人參果果汁分段酶解提取工藝優(yōu)化

杜 琨

(武警工程大學(xué) 裝備管理與保障學(xué)院，陜西 西安 710086)

0 引言

【研究意義】人參果又名長壽果，原產(chǎn)于南美洲。人參果是一種高營養(yǎng)價值水果，口感清甜多汁，果實中富含蛋白質(zhì)、維生素C和多種微量元素，而脂肪和糖分含量則相對較低[1-2]。由于人參果的硒含量遠(yuǎn)高于一般水果和蔬菜，因此被譽為生命火種、抗癌之王[3]。相關(guān)研究表明，人參果中含有多糖、生物堿及糖苷等活性成分，能夠幫助增強(qiáng)機(jī)體免疫力，發(fā)揮降血脂、抗腫瘤和延緩衰老等功效，具有獨特的食用和藥用價值[4-5]。自20世紀(jì)80年代引入我國后，人參果的種植規(guī)模和產(chǎn)量逐年增加，國內(nèi)人參果的適栽區(qū)主要分布在云南、甘肅及青海等地。人參果生長季節(jié)性強(qiáng)，收獲期短，加上果實含水量大，采后不耐儲存，極易腐敗變質(zhì)，造成浪費[6]。因此，開展人參果深度開發(fā)利用研究，探究提高人參果出汁率的工藝條件，對提高其市場附加值，促進(jìn)農(nóng)民增收具有重要現(xiàn)實意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蘇鳳賢等[7]運用響應(yīng)面法和灰色關(guān)聯(lián)分析建立相應(yīng)的回歸模型，優(yōu)化果膠酶影響人參果出汁率的工藝參數(shù)。近年來，以人參果為原材料制備的新型果汁飲品，不僅營養(yǎng)價值豐富，還兼具特有的果香和風(fēng)味，備受消費者青睞[8-9]。但在果汁加工過程中，鮮果出汁率低，原材料損失嚴(yán)重，導(dǎo)致生產(chǎn)成本進(jìn)一步增加。目前，常見的果汁制備技術(shù)有壓榨法和生物酶解法等。生物酶解法是利用酶的水解作用破壞植物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)和植物組織中的汁液釋放出來[10]。研究證實不同酶制劑的組合和協(xié)同使用，可進(jìn)一步增大作用范圍，顯著提高鮮果出汁率[11-12]。程紅等[13]采用復(fù)合酶制劑法對藍(lán)莓果汁提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳工藝：果膠酶∶纖維素酶為3∶1，酶解溫度為50℃，酶解時間180 min，在此條件下藍(lán)莓果汁的出汁率為73.37%。纖維素酶和半纖維素酶能有效分解水果中的纖維素和半纖維素，二者同時使用具有協(xié)同增效作用，且添加半纖維素酶還能大大降低纖維素酶的用量[14]。添加木瓜蛋白酶能有效分解植物組織的蛋白質(zhì)和多肽中精氨酸和賴氨酸的羧基端，并能優(yōu)先水解N-端具有2個羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽鍵，從而提高出汁率[15]?！狙芯壳腥朦c】目前對提高人參果出汁率的研究較少，且大都采用單一酶解法。由于人參果的細(xì)胞壁是由纖維素、半纖維素、親水性果膠和少量結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，要提高人參果的出汁率，必須充分破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)組成。然而目前鮮見類似的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用單因素試驗研究果膠酶、混合酶及木瓜蛋白酶不同添加量及其在不同溫度、pH及酶解時間條件下人參果的出汁率，并在此基礎(chǔ)上采用分段酶解法對人參果汁的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，考察不同酶解體系對人參果出汁率的影響，旨在提高鮮果的出汁率，為人參果果汁的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人參果 產(chǎn)自甘肅威武天梯山，市購。

1.1.2 試劑 果膠酶，上海源葉生物科技有限公司；纖維素酶、半纖維素酶，北京索萊寶科技有限公司；木瓜蛋白酶，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他化學(xué)試劑，均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備 PL602E電子天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；SP902S破壁機(jī)，蘇泊爾電器；HWSY II-K電熱恒溫水浴鍋，北京長風(fēng)儀器有限公司；PHS-3B雷磁精密pH計，上海精密儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶制劑提取人參果汁的工藝路線

1) 單一酶解處理。新鮮人參果→分揀→清洗、切條→護(hù)色→打漿→調(diào)pH、溫度→加酶→滅酶→壓榨、過濾→澄清→人參果汁

2) 分段酶解處理。新鮮人參果→分揀→清洗、切條→護(hù)色→打漿→調(diào)pH、溫度→加酶1→調(diào)pH、溫度→加酶2→滅酶→壓榨、過濾→澄清→人參果汁

