硒化鐵皮石斛多糖的制備工藝及抗氧化活性研究

李曉嬌，段紹麗，曹凱紅，宋志姣

(保山學院資源環(huán)境學院，云南 保山 678000)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛(云南省保山市龍陵縣林源石斛開發(fā)有限公司)；無水乙醇、鹽酸、硝酸(四川西隴化工有限公司)；亞硒酸鈉 (山東西亞化學工業(yè)有限公司)；沒食子酸、硫酸亞鐵、抗壞血酸(國藥集團化學試劑有限公司)；冰乙酸、水楊酸(天津市風船化學試劑科技有限公司)；過氧化氫(重慶東方試劑廠)；透析袋(MD44-5M 截分子量：8000-14000，美國聯(lián)合碳化)；以上所用試劑均為分析純。

真空干燥箱 (DZF-6020上海-恒科學儀器廠)；微波爐(G80F23CN3L-C2廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司)；微波消解儀(MARS6美國CEM)；電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICAP7400賽默飛世爾)；傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet iS5賽默飛世爾)。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理 鐵皮石斛鮮條于恒溫干燥箱中60 ℃烘干48 h，粉碎過80目篩，于密封袋密封，置于干燥器中保存，備用。

1.2.2 鐵皮石斛多糖的提取 準確稱取1.2.1獲得的鐵皮石斛粉末5.00 g于500 mL燒杯中，加入300 mL純水，混勻后，置于微波爐內(nèi)間歇加熱2 min(350 W，每次加熱30 s)，然后于60 ℃水浴60 min，提取液趁熱離心過濾(3000 r/m，30 min)，取上層清液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(60 ℃)中濃縮至原體積的1/3，冷卻至室溫。再加入5倍體積的無水乙醇沉析，抽濾，濾渣用無水乙醇洗滌3次后60 ℃真空干燥24 h，得鐵皮石斛多糖提取物，命名為DCP。

1.2.3 鐵皮石斛多糖的硒化 準確稱取0.20 g DCP溶于10 mL水中，加入0.30 g亞硒酸鈉，加入0.30 mL冰乙酸，攪拌均勻，于60 ℃水浴中反應24 h。反應結(jié)束后離心過濾(4000 r/min，30 min)，轉(zhuǎn)移上清液于透析袋中，純水流動透析8 h，透析至加入抗壞血酸5 min透析液不呈現(xiàn)紅色為止[14]。透析結(jié)束后將未透過液(透析袋內(nèi))減壓濃縮至原體積的1/2，然后加入5倍體積無水乙醇于2 ℃下醇析12 h[12-16,17]，真空干燥箱60 ℃干燥24 h得硒化鐵皮石斛多糖，命名為Se-DCP。

1.2.4 Se-DCP的硝化 稱取1.2.3制備的Se-DCP 10.00 mg，于消解罐中，再加入5.0 mL濃硝酸，100 ℃下預消解70 min。取出預消解液在通風櫥中補加入濃鹽酸15.0 mL，繼續(xù)微波消解100 min：微波消解儀設置消解時間為第一步15 min升溫至130 ℃，保持10 min；第二步15 min升溫至150 ℃，保持時間為10 min，第三步15 min升溫至180 ℃，保持10 min，冷卻25 min后取出冷卻至室溫。此時溶液澄清，無沉淀，消解完全。將消解液過濾于50 mL容量瓶中，用少量純水洗滌消解罐3～4次，洗滌液全部轉(zhuǎn)移入容量瓶中，純水定容至刻度線，振蕩搖勻，靜置即為待測樣溶液。

1.2.5 ICP-AES 測定硒的含量 參照程慶龍等[18]的方法稍作修改，ICP-AES測定條件為：RF功率為1150 W，泵速50 r/min，輔助氣流量0.5 L/min，霧化器氣體流量0.5 L/min，樣品沖洗時間20 s，短波范圍7 s。

