1株E亞群禽白血病病毒的分離鑒定及遺傳進化分析

王 萌，張森豪，張 柳，李佳璇,2，王曉娜,2，崔 文,2，姜艷平,2， 周 晗,2，王 麗,2，喬薪瑗,2，李一經(jīng),2，唐麗杰,2*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030; 2.農(nóng)業(yè)部動物疫病病原生物學(xué)重點實驗室東北科學(xué)觀測實驗站，哈爾濱 150030)

禽白血病病毒[avian leukemia (leukosis) virus，ALV]隸屬反轉(zhuǎn)錄病毒科、α反轉(zhuǎn)錄病毒屬成員，其基因組為單股、正鏈、線性RNA的二聚體，具有經(jīng)典的C型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)(5′LTR-5′UTR----3′UTR-3′LTR)，可引起禽類的多種腫瘤性疾病。目前，根據(jù)宿主感染范圍、中和抗體交叉反應(yīng)和85 基因同源性比對等方法，可將 ALV 分為11 個亞群(A-K)。其中，外源性病毒包含A、B、C、D、J 和 K亞群，均可自然感染雞群；而內(nèi)源性病毒主要有E、F、G、H 和 I 亞群，除E亞群分離于雞外，其余亞群多見于野生鳥類。感染ALV后的雞，一方面表現(xiàn)為直接發(fā)病，病雞體表或內(nèi)臟出現(xiàn)腫瘤，最終導(dǎo)致死亡；另一方面還會出現(xiàn)發(fā)育遲緩，免疫力低下，產(chǎn)蛋率降低等亞臨床癥狀，并易受到外界各種病原體的侵害，增加混合感染的概率，給我國養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

近年來，隨著ALV多個亞群混合感染情況在各地雞群中不斷出現(xiàn)，加上 RNA 病毒本身具有遺傳多樣性的特點，以致ALV基因組極易發(fā)生變異或重組，并使病毒有效逃避宿主防御機制、擴大感染宿主的范圍并表現(xiàn)出更為復(fù)雜的致病特征。例如，Li等在江蘇某雞場分離出1株由ALV-K85基因、ALV-E37基因和ALV-J基因組成的JS15SG01株，感染該毒株的SPF雞表現(xiàn)出嚴重的病毒血癥現(xiàn)象且病毒脫落能力也顯著增強，并伴有明顯的嗜神經(jīng)癥狀，給ALV的防控帶來新的挑戰(zhàn)。因此，ALV的分離鑒定及基因組序列分析對于了解該病毒的致病機制、遺傳進化狀況以及制定ALV有效防控措施至關(guān)重要。本研究從RT-PCR檢測為ALV陽性的病死雞組織樣品中分離、鑒定到1株E亞群禽白血病病毒，命名為HLJE2020，通過對其全基因組序列進行分析，分析其遺傳演變趨勢，為黑龍江地區(qū)禽白血病病毒的凈化提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本與細胞 2020年8月，黑龍江省某雞場的海蘭白病死雞，無明顯臨床癥狀。取病死雞的心、肝、肺、腎和法氏囊，各組織眼觀無異常。原代雞胚成纖維細胞(CEF)由 SPF 級雞胚制備，DF-1 細胞系、大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞和 BL21(DE3)感受態(tài)細胞均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 禽白血病病毒ELISA抗原檢測試劑盒購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司； ExTaq DNA 聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶RRI和RT-ace、Oligo(dT)18 Primer、DL2000 DNA Marker、pMD-19T(Simple)質(zhì)粒等購自大連寶生物工程公司； ALV P27單克隆抗體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈；山羊抗小鼠FITC-IgG購自Sigma 公司。

1.2 樣本的檢測

將采集的心、肝、肺、腎和法氏囊進行研磨處理，采用 TRIzol 法提取 RNA 并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，同時使用 DNA 提取試劑盒提取 DNA，利用參考文獻中的禽白血病病毒(ALV)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、禽呼腸孤病毒(ARV)、馬立克病毒(MDV)、傳染性貧血病病毒(CAV)和傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)的特異性引物進行 PCR 檢測(表1)，引物均由吉林吉林省庫美生物科技公司合成。

