芝麻枯萎病拮抗菌的分離、鑒定及防效研究

常淑嫻，馬 琴，曲文文，張海洋，苗紅梅，段迎輝

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 芝麻研究中心/河南省特色油料基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

芝麻枯萎病由尖孢鐮刀菌芝麻?；停‵usarium oxysporumf.sp.sesami，F(xiàn)OS）侵染引起，是芝麻生產(chǎn)上的重要土傳真菌病害，可在芝麻全生育期產(chǎn)生危害，常造成植株枯萎、籽粒瘦癟及油脂酸價(jià)上升，對(duì)芝麻產(chǎn)量、籽粒外觀和加工品質(zhì)具有較大影響[1-3]。芝麻枯萎病在非洲、亞洲、美洲等世界芝麻傳統(tǒng)生產(chǎn)國(guó)均有不同程度的發(fā)生[4]，在我國(guó)該病害主要發(fā)生在東北、西北、華北、黃淮及江淮北部，常年發(fā)病率為15%左右，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)30%～40%[2，5]。

研究表明，采用抗病品種結(jié)合化學(xué)、農(nóng)業(yè)和生物防治措施能夠?qū)χヂ榭菸∵M(jìn)行持續(xù)、有效地防控。然而，受物種特性限制，對(duì)該病害表現(xiàn)免疫或高抗的芝麻種質(zhì)資源比例較低[2，6]，這極大地影響了抗病育種工作的進(jìn)展，致使生產(chǎn)上主推芝麻品種的枯萎病抗性表現(xiàn)不足。另外，我國(guó)有限的可耕種土地資源限制了輪作倒茬等農(nóng)業(yè)防控措施的推廣和實(shí)施。因此，使用化學(xué)農(nóng)藥仍是目前防治芝麻枯萎病的最主要方法。但由于尖孢鐮刀菌能夠以菌絲體、分生孢子和厚垣孢子在土壤中病殘?bào)w上長(zhǎng)期以腐生方式存活[5]，單一采用化學(xué)農(nóng)藥通常不能達(dá)到預(yù)期的防控效果[7]，且農(nóng)藥的大量使用會(huì)進(jìn)一步造成產(chǎn)品農(nóng)藥殘留、生態(tài)環(huán)境污染等問(wèn)題。近年來(lái)，生物防治措施因其安全、高效、環(huán)境友好等特性受到廣泛關(guān)注，相應(yīng)生防菌的篩選及微生物菌劑的開(kāi)發(fā)也成為作物病害生物防治的重點(diǎn)研究方向[8-9]。目前，利用鑒定的木霉菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等多種生防真菌、細(xì)菌和放線菌防治作物枯萎病已有諸多報(bào)道[10-11]，但關(guān)于芝麻枯萎病生防菌的研究尚較少。鑒于此，通過(guò)收集來(lái)自我國(guó)不同省份的芝麻、藎草和紫花地丁根際土壤樣品，系統(tǒng)開(kāi)展芝麻枯萎病拮抗菌株的分離與篩選，鑒定獲得對(duì)芝麻枯萎病具有顯著防治效果的生防菌株，并明確其生物學(xué)特征，以期為開(kāi)發(fā)出適于芝麻枯萎病安全高效防控的生防菌劑奠定技術(shù)和材料基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

2011－2013 年在我國(guó)河南、河北、陜西、山西、湖北、新疆6個(gè)省份（區(qū)）采集芝麻、藎草和紫花地丁根際土壤樣本共33份，進(jìn)行土壤微生物分離與純化后，-70 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

供試FOS 菌株HSFO 09100 和HSFO 10044[12]及我國(guó)芝麻主栽品種豫芝11 號(hào)種子均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 購(gòu)買胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）和放線菌分離瓊脂（AIA）培養(yǎng)基，參照說(shuō)明書(shū)配制胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基；馬鈴薯葡萄糖蛋白胨瓊脂（PDK）培養(yǎng)基按照配方（PDB 20 g，蛋白胨10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL）配制。

