不同佐劑對病毒滅活疫苗免疫效果的影響

文│王林浩 丁樹龍 陳鼎 藺凡 羅瑤瑤 劉金平（青島易邦生物工程有限公司）

在生豬養(yǎng)殖中很容易感染豬細小病毒（PPV），導(dǎo)致妊娠期母豬流產(chǎn)、死胎、畸形胎等，還可能致使母豬不孕，仔豬出現(xiàn)皮膚炎癥與腹瀉等情況。此類病毒在全世界豬群內(nèi)傳播，威脅著整個養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。在20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)PPV后，許多國家陸續(xù)檢測到其抗體與病毒，并開始研究滅活疫苗。本試驗以PPV HN-4株為例，根據(jù)其生物學(xué)特性，針對不同佐劑對PPV滅活疫苗在豬體中的免疫效果進行對比分析，為臨床PPV預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。

一、試驗材料與方法

1.材料與設(shè)備。

試驗材料：PPV油乳佐劑疫苗、PPV鋁膠佐劑疫苗、納米鋁膠佐劑疫苗、市場銷售的油乳劑疫苗與PPV蜂膠疫苗；所用動物為出生一個月的斷奶仔豬，數(shù)量為24頭，經(jīng)過HI和ELISA檢驗后，PPV抗體呈陰性。

儀器設(shè)備：源于蘇靜集團的超凈工作臺；源于上海寶峰集團的全波長酶標(biāo)儀，型號為Thermo Fisher Scientific；源于欣康醫(yī)療器械公司的微量96孔血凝板；源于美國的型號為Accuri C6流式細胞儀；源于BioXL公司的ELISA試劑盒；源于日本Sanyo的二氧化碳培養(yǎng)箱。

2.操作方法。將試驗所用的24頭仔豬隨機分成6組，每組4頭。A組注射PPV油乳佐劑疫苗，每頭2毫升；B組注射PPV鋁膠佐劑疫苗，每頭2毫升；C組注射納米鋁膠佐劑疫苗；D組注射市場銷售的油乳劑疫苗；E組注射PPV蜂膠疫苗，每頭2毫升；F組注射生理鹽水，每頭2毫升。上述各組均采用頸部肌肉免疫方式，在間隔14天后以相同劑量再次免疫。

3.測定方法。

（1）抗體水平檢測。在接種0～6周之內(nèi)，每周隨機選取3頭豬，對其前腔靜脈位置采集血液樣本，將血清分離后備用；將分離后的血清放入溫度為56℃的環(huán)境下，水浴0.5小時，通過酸性為25%高嶺土處理后，再用HI檢驗其抗體水平，生成抗體動態(tài)規(guī)律曲線；根據(jù)ELISA試劑盒的操作流程進行檢測，借助ELISA原理對PPV抗體進行檢驗；抗體效價以標(biāo)記酶的OD630指標(biāo)為衡量標(biāo)準(zhǔn)，如若結(jié)果超過0.4，則為“陽性”；如若在0.2～0.4范圍內(nèi)則為“可疑”，如若結(jié)果低于0.2則為“陰性”。

（2）T淋巴細胞亞群檢測。在接種0～6周之內(nèi)，每周隨機選取3頭豬，對其前腔靜脈位置采集血液樣本，檸檬酸鈉抗凝，分離淋巴細胞，利用PBS溶液控制細胞數(shù)量，將其提升到5.0×106/毫升，再利用流式細胞儀對T淋巴細胞亞群進行檢驗。

（3）血清抗體效價測定。在免疫接種3周后，隨機選取3頭豬進行靜脈采血，血清分離后，放入溫度為-20℃的冰箱內(nèi)保存，以備檢測。按照MEM培養(yǎng)液體積1%接種PPV疫苗，放入96孔板內(nèi)，每個孔為100微升，在溫度為37℃、濃度為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入冷卻后的乙醇，100微升孔固定，風(fēng)干后，再加入5%脫脂乳到孔中，密封30分鐘，用PBST洗滌3次。將事先準(zhǔn)備好的血清用PBS稀釋，再將100微升孔加入到96孔板內(nèi)，在溫度為37℃的搖床內(nèi)孵育60分鐘，利用PBSH洗滌3次后，將96孔板放入熒光顯微鏡下觀察可得。

4.統(tǒng)計學(xué)處理。利用Excel和SPSS12.5軟件對測定數(shù)據(jù)進行整合分析，得出各項指標(biāo)均值，以Means±SD形式表示，再用SPSS軟件實施Dun can’s深層分析。