表1 雞常見傳染性病毒的檢測引物Table 1 Primers for detection of common infectious viruses in chicken

1.3 病毒的分離

使用液氮將檢測為ALV陽性的組織研磨至粉狀，依照1∶5 的比例加入滅菌 PBS，置于-80 ℃ 反復(fù)凍融 3 次后，4 ℃ 12 000 r·min離心 10 min，收集上清液并過濾一次后接種于生長密度達70% CEF 和 DF-1 細胞中，吸附作用 3 h，補加維持液培養(yǎng) 7 d 后反復(fù)凍融 2 次，收集上清液，按照上述方法盲傳 3 代，病毒液于-80 ℃ 保存。

1.4 病毒的鑒定

1.4.1 病毒亞群的鑒定 取P3代CEF 細胞和DF-1細胞上清液提取 RNA， 采用參考文獻中ALV-A-E、ALV-J和ALV-K的引物進行RT-PCR擴增(表2)，從而進行ALV 亞群的鑒定。

表2 ALV亞群鑒定引物Table 2 ALV subgroup identification primer

1.4.2 病毒的間接免疫熒光(IFA)鑒定 以ALV P27單克隆抗體(1∶100稀釋)為一抗，山羊抗小鼠 FITC-IgG(1∶100稀釋)為二抗，利用間接免疫熒光試驗(IFA)檢測CEF細胞中病毒增殖情況，并設(shè)立未感染的CEF細胞為陰性對照。

1.4.3 病毒的形態(tài)學(xué)鑒定 取細胞病毒液200 mL，4 ℃ 6 000 r·min離心20 min， 再取上清，用超速離心機4 ℃ 35 000 r·min高速離心2 h后，棄上清，用100 μL滅菌的去離子水重懸沉淀。吸取25 μL滴于銅網(wǎng)上作用15 min，用2%磷鎢酸負染色1 min 30 s，自然晾干，置于透射電子顯微鏡觀察。

1.4.4 病毒傳代的鑒定 收集P3至P11代細胞病毒液，依照禽白血病病毒抗原ELISA檢測試劑盒說明書步驟進行ALV P27抗原檢測，同時提取P3至P11代細胞病毒液RNA，使用ALV A-E鑒定引物進行RT-PCR檢測，利用以上兩種方法檢測病毒傳代穩(wěn)定性。

1.5 病毒全基因組的測定

1.5.1 病毒全基因組序列擴增與測序鑒定 參照GenBank中ALV-E 參考毒株ev-1株(GenBank 登錄號：AY013303)全基因組序列，分段設(shè)計并合成用于擴增分離株全基因組序列引物(表3)。提取細胞培養(yǎng)上清液RNA進行RT-PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段與 pMD-19T(Simple)載體進行連接、轉(zhuǎn)化，挑選菌株提取質(zhì)粒后進行 PCR 鑒定，鑒定結(jié)果為陽性的質(zhì)粒送吉林省庫美生物科技公司測序。

表3 ALV-E 全基因組序列擴增引物Table 3 Amplification primer of ALV-E whole genome sequence

1.5.2 病毒全基因組序列分析 應(yīng)用DNAStar Lasergen 7.0 軟件對測序后各片段序列進行剪切、拼接和同源性比較；利用 MEGA 7.0 軟件對分離株的、85和LTR基因序列進行遺傳進化分析；利用 RDPv.4(Recombination Detection Program 4)軟件中 7 種重組檢測算法(RDP、GENECONV、BootScan、Max Chi、Chimaera、SiScan、3Seq)對分離株85 基因進行潛在重組分析。之后利用 SimPlot(v3.5.1)軟件驗證分離株85 基因中是否存在重組情況。用于序列比對分析的 28 株 ALV 各亞群參考毒株(國內(nèi)外最初和近些年最新發(fā)現(xiàn)且具有代表性的 ALV 參考毒株)詳細信息見表4。