1.2.2 土壤微生物分離與純化 稱取20 g 土壤樣品，加入180 mL 無(wú)菌水，120 r/min 振蕩攪拌30 min。將土壤懸液稀釋103、104、105倍。取梯度稀釋的土壤懸液分別均勻涂布于1/10 TSA、1/10 PDA（含有50 μg/mL 鏈霉素）和AIA 培養(yǎng)基平板上，分別于28 ℃條件下倒置培養(yǎng)1～2 d、4～5 d 和6～7 d。待細(xì)菌、真菌和放線菌菌落長(zhǎng)出后，用無(wú)菌牙簽挑取形態(tài)不同的菌落，于相應(yīng)培養(yǎng)基表面劃線分離純化。將純化后的細(xì)菌、真菌和放線菌菌株分別于50%、30%和30%甘油中-70 ℃冷凍保存。

1.2.3 土壤微生物拮抗作用測(cè)定 采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法分析土壤微生物對(duì)FOS 菌株的拮抗作用。將FOS 菌株活化后接種于PDA 平板上培養(yǎng)，使用無(wú)菌打孔器打取菌餅，分別放置于PDK、PDA 和AIA培養(yǎng)基平板中央。同時(shí)將已分離純化的細(xì)菌、真菌和放線菌菌株分別點(diǎn)種于PDK、PDA 和AIA 培養(yǎng)基平板上，接種點(diǎn)距離FOS 菌餅25 mm。28 ℃條件下培養(yǎng)6 d，觀察并測(cè)量抑菌圈大小。

1.2.4 芝麻幼苗期拮抗菌防治效果測(cè)定 將供試FOS 菌株接種到PDB 培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)3 d，收集分生孢子，加入無(wú)菌水調(diào)整孢子懸浮液濃度至1×106cfu/mL。按照2∶6∶3∶18的體積比依次加入FOS 孢子懸浮液、無(wú)菌蛭石、篩選出的拮抗細(xì)菌菌液（1×108cfu/mL）和無(wú)菌土，混合均勻后分裝入營(yíng)養(yǎng)缽中。參照仇存璞等[5]的方法對(duì)芝麻種子進(jìn)行消毒和催芽，將露白的種子播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽播種9～13 枚種子。以清水拌土處理作為陰性對(duì)照，以FOS 菌株接種處理作為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)置4個(gè)重復(fù)。播種后將營(yíng)養(yǎng)缽放置于人工氣候箱內(nèi)，培養(yǎng)溫度25～28 ℃、相對(duì)濕度60%、光/暗=15 h/9 h。處理后第18 天，依據(jù)仇存璞等[5]的芝麻枯萎病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查各營(yíng)養(yǎng)缽中芝麻幼苗枯萎病的發(fā)生情況，計(jì)算病情指數(shù)和生防菌的防治效果。

1.2.5 生防細(xì)菌形態(tài)特征觀察及生理生化特性測(cè)試 參照東秀珠等[13]的方法對(duì)篩選出的拮抗細(xì)菌的形態(tài)特征和生理生化特性進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)接細(xì)菌菌株于TSA 培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。采用孔雀綠復(fù)紅染色法對(duì)細(xì)菌菌株進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其有無(wú)芽孢形成。同時(shí)，利用透射電子顯微鏡觀察細(xì)菌菌體的形態(tài)。另外，對(duì)細(xì)菌菌株進(jìn)行革蘭氏染色、淀粉水解、氧化酶、接觸酶、檸檬酸鹽和丙酸鹽利用、葡萄糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、V-P、吲哚和硫化氫產(chǎn)生、硝酸鹽還原、甲基紅、精氨酸、鹽耐受性（1%NaCl、3%NaCl、5%NaCl、7%NaCl、10%NaCl）等19項(xiàng)生理生化指標(biāo)測(cè)試。