二、試驗結(jié)果

1.免疫豬血清HI檢測結(jié)果。根據(jù)HI試驗結(jié)果可知，不同組別的樣本在接種后均會對豬體產(chǎn)生刺激，進而形成HI抗體，且抗體水平與免疫時長具有正相關(guān)關(guān)系，在接種后第一周，C組抗體水平明顯超過B組；在接種第3周后，C組抗體水平達到最高值，與A組相比提前14天，與B組相比提前7天；A組抗體峰值相對最高，為11.58log2，C組次之，為11.24log2，B組排名第三，為10.95log2；以上三種疫苗在抗體峰值方面均超過D組與E組。在抗體水平方面，接種后第6周C組的抗體滴度達到9.72log2，A組為11.45log2，B組為9.87log2，這意味著B組的抗體滴度流失相對較快，A組相對較慢。

2.豬血清內(nèi)抗體水平。經(jīng)過ELISA試劑盒檢測后，對不同時段收集到的血清抗體樣本進行匯總，根據(jù)試驗結(jié)果可知，不同組別樣本在接種疫苗后均會使豬體受到刺激，形成抗PPV抗體，但在抗體水平、峰值時間方面有所區(qū)別。在接種后第二周，C組抗體水平超過B組；在接種第3周后，C組的抗體水平達到最大值，與A組相比提前7天；在接種第4周后，A組的抗體水平提高到最大，且與剩余組別間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05；在抗體峰值方面，A組為最高，OD630值為0.624，C組次之，為0.431，B組排名第三，為0.264。

3.外周血內(nèi)T淋巴細胞亞群變化。根據(jù)圖1可知，在接種完畢后，各組樣本的外周血T淋巴細胞亞群均發(fā)生改變，且數(shù)量與原本相比都有一定程度的提升，C組領(lǐng)先，與F組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05；各組間差異不存在統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。

三、討論

1.HI檢測后豬抗體水平分析。血凝試驗在PPV檢測中的意義重大，該試驗的操作便捷、經(jīng)濟性強，但對試劑配置要求較高，試劑準(zhǔn)確度、判定時間、豚鼠紅細胞配置濃度等都會影響試驗成敗。在試驗期間，為了確保準(zhǔn)確性與特異性不受影響，可用酸性高嶺土對準(zhǔn)備檢測的血清進行處理，將內(nèi)部非特異性血凝制物去除。根據(jù)研究結(jié)果可知，A組、B組和C組在接種后均會形成較高抗體滴度。三者中的C組抗體峰值出現(xiàn)時間較早，在接種后第三周便可達到最大值，與B組相比提前7天，與A組相比提前14天，且C組抗體水平在接種后首周明顯超過B組，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05，但C組抗體滴度消耗相對較快，在三種疫苗中，A組抗體峰值水平為最高。

2.ELISA檢測抗體水平分析。針對每周采集到的血清樣本利用ELISA試劑盒進行檢測，在接種后不同組別樣本在接種疫苗后均會使豬體受到刺激，形成抗PPV抗體，但在抗體水平、峰值時間方面有所區(qū)別。在接種后第二周，C組抗體水平超過B組；在接種第3周后，C組的抗體水平達到最大值，與A組相比提前7天；在接種第4周后，A組的抗體水平提高到最大，與剩余組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。對于上述兩種抗體檢測方式來說，在抗體消長規(guī)律方面基本相同，根據(jù)結(jié)果可知，三種佐劑疫苗中的C組抗體產(chǎn)生時間、峰值產(chǎn)生事件均相對較早，但抗體消降速度也較快，A組雖然抗體產(chǎn)生時間較晚，但消降速度較慢，持續(xù)時間相對較長。本研究對納米佐劑能夠提前誘導(dǎo)PPV的抗體應(yīng)答進行驗證，結(jié)果與前人研究基本相同，說明納米佐劑之所以能夠促進豬抗體應(yīng)答提高，可能受納米佐劑中的載體結(jié)構(gòu)特性影響。

◎圖1 免疫后豬外周血內(nèi)T淋巴細胞占比情況

3.疫苗誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答。該試驗對豬體外周血內(nèi)的T淋巴細胞群進行檢驗，通過流式細胞儀完成，對多種佐劑疫苗接種后的細胞應(yīng)答情況進行研究。根據(jù)研究結(jié)果可知，各組疫苗均可對豬體產(chǎn)生刺激，激發(fā)細胞免疫力，但不同組別之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。與B組相比，C組T淋巴細胞亞群的占比相對較高，二者無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05，這說明三種疫苗均可對豬體細胞免疫起到一定強化功效。該試驗制備的三種PPV疫苗在經(jīng)過接種后，利用HI檢測與ELISA檢測后，均說明該疫苗可對豬體特異性產(chǎn)生促進作用，借助流式細胞技術(shù)對T淋巴細胞亞群變動情況進行檢測，根據(jù)研究結(jié)果可知，PPV疫苗均可促進機體細胞免疫功能提升，說明具有較強的免疫原性、反應(yīng)原性，為PPV疫苗研發(fā)與推廣應(yīng)用打下堅實基礎(chǔ)。