表4 用于序列比對的參考毒株信息Table 4 Reference strains information for sequence alignment

2 結(jié) 果

2.1 病料的檢測

以病料提取的 RNA 為模板，經(jīng)RT-PCR 擴增獲得ALV27基因，結(jié)果顯示，各組織均在約 674 bp 處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1a)，表明該病料中含有 ALV；而病料各組織提取RNA或DNA后，均未擴增到REV、IBDV、IBV、NDV、AIV、ARV、MDV、CAV 和 ILTV的目的基因(圖1b)。

a.病死雞病料的ALV P27檢測；b.病死雞病料的雞常見病毒檢測；M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1、7.陰性對照；2.心；3.肝；4.肺；5.腎；6.法氏囊；8.禽白血病病毒；9.禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒；10.傳染性法氏囊病毒；11.傳染性支氣管炎病毒；12.新城疫病毒；13.禽流感病毒；14.禽呼腸孤病毒；15.馬立克病毒；16.傳染性貧血病病毒；17.傳染性喉氣管炎病毒a. Detection of ALV P27 in sick materials of dead chickens; b. Detection of common viruses in sick materials of dead chickens; M. DL2000 DNA marker; 1, 7. Negative control; 2.Heart; 3.Liver; 4.Lungs; 5.Kidney; 6.Bursa;8. ALV; 9. REV; 10. IBDV; 11. IBV; 12. NDV; 13. AIV; 14. ARV; 15. MDV; 16. CAV; 17. ILTV圖1 病死雞病料的RT-PCR鑒定結(jié)果Fig.1 The identification results of sick materials of dead chickens by RT-PCR

2.2 病毒的鑒定

2.2.1 病毒的亞群鑒定結(jié)果 對盲傳3代后的CEF和DF-1細胞上清提取RNA后進行RT-PCR鑒定。結(jié)果顯示，經(jīng)CEF細胞培養(yǎng)的上清液可擴增到約300 bp條帶，而由DF-1細胞培養(yǎng)的上清液及陰性對照均未擴增出目的條帶(圖2)。由于除E亞群ALV外，A～D亞群ALV均可在DF-1細胞傳代培養(yǎng)，初步表明該分離株可能為E亞群禽白血病病毒。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.陰性對照；2.A-E亞群(P3代CEF細胞上清)；3.J亞群(P3代CEF細胞上清)；4.K亞群(P3代CEF細胞上清)；5.A-E亞群(P3代DF-1細胞上清)；6.J亞群(P3代DF-1細胞上清)；7.K亞群(P3代DF-1細胞上清)M.DL2000 DNA marker； 1.Negative control; 2.A-E subgroup (P3 generation CEF cell supernatant); 3.Subgroup J (P3 generation CEF cell supernatant); 4.K subgroup (P3 generation CEF cell supernatant); 5.A-E subgroup (P3 generation DF-1 cell supernatant); 6.Subgroup J (P3 generation DF-1 cell supernatant); 7.Subgroup K (P3 generation DF-1 cell supernatant)圖2 ALV亞群RT-PCR鑒定結(jié)果Fig.2 RT-PCR identification results of ALV subgroup

2.2.2 病毒的 IFA 鑒定結(jié)果 利用 IFA 法檢測接種P3代細胞毒 7 d 的CEF細胞，結(jié)果顯示，ALV P27 單克隆抗體與接毒細胞呈陽性反應(yīng)，細胞質(zhì)中出現(xiàn)綠色熒光，細胞核呈藍色熒光，可見 ALV 在細胞質(zhì)中獲得增殖，而未接毒細胞僅細胞核呈藍色熒光，細胞質(zhì)無特異性熒光(圖3)。

a～c.ALV-E 感染的 CEF 細胞；d～f.CEF細胞陰性對照a-c.ALV-E infected CEF cells; d-f.CEF cells negative control圖3 間接免疫熒光檢測結(jié)果(bar=100 μm)Fig.3 Indirect immunofluorescence test results (bar=100 μm)