1.2.2 酶解前處理

1) 護(hù)色處理。挑選無腐爛、無霉變的新鮮人參果，在清水中洗凈，去皮，切成3 cm長的小段，用濃度為0.3% VC溶液分別浸泡10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，對比不同浸泡時間下的護(hù)色效果，以未經(jīng)VC溶液浸泡的人參果作為對照組。以人參果漿液的色差值(△E)為評價指標(biāo)，△E越大，表明該處理抑制果汁褐變的效果越好。

2) 打漿破碎。將經(jīng)過護(hù)色處理的瓜條放入破壁機(jī)中，按料液比50∶500(g/L)進(jìn)行破碎打漿得到人參果漿液，置于4℃冰箱備用。

1.2.3 單一酶解法不同因素處理人參果的出汁率 分別考察果膠酶、混合酶及木瓜蛋白酶不同添加量及3種酶制劑在不同溫度、不同pH和不同作用時間條件下對人參果出汁率的影響。其中，混合酶由纖維素酶和半纖維素酶以1∶1的比例混合而成，下同。根據(jù)前期預(yù)試驗的結(jié)果，每個處理3次重復(fù)。

1) 酶制劑用量。試驗設(shè)8個處理，果膠酶、混合酶及木瓜蛋白酶的添加量分別為0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.30 g/L、0.35 g/L、0.40 g/L和0.45 g/L，酶解溫度為50℃，pH 5.0，酶解時間為45 min。

2) 溫度。試驗設(shè)7個處理，果膠酶、混合酶及木瓜蛋白酶的酶解溫度分別為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃。果膠酶、混合酶和木瓜蛋白酶添加量分別為 0.20 g/L、0.25 g/L和0.35 g/L，酶解pH5.0，酶解時間為45 min。

3) pH。試驗設(shè)7個處理，果膠酶、混合酶及木瓜蛋白酶的酶解pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，果膠酶、混合酶和木瓜蛋白酶添加量分別為 0.20 g/L、0.25 g/L和0.35 g/L，酶解溫度為50℃，酶解時間為45 min。

4) 酶解時間。試驗設(shè)8個處理，果膠酶、混合酶及木瓜蛋白酶的酶解時間分別為25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min、55 min和60 min，設(shè)置果膠酶、混合酶和木瓜蛋白酶添加量分別為 0.20 g/L、0.25 g/L和0.35 g/L，酶解溫度為50℃，酶解pH 5.0，酶解時間為45 min。

1.2.4 分段酶解法提取人參果汁的工藝優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，從中選取水解后出汁率較高的果膠酶和混合酶進(jìn)行雙酶組合分段酶解試驗。設(shè)5個處理，包括試驗組〔T1(果膠酶+混合酶)和T2(混合酶+果膠酶)〕及對照組〔T3(果膠酶)、T4(混合酶)和3種酶組合分段處理T5(果膠酶+混合酶+木瓜蛋白酶)〕。每個處理3次重復(fù)。

T1(果膠酶+混合酶)，取打漿后的人參果漿液，調(diào)節(jié)pH 5.0、水浴溫度45℃，添加0.20 g/L果膠酶酶解35 min；保持體系pH 5.0，水浴溫度升至55℃，加入0.25 g/L混合酶，水浴酶解45 min。T2(混合酶+果膠酶)：取打漿后的人參果漿液，調(diào)節(jié)pH 5.0、水浴溫度55℃，添加0.25 g/L果膠酶酶解45 min；保持體系pH 5.0，水浴溫度降至45℃，加0.20 g/L混合酶酶解35 min。T3(果膠酶)，取打漿后的人參果漿液，調(diào)節(jié)pH 5.0、水浴溫度45℃，添加0.20 g/L果膠酶酶解80 min。T4(混合酶)，取打漿后的人參果漿液，調(diào)節(jié)pH 5.0、水浴溫度55℃，添加0.25 g/L混合酶酶解80 min。T5(果膠酶+混合酶+木瓜蛋白酶)，取打漿后的人參果漿液，調(diào)節(jié)pH 5.0、水浴溫度45℃，添加0.20 g/L果膠酶酶解35 min；保持體系pH 5.0，水浴溫度升至55℃，添加混合酶0.25 g/L酶解45 min；再調(diào)節(jié)pH 4.0，水浴溫度降至50℃，加入木瓜蛋白酶0.35 g/L酶解45 min。

