝主要途徑是在肝線粒體中通過硫化物如醌氧化還原酶(SQR)、亞硫酸鹽氧化酶(SUOX)等酶促氧化生成硫酸鹽或者硫代硫酸鹽[16-17]。

目前，國內外關于H2S暴露對保育豬血清和肝氧化還原狀態(tài)以及H2S代謝影響的研究鮮有報道。因此，本研究參照OSHA規(guī)定的職業(yè)環(huán)境中H2S暴露最高限值30 mg·m-3，研究人工環(huán)控艙中H2S暴露28 d對保育豬血清及肝氧化還原狀態(tài)和體內H2S代謝的影響，為畜禽舍環(huán)境控制和環(huán)境舒適度評價提供理論依據(jù)，為保護生豬及養(yǎng)殖人員健康安全以及提高動物福利提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗采用完全隨機設計，選取12頭體況健康、體重相近((11.61±1.51)kg)的35日齡保育豬(大白豬)，隨機分為2組，公母各半，每組6頭仔豬，分別飼養(yǎng)在兩個環(huán)控艙內。試驗組環(huán)控艙內H2S濃度控制為30 mg·m-3，對照組環(huán)控艙內H2S濃度控制為0 mg·m-3。試驗期為28 d。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗期開始前，對環(huán)控艙進行充分清洗、消毒。試驗過程中，每2 h，使用便攜式H2S氣體檢測儀(美國華瑞ToxiRAE Pro，PGM-1860)對環(huán)控艙內H2S濃度進行檢測，確保H2S濃度在試驗期內保持穩(wěn)定。H2S氣體(純度為99.9%)購自北京永圣氣體科技有限公司。除H2S濃度外，環(huán)控艙內其余環(huán)境參數(shù)均保持一致，溫度為20～22 ℃，濕度為60%～65%。試驗期間保育豬自由采食和飲水，參照《豬飼養(yǎng)標準》(NY/T 65—2004)配制玉米-豆粕型基礎日糧，其組成及營養(yǎng)成分與文獻[18]一致。試驗結束后，所有保育豬在禁食、自由飲水12 h后進行采血、屠宰及樣品采集。

1.3 樣品采集與保存

H2S暴露28 d后，保育豬頸靜脈采血，血液靜置30 min后，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清至離心管內，于-80 ℃保存。電擊致暈仔豬，屠宰解剖采集肝組織樣品至凍存管，于-80 ℃保存。

1.4 測定指標和方法

1.4.1 血清氧化還原指標 采用南京建成生物工程研究所的生化試劑盒檢測血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的活性，以及丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量。采用上?？祈樕锟萍加邢薰镜呢i活性氧簇(ROS)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒檢測血清活性氧(ROS)的含量。具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.4.2 肝氧化還原指標 采用南京建成生物工程研究所的生化試劑盒檢測肝組織T-SOD、CAT、GPX活性，H2O2、MDA、蛋白質羰基(PC)、GSH、GSSG含量以及羥自由基(·OH)清除能力。采用上?？祈樕锟萍加邢薰镜呢i活性氧簇(ROS)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒檢測肝組織ROS含量。具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 血清和肝H2S含量測定 采用血液硫化氫含量比色法定量檢測試劑盒(GMS70105.2，GENMED)測定血清H2S含量；采用組織硫化氫含量比色法定量檢測試劑盒(GMS70105.1，GENMED)測定肝組織H2S含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.4.4 肝中相關基因表達水平測定 采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測保育豬肝氧化還原、硫化氫合成以及分解代謝相關基因的mRNA表達水平。使用北京金百特生物技術有限公司的通用型總RNA快速提取試劑盒(TRIzol+吸附柱)提取肝組織中的RNA，利用反轉錄試劑盒(RR047A，TaKaRa)合成cDNA。采用 SYBR Green Premix(RR420A，TaKaRa)和實時熒光定量 PCR儀(CFX96TMReal-Time system，Bio-Rad)對目的基因的mRNA表達量進行檢測。采用2-ΔΔCT法[19]計算目的基因的相對表達量，以GAPDH為內參基因對數(shù)據(jù)進行標準化。目的基因的引物序列如表1所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 用于RT-qPCR 的基因引物序列Table 1 Gene primers sequences for RT-qPCR

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

采用Excel 2019軟件整理數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 8軟件的雙尾t檢驗進行統(tǒng)計分析以及作圖，結果以“平均數(shù)±標準誤”表示。P<0.05和P<0.01分別作為顯著和極顯著差異的標準。

2 結 果

2.1 H2S暴露對保育豬血清氧化還原指標的影響

由表2可知，與對照組相比，H2S暴露引起保育豬血清中ROS含量極顯著增加(P<0.01)，MDA含量顯著增加(P<0.05)；T-SOD的活性顯著降低(P<0.05)，CAT和GPX的活性極顯著降低(P<0.01)，GSH和GSSG的含量無顯著變化(P>0.05)。