2.2.3 病毒形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 P3代CEF細胞培養(yǎng)上清液經(jīng)超速離心和負染色后，通過透射電鏡可觀察到病毒粒子近似球形，具有明顯的囊膜和纖突結(jié)構(gòu)，整體直徑約為80 nm (圖4)，與ALV形態(tài)大小相符，將該毒株命名為HLJE2020株。

圖4 透射電鏡下的ALV病毒粒子(150 000×)Fig.4 ALV virus particles under transmission electron microscope(150 000×)

2.2.4 病毒傳代的鑒定結(jié)果 取HLJE2020株P(guān)3至P11代CEF細胞培養(yǎng)上清液，利用 ELISA 和RT-PCR法檢測分離株的傳代穩(wěn)定性。ELISA結(jié)果顯示，隨著傳代次數(shù)的增加，病毒液中 P27 抗原的S/P值逐漸下降，并于P10代呈陰性(表5)。RT-PCR結(jié)果顯示P3～P9代可檢測到目的基因，但P10代后未檢測到病毒核酸(圖5)。上述結(jié)果表明，該分離株無法長期有效于CEF細胞中進行連續(xù)傳代培養(yǎng)。

表5 HLJE2020株各代CEF細胞培養(yǎng)上清液 P27抗原檢測結(jié)果Table 5 P27 antigen detection results of supernatant of each generation HLJE2020 strain CEF cell culture

N. DNA分子質(zhì)量標準；1. 陰性對照；2～10. P3～P11細胞毒N. DL2000 DNA marker; 1. Negative control; 2-10. P3-P11 cytotoxicity圖5 HLJE2020株于CEF細胞傳代的RT-PCR鑒定結(jié)果Fig.5 RT-PCR identification results of HLJE2020 strain passaged in CEF cells

2.3 病毒的全基因組序列分析

2.3.1 HLJE2020 株全基因組序列擴增和測序結(jié)果 將HLJE2020 株病毒液提取RNA后進行RT-PCR 擴增，結(jié)果顯示，各段均成功擴增出目的片段，與預(yù)期條帶大小一致(圖6)。利用DNAStar軟件將各段測序結(jié)果進行拼接，獲得了HLJE2020株全基因組序列。結(jié)果顯示，該分離株全基因組序列全長為 7 524 bp，與經(jīng)典的復(fù)制完整型C型反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)相符，其中，3個編碼蛋白的基因基因長2 106 bp，位于堿基位554—2 659；基因長2 688 bp，位于堿基位 2 677—5 364；基因長1 851 bp，位于堿基位554—571和5 252—7 084；兩端完全相同，LTR基因全長274 bp，由U3、R和U5序列組成，長度分別為175、21和78 bp。將序列上傳至GenBank，獲得登錄號為OK216743。

M. DNA 分子質(zhì)量標準；1～8. F1～F8 擴增片段M. DNA Marker DL2000; 1-8. F1-F8 amplified fragment圖6 HLJE2020株全基因組序列擴增結(jié)果Fig.6 Amplification result of the whole genome sequence of HLJE2020 strain

2.3.2 HLJE2020 株全基因組序列分析結(jié)果 將HLJE2020 株全基因組序列同選定的 28 株 ALV 各亞群參考毒株進行比對分析，結(jié)果顯示(表6)，HLJE2020株與28株參考毒株間的核苷酸相似性為 83.6%～98.5%；和基因較為保守，二者與ALV各亞群參考毒株間的核苷酸相似性分別為94.6%～99.3%和94.9%～99.1%，氨基酸相似性分別為95.9%～99.3%和95.6%～98.9%；而和LTR基因的核苷酸相似性與其他參考毒株間的差異相對較大，二者與ALV各亞群參考毒株間的核苷酸相似性分別為51.6%～97.4%和58.1%～98.2%，其中二者均與 E 亞群ALV參考毒株的核苷酸相似性最高，分別為95.6%～97.4%和94.9%～98.2%，而遺傳進化分析結(jié)果也顯示二者與E亞群ALV參考毒株隸屬同一個進化分支，其中與含有內(nèi)源性ALV LTR基因的參考毒株 JS14CZ01 株和 JS13LY19 株具有較近的親緣關(guān)系(圖7)。