1.2.6 基于16S rDNA 序列的生防菌株分類鑒定

采用CTAB 法提取拮抗細(xì)菌的基因組DNA，利用引 物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)16S rDNA 序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）包括：10×PCR緩沖液5 μL、dNTP（10 mmol/L）5 μL、引物（10 μmol/L）各0.5 μL、DNA 模板1.5 μL、Taq酶（5 U/μL）0.25 μL、超純水37.25 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃3 min；94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1.5 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化后，送交生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序獲得的16S rDNA 序列于NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，下載其同源序列，利用MEGA 5.2 軟件以鄰接（Neighbor-joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并通過(guò)Bootstrap（1 000 次）分析檢驗(yàn)進(jìn)化樹(shù)各分支的置信度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并應(yīng)用SPSS 22.0 軟件的Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物的分離與純化

對(duì)取自河南、河北、陜西、山西、湖北、新疆6 個(gè)省份（區(qū)）的芝麻、藎草和紫花地丁根際土壤樣品（共33份）進(jìn)行微生物分離和培養(yǎng)，共獲得微生物菌株2 146株，包括細(xì)菌1 077株（50.19%）、真菌515株（24.00%）和放線菌554株（25.81%）（表1）。

表1 33份根際土壤樣品中分離獲得的微生物種類及數(shù)量Tab.1 Statistics of type and number of microorganism strains isolated from 33 rhizospheric soil samples

2.2 土壤微生物對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用

利用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定土壤微生物對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗效果。在已分離的2 146 株微生物菌株中，共發(fā)現(xiàn)17株細(xì)菌、10株真菌和51株放線菌對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)具有拮抗作用（抑菌帶≥0.1 cm），其中4株細(xì)菌和25株放線菌的抑菌帶≥0.5 cm，以細(xì)菌菌株SF3-33和SF4-11對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗效果最好，最大抑菌帶均達(dá)到1.0 cm（圖1）。

圖1 細(xì)菌菌株SF3-33（a）和SF4-11（b）對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果Fig.1 Antagonistic activity of the isolated bacterial strains SF3-33（a）and SF4-11（b）against Fusarium oxysporum

2.3 拮抗細(xì)菌對(duì)芝麻枯萎病的防治效果

為評(píng)估細(xì)菌菌株SF3-33和SF4-11對(duì)芝麻枯萎病的防治效果，分別以強(qiáng)致病性FOS 菌株HSFO 09100 和HSFO 10044 對(duì)生防菌（SF3-33 和SF4-11）拌土處理進(jìn)行接種，調(diào)查芝麻苗期枯萎病的發(fā)生情況。結(jié)果（表2）顯示，接種HSFO 09100 和HSFO 10044 菌株第18 天，豫芝11 號(hào)幼苗病情指數(shù)分別為81.36和55.90；SF3-33菌液拌土處理豫芝11號(hào)幼苗的病情指數(shù)分別為22.60 和9.09，苗期枯萎病防治效果分別為72.22%和83.74%；SF4-11 菌液拌土處理豫芝11 號(hào)幼苗病情指數(shù)分別為30.00 和25.38，苗期枯萎病防治效果分別為63.13%和54.61%?？梢?jiàn)，細(xì)菌菌株SF3-33 和SF4-11 對(duì)苗期芝麻枯萎病均具有顯著的防治效果（P＜0.01）。

表2 細(xì)菌菌株SF3-33和SF4-11菌液處理對(duì)芝麻幼苗期枯萎病的防治效果Tab.2 Control effect of the bacterial strains SF3-33 and SF4-11 on sesame Fusarium wilt at seedling stage