表2 H2S暴露對保育豬血清氧化還原指標的影響Table 2 Effects of H2S exposure on serum redox indexes of nursery pigs

2.2 H2S暴露對保育豬肝組織氧化還原指標的影響

如表3所示，與對照組相比，H2S暴露使肝中ROS和H2O2含量升高，同時MDA和PC含量升高，但差異不顯著(P>0.05)。T-SOD和GPX活性極顯著升高(P<0.01)，·OH清除能力顯著提高(P<0.05)，而CAT活性升高，但差異不顯著(P>0.05)，GSH和GSSG含量無顯著變化(P>0.05)。

表3 H2S暴露對保育豬肝組織氧化還原指標的影響Table 3 Effects of H2S exposure on liver redox indexes of nursery pigs

H2S暴露后保育豬肝中Nrf2及下游抗氧化相關基因的mRNA表達量變化如圖1所示。與對照組相比，H2S暴露顯著降低了Keap1的mRNA表達(P<0.05)，同時上調了Nrf2的mRNA表達(P<0.05)。SOD1、SOD2、GPX1、GPX2、GPX4、GSR、CAT的mRNA表達均上調，其中SOD2、GPX1、GPX2、GPX4以及GSR的mRNA表達上調達顯著水平(P<0.05)。

*表示P<0.05。下圖同* indicates P<0.05. The same as below圖1 H2S暴露對保育豬肝Nrf2及下游抗氧化基因表達的影響Fig.1 The effect of H2S exposure on the Nrf2 and downstream antioxidant-related genes expression in liver of nursery pigs

2.3 H2S暴露對保育豬內源性H2S代謝的影響

為研究外源H2S對保育豬內源性H2S代謝的影響，檢測保育豬血清和肝中H2S含量以及肝H2S合成以及分解代謝相關基因表達。由圖2可知，與對照組相比，H2S暴露28 d后，血清和肝組織中H2S含量均顯著降低(P<0.05)。

圖2 H2S暴露對保育豬血清和肝H2S含量的影響Fig.2 Effects of H2S exposure on H2S content in serum and liver of nursery pigs

如圖3所示，與對照組相比，H2S暴露28 d后，肝中內源性H2S合成酶CSE和CBS的mRNA表達量均顯著下調(P<0.05)，3-MST的mRNA表達量下調，但差異不顯著(P>0.05)；同時，H2S代謝酶SQR和SUOX的mRNA表達量下調，但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 H2S暴露對保育豬內源性H2S合成與分解代謝的影響Fig.3 Effects of H2S exposure on endogenous H2S synthesis and catabolism in nursery pigs

3 討 論

3.1 H2S暴露對保育豬血清氧化還原狀態(tài)的影響

血液中氧化還原指標能夠反映機體的氧化還原狀態(tài)和健康狀況。本研究通過檢測保育豬血清中多項氧化還原指標來判斷H2S暴露對保育豬機體氧化還原狀態(tài)的影響。H2S的主要毒性作用機制是抑制氧化呼吸鏈中的線粒體細胞色素C氧化還原酶的活性，促進ROS的生成[20]。當ROS的產生超過了機體抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力，持續(xù)高水平的ROS抑制抗氧化酶的活性，抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，最終導致脂質、蛋白質和核酸等大分子受損[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2S暴露增加了保育豬血清中ROS的水平，降低了抗氧化酶T-SOD、CAT和GPX活性，同時增加了MDA含量。MDA為脂質過氧化的產物，其含量的增加預示著氧化應激損傷的產生[23]。因此，以上結果預示著H2S暴露導致保育豬血清氧化還原系統(tǒng)受到了損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬暴露在5、10、15 mg·m-3的H2S環(huán)境中會導致其血清SOD活性降低，MDA含量升高，產生過氧化損傷[24]。高濃度H2S暴露也可引起肉羊機體氧化應激的產生，降低血清SOD、CAT活性，增加MDA水平[11]。許多其他環(huán)境因子如熱應激、濕度和氨氣等同樣也能夠引發(fā)氧化應激，降低肉雞、肉牛血清抗氧化酶活性，升高MDA含量[25-27]。雖然血清中存在抗氧化系統(tǒng)，但長期暴露于高濃度H2S環(huán)境中，隨著氧化應激時間的延長，血清抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，導致抗氧化酶SOD、GPX和CAT的蛋白表達量降低，從而使其酶活性低于正常水平而不足以及時清除大量的ROS，氧化還原狀態(tài)失衡，最終造成氧化損傷[11,28]。