表6 HLJE2020 株全基因組序列與 ALV 各亞群參考毒株的相似性比較Table 6 Comparison of homology between the whole genome sequence of HLJE2020 strain and the reference strains of ALV subgroups

a.HLJE2020株 env 核苷酸序列遺傳進化樹；b. HLJE2020株 LTR 核苷酸序列遺傳進化樹a.Phylogenetic tree of env nucleotide sequence of HLJE2020 strain; b. Phylogenetic tree of LTR nucleotide sequence of HLJE2020 strain圖7 HLJE2020株與ALV各亞群參考毒株核苷酸序列遺傳進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of nucleotide between HLJE2020 strain and reference strains of ALV subgroups

2.3.3 HLJE2020株85基因序列分析結(jié)果 gp85蛋白是病毒囊膜蛋白env編碼的主要蛋白之一，由于其能特異性結(jié)合靶細胞膜上的受體，因而決定了ALV感染宿主的范圍以及亞群的特異性。將HLJE2020株85基因同選定的28株ALV各亞群參考毒株85基因進行比對，結(jié)果顯示(表6)，85基因與ALV各亞群參考毒株的核苷酸相似性為50.1%～94.1%，氨基酸相似性為 37.3%～92.0%，其中,與E亞群和B亞群ALV參考毒株的相似性均在90% 以上；而85核苷酸序列遺傳進化分析結(jié)果顯示該毒株85基因在B亞群和 E亞群ALV之間出現(xiàn)一個單獨的分支(圖8)，且該分離株gp85氨基酸序列的5個易變異區(qū)域中的Vr2、hr1和Vr3區(qū)域的氨基酸組成與B亞群參考毒株相似，Vr1、hr2以及其他區(qū)域的氨基酸組成與E亞群參考毒株相似(圖9)， 推測該分離株85基因核苷酸序列在 225—618 bp和810—840 bp處可能存在E亞群ALV與B亞群ALV的重組事件。

圖8 HLJE2020株與ALV各亞群參考毒株gp85核苷酸序列遺傳進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of gp85 nucleotide between HLJE2020 strain and reference strains of ALV subgroups

ALV各毒株gp85氨基酸序列中圓點表示氨基酸一致，破折號“—”表示氨基酸缺失，字母表示氨基酸突變In the gp85 amino acid sequence of ALV strains, the dots represent consistent amino acids, the dashes “—” represent amino acid deletion, and the letters represent amino acid mutation圖9 HLJE2020株與ALV參考毒株gp85氨基酸序列分析Fig.9 Amino acid sequence analysis of gp85 between HLJE2020 strain and ALV reference strain

隨后利用 RDPv.4 軟件中的 RDP、GENE-CONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3Seq進一步分析HLJE2020 株85基因的重組事件，結(jié)果顯示(判斷依據(jù)：至少保證5種算法的值<10且 Recombinant sequence identification graphs中第一個柱狀圖面積評分需>0.600)，該分離株85基因是由主要親本毒株 AF229株(美國 2017 年商品肉雞分離株)與次要親本毒株SDAU09C2株(中國2012年山東地方品系種雞蘆花雞分離株)于核苷酸序列258—613 bp產(chǎn)生1處重組信號，形成了HLJE2020株重組85基因(表7和圖10)； 而SimPlot 軟件分析結(jié)果也進一步表明 HLJE2020 株的85基因確實存在重組現(xiàn)象(圖11)。

表7 HLJE2020 株的 RDPv.4 重組分析數(shù)據(jù)Table 7 RDPv. 4 recombination analysis data of HLJE2020 strain

圖10 HLJE2020株gp85基因重組分析結(jié)果Fig.10 Analysis of gp85 gene recombination of HLJE2020 strain

設(shè)置：窗口200 bp,步長20 bp，間隙開啟，Kimura兩參數(shù)模型，T/t2.0Settings: Window 200 bp, Step 20 bp, Gapstrip on, Kimura (2-parameter), T/t 2.0圖11 HLJE2020株的SimPlot重組分析結(jié)果Fig.11 SimPlot recombination analysis results of HLJE2020 strain