2.4 細(xì)菌菌株SF3-33和SF4-11的鑒定

為鑒定細(xì)菌菌株SF3-33 和SF4-11 的種屬分類，對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)特征觀察，并測(cè)定其生理生化特性。結(jié)果顯示，SF3-33菌株菌落白色，近圓形，直徑2～3 mm，表面干燥皺褶，不透明，較黏稠，易挑?。▓D2a、b、c）；革蘭氏染色、淀粉水解、氧化酶、接觸酶、檸檬酸鹽和丙酸鹽利用、葡萄糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、甲基紅、V-P、硝酸鹽還原以及耐鹽性測(cè)試均顯示陽(yáng)性（表3）。SF4-11菌株菌落牙白色，近圓形，直徑1～2 mm，表面干燥皺褶，不透明，易挑取（圖2d、e、f）；革蘭氏染色、淀粉水解、接觸酶、檸檬酸鹽利用、葡萄糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、V-P、硝酸鹽還原、精氨酸及耐鹽性測(cè)試均顯示陽(yáng)性（表3）。

圖2 細(xì)菌菌株SF3-33和SF4-11的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of the bacterial strains SF3-33 and SF4-11

表3 細(xì)菌菌株SF3-33和SF4-11的生理生化測(cè)試結(jié)果Tab.3 Physiological and biochemical indicators of the bacterial strains SF3-33 and SF4-11

進(jìn)一步對(duì)細(xì)菌菌株SF3-33和SF4-11進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。將測(cè)序獲得的2 株菌株16S rDNA 序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)后，與其同源序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示，菌株SF3-33 的16S rDNA 序列（GenBank 登錄號(hào)：MZ227383）與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）同源性最高，序列相似性為99%（圖3）；菌株SF4-11的16S rDNA序列（GenBank登錄號(hào)：MZ227384）與皮奧顯亞類芽孢桿菌（Paenibacillus peoriae）同源性最高，序列相似性為99%（圖4）。結(jié)合生物學(xué)特征及生理生化特性分析結(jié)果，可確定生防菌株SF3-33 和SF4-11 分別為地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）和皮奧顯亞類芽孢桿菌（P.peoriae）。

圖3 生防細(xì)菌SF3-33的16S rDNA序列進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of the 16S rDNA sequence of the biocontrol bacterial strain SF3-33

圖4 生防細(xì)菌SF4-11的16S rDNA序列進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of the 16S rDNA sequence of the biocontrol bacterial strain SF4-11

3 結(jié)論與討論

對(duì)枯萎病等土傳病害的有效防控是目前作物生產(chǎn)中面臨的主要難題。與傳統(tǒng)化學(xué)、農(nóng)業(yè)防控措施相比，生物防治具有安全、高效、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)得到了廣泛關(guān)注和深入研究，并已逐漸成為替代化學(xué)防治的有效方法。植物病害生物防治通常利用有益微生物及其代謝產(chǎn)物對(duì)病害的發(fā)生進(jìn)行預(yù)防或控制[14]，因此，有益生物的發(fā)掘和鑒定是開(kāi)發(fā)生物制劑并實(shí)施生物防治的關(guān)鍵。本研究從來(lái)自我國(guó)不同省份的33 份根際土壤樣本中分離獲得了2 146 個(gè)微生物菌株，進(jìn)一步通過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)分析，篩選出對(duì)尖孢鐮刀菌具有顯著拮抗作用的細(xì)菌和放線菌共29 株（抑菌帶≥0.5 cm），其中細(xì)菌菌株SF3-33和SF4-11的拮抗效果最好。盡管除細(xì)菌菌株SF3-33 和SF4-11 外，尚未驗(yàn)證其他27 株已分離微生物對(duì)芝麻枯萎病的防治效果，但大規(guī)模拮抗微生物的篩選仍能為生防菌劑的開(kāi)發(fā)提供可利用的資源材料。