3.2 H2S暴露對保育豬肝組織氧化還原狀態(tài)的影響

Nrf2是細胞氧化還原平衡的主要調節(jié)因子，在正常生理條件下，keap1與細胞質中的Nrf2結合，并促進Nrf2被蛋白酶體降解，而當機體遭受氧化應激時，keap1-Nrf2復合物解偶聯(lián)，導致Nrf2易位至細胞核，與抗氧化反應原件(ARE)結合，誘導抗氧化相關基因和抗氧化酶的表達[40]。哺乳動物抗氧化酶SOD包含SOD1、SOD2和SOD3三種形式；GPX包含GPX1、GPX2、GPX3、GPX4等多種形式，它們各自在機體抗氧化過程中發(fā)揮著重要的作用[36,41]。然而，在外源H2S暴露條件下，關于保育豬Nrf2信號通路的研究鮮有報道。本研究發(fā)現(xiàn)，H2S暴露會引起肝Keap1的mRNA表達降低，同時Nrf2的mRNA表達升高，并提高了SOD2、GPX1、GPX2、GPX4和GSR的mRNA表達，這與肝中抗氧化酶活性升高的結果相對應。本研究結果與其他環(huán)境因素(污染物)造成的氧化應激結果類似。例如，熱應激能夠激活肉雞肝Nrf2信號通路，上調SOD、CAT等抗氧化酶基因的表達，從而導致抗氧化酶活性增加，防止細胞氧化損傷[36]；PM2.5暴露誘導小鼠氧化應激，同時激活了肺中Nrf2信號通路，并增強SOD、CAT等抗氧化酶的表達以及GSH的產生，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)并避免肺部氧化損傷[42]。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)，GSH是內源非酶抗氧化劑中含量最豐富的小分子物質，其能夠直接清除ROS或者參與GPX催化H2O2生成GSSG和水的解毒反應，GSSG在谷胱甘肽還原酶(GSR)的作用下重新還原成GSH，構成的GSH循環(huán)是維持機體氧化還原平衡的重要過程[43]。在本研究中，試驗組GSR的mRNA表達升高，而GSH和GSSG的含量并未發(fā)生顯著變化。這可能是因為GPX活性提高增加了GSH消耗的同時，GSR的mRNA表達上調提高了GSR活性，促進GSSG生成GSH來維持GSH循環(huán)的穩(wěn)態(tài)。

3.3 H2S暴露對保育豬內源性硫化氫代謝的影響

在體內，H2S作為內源性氣體信號分子，在生理和病理過程中發(fā)揮重要的作用[44]。內源性H2S主要由CBS、CSE和3-MST三種酶催化生成[45]，這3種酶均存在于肝中，且CSE和CBS是肝中H2S產生的主要貢獻者[15,46]。高濃度H2S通過抑制線粒體細胞色素C氧化還原酶和線粒體呼吸而產生細胞毒性，為維持機體H2S適當?shù)纳硭?，絕大多數(shù)游離H2S會立即通過氧化、甲基化以及與金屬蛋白結合進行代謝[39,47]。其中，肝線粒體中的氧化是H2S分解代謝的主要途徑，該途徑包括SQR、SUOX等幾種功能相關的酶，共同協(xié)作催化H2S分解[16,17]。

準確測定血液、組織和細胞內源性H2S水平對研究其在病理生理環(huán)境中生物學功能至關重要[48]。此外，肝是內源性H2S產生與分解代謝的主要場所[49]，本研究通過檢測血清和肝組織中的H2S含量以及H2S合成與分解代謝酶的mRNA表達來研究H2S暴露對保育豬機體H2S穩(wěn)態(tài)的影響。結果表明，H2S暴露導致血清和肝中的內源性H2S水平顯著下降，同時CBS和CSE的mRNA表達顯著降低，但SQR和SUOX的mRNA表達無顯著變化。產生上述結果的原因可能是長期暴露于較高外源H2S環(huán)境下，機體為維持內源性H2S的穩(wěn)態(tài)，通過負反饋調節(jié)機制，抑制內源H2S合成酶相關基因的表達，進而減少內源性H2S的產生，而對分解代謝過程無顯著影響，最終導致內源性H2S含量降低[18]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，15 mg·m-3H2S暴露28 d，斷奶仔豬血清、肝、心、腎中H2S含量以及肝中H2S合成酶CSE、CBS的mRNA表達也存在降低的現(xiàn)象[18]。此外，腹腔注射高劑量的外源H2S供體NaHS，發(fā)現(xiàn)小鼠肝中H2S含量以及CSE基因表達也出現(xiàn)顯著降低[50]，與本研究結果類似。H2S的生理濃度是維持體內細胞穩(wěn)態(tài)的重要因素，而異常的H2S濃度以及H2S代謝失調通常與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展有關[51-53]。因此，本研究中內源H2S水平以及其合成能力的降低可能預示著肝功能異常和機體疾病的發(fā)生。

4 結 論

在本試驗條件下，30 mg·m-3H2S暴露28 d，導致保育豬血清抗氧化系統(tǒng)受損，而肝中Nrf2/Keap1信號通路的激活使肝免受氧化損傷；此外，H2S暴露抑制了保育豬內源性H2S的合成代謝。