3 討 論

自1999年我國首次發(fā)現(xiàn)J亞群ALV以來，其在全國多地雞場中的廣泛分布嚴重阻礙了養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展。盡管我國從2008年起開始實行禽白血病根除計劃(NEP)并取得一定成效，然而在某些采取凈化措施不到位的地方品系雞群中仍然存在著ALV多個亞群混合感染的情況，導(dǎo)致雞體在受到多個基因組不同的ALV病毒粒子感染時，就可能產(chǎn)生包含來自兩個或多個親本基因組序列的重組ALV。因此，務(wù)必要引起國內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)的重視。

本研究通過對黑龍江省某養(yǎng)雞場病料進行檢測，將ALV陽性樣品處理后接種于CEF細胞培養(yǎng)，利用RT-PCR、IFA和透射電鏡方法對分離株進行鑒定，分離到一株E亞群ALV HLJE2020株。通過對該分離株的傳代穩(wěn)定性進行研究，發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加， P27 抗原的S/P比值也隨之下降，在盲傳至第10代后的 P27 抗原檢測結(jié)果均呈陰性，這與徐海鵬等從種蛋中分離出的E亞群ALV在CEF細胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)后P27抗原 S/P值不斷下降的結(jié)果一致。同時，RT-PCR 結(jié)果也顯示,在盲傳至第10代后檢測不到病毒核酸的存在。推測其原因可能是E亞群ALV基因組中LTR基因同外源性ALV相比其啟動子活性較弱，而LTR啟動子活性的強弱與病毒的復(fù)制能力、翻譯以及致瘤性密切相關(guān)，因而導(dǎo)致E亞群ALV的復(fù)制和感染能力很弱，無法長期連續(xù)傳代培養(yǎng)，但具體原因仍需進行后續(xù)研究。

85基因是 ALV基因的重要組成部分，與敏感細胞的識別和黏附過程有關(guān)，它是決定ALV亞群分類的主要依據(jù)，其編碼的蛋白也是病毒中和的主要抗原，其核苷酸序列的改變，特別是某些位點的變化可能對病毒的抗原性、細胞趨向性等方面產(chǎn)生影響，甚至有可能經(jīng)過長期的突變和重組而產(chǎn)生新的亞群，因此其在 ALV 的遺傳演化中發(fā)揮著重要作用。在本研究中，通過對HLJE2020株85基因進行核苷酸(氨基酸)同源性、遺傳進化和重組分析，發(fā)現(xiàn)該分離株85基因的重組區(qū)域主要集中在85基因5個高變區(qū)(hr1、hr2、Vr1、Vr2和Vr3)中的hr1和hr2，且該區(qū)域的重組元件是由B亞群ALV提供，這與先前多項研究中發(fā)現(xiàn)重組ALV毒株基因組中的重組區(qū)域主要位于LTR基因、基因或37基因且均由E亞群ALV提供重組元件的情況有所不同。有研究表明，85基因高變區(qū)中的 hr1和hr2是病毒糖蛋白三聚體和宿主蛋白受體之間的主要結(jié)合域，當其受到外界環(huán)境或免疫反應(yīng)的選擇壓力的干擾極有可能發(fā)生變異，而這些區(qū)域的改變就會對細胞受體的結(jié)合以及宿主范圍產(chǎn)生影響，進而推測該分離株在此區(qū)域的改變可能使病毒感染、復(fù)制和傳播的能力增強，并使其感染的宿主范圍發(fā)生改變，同時也進一步表明我國ALV已發(fā)生新的變異趨勢，這種新的變異現(xiàn)象的產(chǎn)生應(yīng)當引起人們的高度重視。而有關(guān)該重組毒株的真實起源、形成過程等方面內(nèi)容還有待后續(xù)研究。

4 結(jié) 論

本研究成功分離出1株E亞群ALV HLJE2020株，且該分離株基因組序列中的85基因可能存在E亞群ALV和B亞群ALV的重組現(xiàn)象，為今后ALV的變異趨勢和致病機制的研究奠定基礎(chǔ)。