1.2.6 硒標準曲線的繪制 分別移取0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mL 100 μg/mL的硒標準溶液于100 mL容量瓶中，用0.02%的稀硝酸稀釋至刻度，搖勻。根據(jù)1.2.5的試驗條件，用ICP-AES于196.026 nm下測得其標準曲線方程為Y=29.353X+0.9818，r=0.999 98，如圖1所示。

1.2.7 單因素試驗 按照1.2.3的方法，準確稱取DCP 0.20 g于5只50 mL錐形瓶中，加入10 mL純水溶解。固定亞硒酸鈉用量1.0∶1.5[m(DCP)∶m(亞硒酸鈉)]，硒化溫度60 ℃，硒化時間為24 h，冰乙酸用量0.3 mL，分別考察亞硒酸鈉用量：1.0∶0.5、1.0∶1.0、1∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶2.5 [m(DCP)∶m(亞硒酸鈉)]，硒化時間6、12、24、36、48 h，硒化溫度：40、50、60、70、80 ℃，冰乙酸用量：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL對多糖硒化的影響，按1.2.3方法對反應物進行后處理。每組試驗重復3次。

1.2.8 正交試驗 以單因素試驗結(jié)果為基礎，進行鐵皮石斛多糖硒化工藝的正交優(yōu)化試驗。以亞硒酸鈉用量(A)、硒化時間(B)、硒化溫度(C)進行L9(34)的正交試驗，試驗因素及水平見表1。

1.2.9 Se-DCP對·DPPH的清除能力測定 參考羅敏[15]等的方法，分別取2 mL濃度為0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg/mL Se-DCP樣品溶液(純水配制)于6支比色管中，分別加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液(95%乙醇配制)，振蕩混勻后避光25 ℃下暗反應30 min，反應結(jié)束后在517 nm波長下測定吸光度，抗壞血酸(Vc)作為陽性對照組，純水為空白對照組，平行3次，按照(1)式計算清除率：

在農(nóng)村，上大學，找個體面工作，是許多普通農(nóng)家的期望，但是河南省正陽縣慎水鄉(xiāng)臺天村民兵連基干民兵牛超，卻選擇了回鄉(xiāng)創(chuàng)業(yè)。

清除率(%) =[(A0-A1+A2)/A0]×100

(1)

式中，A0：2 mL純水+2 mL DPPH溶液的吸光度；A1：2 mL Se-DCP (或Vc)+2 mL DPPH溶液的吸光度；A2：2 mL Se-DCP (或Vc)+2 mL 95%乙醇溶液的吸光度。

圖1 硒標準曲線Fig.1 Standard curve of selenium

1.2.10 Se-DCP對·OH的清除能力測定 根據(jù)文獻方法[15,19-21]，分別取2 mL 濃度為0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mg/mL Se-DCP樣品溶液(純水配制)于6支比色管中，然后先加入2 mL 10 mmol/L 的FeSO4溶液，再加入8.8 mmol/L H2O2溶液2 mL，充分混勻后加入2 mL新配制的9 mmol/L水楊酸乙醇溶液，在35 ℃下水浴加熱30 min后于510 nm波長處測其吸光度值。Vc作為陽性對照組，純水為空白對照組，平行3次，按照(1)式計算對·OH的清除率。其中，A0：空白組吸光度，A1：樣品組、陽性對照組的吸光度，A2：2.0 mL 95%乙醇溶液代替9 mmol/L 水楊酸乙醇溶液的吸光度。

表1 正交試驗因素水平

按照(1)式計算清除率。 其中，A0：空白對照吸光度值；A1：樣品組、陽性對照組的吸光度；A2：同體積的純水代替鄰苯三酚的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SSPS 22.0軟件對單因素水平進行多重比較、正交試驗設計和正交結(jié)果方差分析；采用Origin 2019軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Se-DCP的紅外光譜分析