1.2.5 指標(biāo)測定

1) 出汁率。根據(jù)榨出的汁液重量與人參果重量的比值進(jìn)行計算得出。

出汁率=榨出的汁液重量/人參果的重量×100%

2) 酶活力。果膠酶活力測定采用次碘酸鈉滴定法[16]；纖維素酶活力測定采用CMC酶活法[17]；半纖維素酶活力測定采用DNS比色法[18]；木瓜蛋白酶活力測定方法參照《蛋白酶制劑》(GB/T 23527—2009)[19]進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Minitab 10.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同浸泡時間人參果漿液的色澤

從圖1看出，隨浸泡時間延長，人參果漿液的色差值(△E)逐漸增大，表明延長作用時間可以有效抑制果汁的褐變現(xiàn)象。當(dāng)浸泡時間超過30 min后，色差值變化幅度不明顯。因此，確定用0.3% VC溶液浸泡護(hù)色處理的最適時間為30 min。

圖1 VC溶液不同浸泡時間人參果漿液的色澤Fig.1 Color of S. muricatum juice with different soaking time in VC solution

2.2 不同水解酶的酶活力

測試結(jié)果表明，不同酶制劑的酶活力不同，其中，果膠酶的酶活力為2 000 U/g，纖維素酶/半纖維素酶混合酶為3 000 U/g，木瓜蛋白酶為2 000 U/g。

2.3 單一酶解法不同因素處理人參果的出汁率

2.3.1 酶添加量 從圖2看出，隨酶用量的增加，各種酶制劑處理人參果的出汁率均呈先急升后平緩趨勢。果膠酶：酶添加量0.10～0.20 g/L時，人參果出汁率顯著提高，從62.0%迅速增至73.6%，是由于果膠酶能破壞人參果中的果膠質(zhì)，使果肉中內(nèi)溶物更多釋放出來，從而提高人參果出汁率。繼續(xù)增加果膠酶用量，酶解作用已基本達(dá)飽和，所以出汁率增加不明顯?；旌厦福寒?dāng)混合酶添加量為0.25 g/L，人參果出汁率為75.8%，繼續(xù)增加混合酶用量出汁率變化不大。木瓜蛋白酶：隨木瓜蛋白酶添加量增加，人參果出汁率不斷升高，當(dāng)木瓜蛋白酶添加量為0.35 g/L時，人參果出汁率達(dá)72.7%，繼續(xù)增加木瓜蛋白酶量，人參果出汁率變化不大。結(jié)合實際生產(chǎn)成本和可操作性，后續(xù)試驗選擇果膠酶添加量為0.20 g/L，混合酶為0.25 g/L，木瓜蛋白酶為0.35 g/L較適宜。

圖2 3種酶不同添加量處理人參果的出汁率Fig.2 Juice yield of S. muricatum under three enzymes with different additive volumes

2.3.2 酶解溫度 從圖3看出，隨著酶解溫度升高各種酶處理人參果出汁率均呈先升后降趨勢。果膠酶：當(dāng)溫度35～45℃時，酶活力逐漸增強(qiáng)，出汁率明顯提升，當(dāng)溫度為45℃，出汁率最高，達(dá)78.2%。溫度繼續(xù)升高，出汁率反而降低。復(fù)合酶：復(fù)合酶處理出汁率的變化趨勢與果膠酶的類似，其作用溫度為55℃時出汁率最高，達(dá)80.0%；之后隨溫度升高出汁率呈下降趨勢。木瓜蛋白酶：其最佳作用溫度為50℃，出汁率為78.0%；溫度超過50℃，出汁率快速下降。綜上，果膠酶的最佳水解溫度為45℃，復(fù)合酶為55℃，木瓜蛋白酶為50℃。

2.3.3 pH 從圖4看出，隨pH增加各種酶處理人參果的出汁率均呈先增后減趨勢。果膠酶：pH 3.0～5.0時，果膠酶的活力逐漸提升，出汁率隨之增大；當(dāng)pH為5.0時，出汁率最高，達(dá)78.7%；pH繼續(xù)升高，出汁率反而降低，是由于過高的pH使果膠酶變性失活，從而導(dǎo)致水解效率下降。復(fù)合酶：隨pH增加復(fù)合酶處理的人參果出汁率呈上升趨勢，當(dāng)pH為5.0時，出汁率最高，為83.4%；之后隨pH增加出汁率呈下降趨勢。木瓜蛋白酶：隨pH增加木瓜蛋白酶處理的人參果出汁率呈上升趨勢，當(dāng)pH為4.0時，出汁率最高，為79.4%；之后隨pH增加出汁率呈下降趨勢。綜上，果膠酶和復(fù)合酶的最佳水解pH均為5.0，木瓜蛋白酶的最佳水解pH為4.0。