目前，已被大量研究并應(yīng)用的生防微生物主要為細(xì)菌、真菌、放線菌等[14-16]。其中，細(xì)菌由于種類繁多、繁殖速度快且能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)等特性，在作物真菌病害防治中具有極大的應(yīng)用潛力[17-18]。早期廣泛應(yīng)用的放射土壤桿菌（Agrobactorium radiobact）K84 菌系能夠有效預(yù)防由根瘤土壤桿菌（A.tumefaciens）引起的桃、櫻桃、葡萄、玫瑰、毛白楊等植物的冠癭病[19-20]。而利用解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、短小芽孢桿菌（B. pumilus）和枯草芽孢桿菌（B.subtilis）等芽孢桿菌屬（Bacillus）幾個(gè)種開(kāi)發(fā)的生物殺菌劑，也已在世界范圍內(nèi)用于防治由鐮刀菌、絲核菌、歐文氏菌等數(shù)十種病原菌引起的糧食、經(jīng)濟(jì)、園藝作物病害[21-23]。本研究基于已分離土壤微生物對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗效果，優(yōu)先選擇細(xì)菌菌株SF3-33 和SF4-11 進(jìn)行芝麻苗期枯萎病防效測(cè)試。結(jié)果顯示，這2株細(xì)菌能夠有效防治芝麻苗期枯萎病，且最大防效分別達(dá)到83.74%和63.13%，表明其在芝麻枯萎病生物防治上具有良好的應(yīng)用潛力。

與本研究首次從土壤中分離獲得對(duì)芝麻枯萎病具有生防作用的根際細(xì)菌不同，王俊芳等[24]從健康芝麻根系中分離得到3株可顯著拮抗尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的內(nèi)生細(xì)菌A21、G20 和G36，其對(duì)芝麻苗期枯萎病的防效分別為52%、40%和67%。根際和內(nèi)生細(xì)菌均是生防細(xì)菌的重要來(lái)源。相較于內(nèi)生細(xì)菌，SF3-33 和SF4-11 可能與其他根際細(xì)菌相似，更易在植物根部定殖并產(chǎn)生較強(qiáng)的拮抗作用，能夠成為防御病原菌初始侵染的重要生防因子。另外，在已報(bào)道的具有生防能力的多種根際細(xì)菌中，假單孢菌屬（Pseudomonas）和芽孢桿菌屬（Bacillus）部分菌株還可作為促生菌，促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)，提高作物產(chǎn)量[25]。

SF3-33 和SF4-11 分別被鑒定為地衣芽孢桿菌和皮奧顯亞類芽孢桿菌。地衣芽孢桿菌是芽孢桿菌中應(yīng)用價(jià)值較大的生防細(xì)菌，其能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)位、產(chǎn)生拮抗物質(zhì)、誘導(dǎo)寄主植物抗病性以及促進(jìn)植物生長(zhǎng)等作用有效防治多種植物病害[26]。研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌FJAT-4能夠有效抑制尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)，且可通過(guò)產(chǎn)生Fengycin 和Surfactin 類脂肽物質(zhì)發(fā)揮其拮抗作用[27]。令利軍等[28]使用地衣芽孢桿菌TG116 對(duì)黃瓜進(jìn)行灌根處理，可快速誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性相關(guān)防御酶活性的升高，從而在一定程度上增強(qiáng)黃瓜對(duì)枯萎病菌的抗性。皮奧顯亞類芽孢桿菌也已被報(bào)道能夠用于植物病害的生物防治。BUDI等[29]發(fā)現(xiàn)，皮奧顯亞類芽孢桿菌主要通過(guò)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、蛋白酶等水解酶類抑制土傳病害病原菌的生長(zhǎng)。VON DER WEID等[30]進(jìn)一步指出，皮奧顯亞類芽孢桿菌不僅具有抑菌能力，而且能夠有效固氮，可作為潛在的植物生防因子和生長(zhǎng)促進(jìn)劑。本研究雖已展示了細(xì)菌菌株SF3-33 和SF4-11 所具有的生防應(yīng)用潛力，但目前仍不清楚這2株菌株防治芝麻枯萎病的作用機(jī)制及其在大田中對(duì)芝麻成株期枯萎病的實(shí)際防效。因此，下一步將系統(tǒng)分析SF3-33 和SF4-11 菌株的定殖能力、促生作用及對(duì)根際微生物的影響，并研究其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)和可能存在的其他生防機(jī)制，為后續(xù)相關(guān)生防制劑的開(kāi)發(fā)和大田應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。