由圖2可知，硒化前后，DCP和Se-DCP的FTIR光譜圖有所變化，但變化不大，表明鐵皮石斛多糖在硒化前后結(jié)構(gòu)上沒有較大的改變。其中Se-DCP的FTIR光譜圖中，3332.31 cm-1為—OH的伸縮振動峰，2920.76 cm-1為糖類CH3、CH2、CH等C—H的伸縮振動峰，1731.79和1639.6 cm-1為C=O的伸縮振動峰，1373.39和1224.74 cm-1為C—H的變角振動峰，1022.05 cm-1處是糖殘基C—O—C和C—O—H鍵的伸縮振動峰，在831.87 cm-1為吡喃葡萄糖的特征吸收峰[13]，在756.55 cm-1處，Se-DCP比DCP多出的峰為亞硒酸酯的特征吸收峰，因此可判斷：DCP分子上發(fā)生了硒化反應，且硒以亞硒酸酯的形式存在[24]。

圖2 DCP和Se-DCP的FTIR光譜圖Fig.2 FTIR spectrogram of DCP and Se-DCP

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 亞硒酸鈉用量對硒含量的影響 由圖3可知，當DCP與亞硒酸鈉質(zhì)量比低于1∶1時，隨著亞硒酸鈉用量的增加Se-DCP中硒含量呈現(xiàn)上升趨勢，用量比為1∶1時，硒含量達到最大為0.75 mg/g；當亞硒酸鈉用量大于1∶1時，隨著亞硒酸鈉用量的增加，硒含量呈下降趨勢，且DCP與亞硒酸鈉質(zhì)量比為1.0∶1.5和1.0∶2.0時，硒含量無顯著差異(P>0.05)，可能的原因是，如果溶液中SeO32-離子濃度太大，會影響Se-DCP的存在狀態(tài)，使部分產(chǎn)物解離，從而影響產(chǎn)物硒含量[25]。

圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同The different lowercase letters in the figure indicate a significant difference (P<0.05), the same as below圖3 亞硒酸鈉用量對硒含量的影響Fig.3 Effect of sodium selenite on selenium content

2.2.2 硒化時間對硒含量的影響 如圖4所示，隨著硒化時間的增加，反應制得的Se-DCP中的硒含量差異顯著(P<0.05)，并呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。在反應時間為12 h時，Se-DCP中的硒含量最高，為0.75 mg/g。硒化時間為6～12 h時，硒含量隨著反應時間的增加而急劇增加，硒化時間大于12 h時，硒含量隨著硒化時間的增加而逐漸減小。原因是，硒化時間短，DCP與亞硒酸鈉反應不充分，導致硒與DCP不能有效結(jié)合；但是當硒化時間過長時，DCP在高溫和酸性條件下發(fā)生降解，影響硒化反應進行。

圖4 硒化時間對硒含量的影響Fig.4 Effect of the selenization time on the selenium content

2.2.3 硒化溫度對硒含量的影響 如圖5所示，當反應溫度在40～60 ℃時，硒含量隨溫度升高而緩慢增加；當溫度在60～70 ℃時，硒含量隨著溫度的上升急劇增大；當溫度為80 ℃時，硒含量與70 ℃時無顯著差異(P>0.05)，說明DCP的硒化基本達到飽和，但是由于多糖在高溫度條件下易分解，因此硒化溫度不宜過高，故選擇60、70、80 ℃進行正交試驗。

圖5 硒化溫度對硒含量的影響Fig.5 Effect of selenization temperature on selenium content

2.2.4 冰乙酸用量對硒含量的影響 如圖6所示，隨著冰乙酸用量的增大，硒含量逐漸增大。在冰乙酸用量大于0.6 mL之后，隨著冰乙酸用量的增加，Se-DCP中的硒含量無顯著差異(P>0.05)。冰乙酸在反應中作為催化劑，適宜的量有助于反應的進行，可以使硒化反應進行得更徹底，促進硒與多糖結(jié)合，當催化劑過量時可能會對反應帶來其它的影響，因此選擇最佳的催化劑用量為0.6 mL。