圖4 3種酶不同酶解pH處理人參果的出汁率Fig.4 Juice yield of S. muricatum with different pH values during enzymatic hydrolysis process

2.3.4 酶解時間 從圖5看出，隨酶解時間增加各種酶處理人參果的出汁率呈先急升后平緩趨勢。果膠酶：酶解時間25～35 min時，出汁率明顯提升；當(dāng)酶解時間為 35 min時，出汁率為83.6%，繼續(xù)延長酶解時間，出汁率增幅緩慢，酶解時間超過45 min后出汁率略有下降。原因在于酶解時間過長，酶的活性降低，底物濃度也不斷減小，從而影響人參果出汁效果。復(fù)合酶：酶解時間25～45 min時，出汁率迅速提升；當(dāng)酶解時間為 45 min時，出汁率為85.0%，繼續(xù)延長酶解時間出汁率增加不明顯。木瓜蛋白酶：酶解時間25～45 min時，出汁率呈迅速提升趨勢，木瓜蛋白酶水解時間為45 min時出汁率為82.3%；繼續(xù)延長酶解時間，出汁率緩慢增加并趨于穩(wěn)定。結(jié)合實際生產(chǎn)成本選擇果膠酶的最佳酶解時間為35 min，復(fù)合酶和木瓜蛋白酶的最佳酶解時間均為45 min。

圖5 3種酶不同酶解時間處理人參果的出汁率Fig.5 Juice yield of S. muricatum with different enzymatic hydrolysis time

2.4 分段酶處理人參果的出汁率

從圖6看出，不同處理人參果的出汁率為84.72%～94.92%，處理間存在差異，表現(xiàn)為T5>T1>T2>T4>T3。其中，T5分段處理的人參果出汁率最高，達(dá)94.7%，但該方法耗時過長，不利于實際生產(chǎn)和應(yīng)用。T1的分段酶解效果其次，人參果出汁率為92.5%。因此，綜合生產(chǎn)時間及成本等因素，選擇果膠酶+混合酶的分段處理方式作為人參果汁的提取制備方法。

圖6 分段酶處理人參果的出汁率Fig.6 Juice yield of S. muricatum with different different segmented enzymatic treatment patterns

3 討論

植物細(xì)胞中，果膠質(zhì)通常與纖維素以相互結(jié)合的形式存在。由于纖維素是葡萄糖單元通過β-1,4-糖苷鍵鏈接而成的大分子鏈狀聚合物，性質(zhì)穩(wěn)定，因此與纖維素結(jié)合的果膠酶或半纖維素也難以被水解[20-21]。試驗結(jié)果表明，在人參果汁制備過程中，相比于果膠酶的單一作用[7]，果膠酶協(xié)同纖維素酶和半纖維素酶使用是一種高效、節(jié)能、降低成本，并且有效提高人參果出汁率的方法。同時，采用雙酶分段水解較單一酶水解明顯提高人參果汁的出汁率，是由于單一酶酶解時，只能對某一類底物或者固定的酶解位點發(fā)揮作用，酶解效果受到限制，而雙酶組合水解則能較好地發(fā)揮協(xié)同互補(bǔ)作用，提高水解效率。與楊建軍等[11-15]的研究結(jié)果，即不同酶制劑組合和協(xié)同使用，可進(jìn)一步增大作用范圍，顯著提高鮮果出汁率的研究結(jié)論一致。

4 結(jié)論

人參果由于其豐富的營養(yǎng)價值和保健作用，可進(jìn)一步開發(fā)成高附加值的新型飲料。通過單因素試驗探討3種酶(果膠酶、混合酶和木瓜蛋白酶)單獨提取人參果汁的最適酶解參數(shù)，在此基礎(chǔ)上篩選出水解效果較好的果膠酶和混合酶進(jìn)行組合酶分段酶解試驗，得到制備人參果汁的最佳酶解工藝參數(shù)：果膠酶添加量0.20 g/L，溫度45℃，pH 5.0，酶解35 min；然后調(diào)節(jié)pH 5.0，溫度55℃，添加混合酶0.25 g/L，酶解45 min。按此方法人參果的出汁率為92.5%。果膠酶+混合酶的分段水解方式能顯著提高人參果出汁率，可為提高人參果出汁率的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。