圖6 冰乙酸用量對硒含量的影響Fig.6 Effect of iced acetic acid dosage on selenium content

2.3 正交試驗

從表2直觀分析和極差分析結(jié)果來看，最佳工藝條件均為A1B3C3，從方差分析表(表3)中F值可知，在制備過程中3個因素對硒含量的影響的大小順序為C>B>A，且因素C(反應溫度)對硒化反應的影響極顯著(P<0.01)。從正交試驗表來看，RC>RB>RA，3個因素對硒含量的影響大小與方差分析結(jié)果一致。因此，DCP的最佳硒化條件為：A1B3C3，即DCP與亞硒酸鈉比例為1.0∶0.5，硒化時間24 h，硒化溫度80 ℃，冰乙酸用量為0.6 mL，在此工藝下重復試驗8次，得硒的平均含量為2.35 mg/g。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 正交試驗方差分析

2.4 硒化鐵皮石斛多糖的抗氧化活性

2.4.1 Se-DCP對·DPPH的清除能力 如圖7所示，當Se-DCP的濃度低于1.8 mg/mL時，隨著Se-DCP濃度的增加，對·DPPH的清除率逐漸增加，當Se-DCP的濃度大于1.8 mg/mL 時，對·DPPH的清除能力基本達到飽和，為93%左右；Se-DCP的濃度低于1.4 mg/mL 時，Se-DCP對·DPPH的清除能力小于Vc，但當濃度大于1.4 mg/mL 時，其清除能力顯著高于Vc(P<0.05)，可見，在高濃度時，Se-DCP對·DPPH的清除能力優(yōu)于Vc。

圖7 Se-DCP對·DPPH的清除率Fig.7 Se-DCP removal rate of ·DPPH

2.4.2 Se-DCP對·OH的清除能力 如圖8所示，Se-DCP對·OH的清除能力與Se-DCP的濃度存在明顯的量效關(guān)系。當濃度小于1.8 mg/mL時，Se-DCP對·OH的清除率明顯小于Vc，相同濃度Vc溶液對·OH清除效果均能達到80%以上；當濃度大于1.8 mg/mL時，Se-DCP對·OH的清除率與Vc無顯著差異(P>0.05)，均大于85%。由此可知，在高濃度下，Se-DCP對·OH清除能力與Vc相當，當在低濃度時，Se-DCP對·OH的清除能力較差。

圖8 Se-DCP對·OH的清除能力Fig.8 Se-DCP removal rate of ·OH

圖9 Se-DCP對的清除能力Fig.9 Se-DCP removal rate of

3 討 論

3.1 硒化鐵皮石斛多糖的制備工藝

本試驗硒化鐵皮石斛多糖采用冰乙酸做催化劑，可促進硒與多糖結(jié)合，當冰乙酸用量為0.6 mL[v(DCP)∶v(冰乙酸)=1∶3 g/mL]時，硒含量達到最大值，繼續(xù)增加冰乙酸用量，硒含量增加不顯著，但過量的冰乙酸會使多糖水解，因此最佳的催化劑用量為0.6 mL。在最佳硒化工藝下，硒化鐵皮石斛多糖的硒含量為2.35 mg/g，與葛明明等[14]制備的硒化蒲公英多糖、侯巍等[13]制備的硒化玉米須多糖中硒含量相當。硒是人體生理必需的微量元素之一，缺硒是一些疾病的誘因，硒過量則會引發(fā)中毒，中國營養(yǎng)學會發(fā)布報告認為成人每天適宜的膳食硒攝入量應為50～250 μg。因此本試驗制備的Se-DCP可作為有機硒食品原料。

3.2 硒化鐵皮石斛多糖的抗氧化活性

4 結(jié) 論