奶牛SP1基因結(jié)構(gòu)及對(duì)乳脂合成功能的初步分析

楊 洋，周子薇，張京一，楊 碩，王博宇，葛 楠，林 葉，侯曉明

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 細(xì)胞與遺傳工程黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

奶牛作為重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，是我國(guó)畜牧業(yè)的重要組成部分。隨著人民生活水平的提高，人們對(duì)牛奶及乳制品的需求也日益增加。乳脂是牛奶中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，是衡量牛乳品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)。乳脂的主要成分是甘油三酯(triacylglycerol，TAG)，占乳脂肪的95%～98%。奶牛乳脂的合成受到環(huán)境、激素和細(xì)胞因子等眾多因素的影響，激素及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可以促進(jìn)乳腺的發(fā)育，對(duì)于泌乳的啟動(dòng)和維持至關(guān)重要。此外，在泌乳期間多基因的共同作用對(duì)牛奶的品質(zhì)有重要的調(diào)控作用，如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)等在調(diào)控乳脂合成關(guān)鍵基因表達(dá)和促進(jìn)奶牛乳脂合成過(guò)程中起著重要的作用。

特異性蛋白SP1(specificity protein 1，SP1)是一種進(jìn)化上高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，C端含有3個(gè)串聯(lián)的Cys2His2型鋅指結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域特異性地識(shí)別GC盒(GGGGCGGGG)與GT盒(GGTGTGGG)，參與幾乎所有細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化和新生物的轉(zhuǎn)化等。通過(guò)對(duì)基因序列特征及其表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，湖羊1基因可抑制人卵巢顆粒細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡。Zhu等通過(guò)對(duì)西農(nóng)薩能奶山羊的1基因序列和表達(dá)信息分析，發(fā)現(xiàn)SP1在調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成下游基因的表達(dá)及脂肪酸代謝中發(fā)揮重要作用。張廣杰等克隆了廣西巴馬小型豬1基因序列并測(cè)序，SP1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽和跨膜區(qū)，是非外分泌型蛋白，主要在細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)。王鳳等發(fā)現(xiàn)，1基因的差異表達(dá)對(duì)小尾寒羊尾部前體脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)沉積具有正向調(diào)控作用。先前的研究發(fā)現(xiàn)，胰島素通過(guò)SP1調(diào)節(jié)SREBP-1c的轉(zhuǎn)錄，響應(yīng)胰島素誘導(dǎo)的脂肪生成，這對(duì)SP1調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝提供了一個(gè)有力依據(jù)。SP1靶向乳脂球-EGF因子8(milk fat globule-EGF factor 8，MFG-E8)5′端結(jié)合位點(diǎn)，正向調(diào)節(jié)MFG-E8啟動(dòng)活性，在減輕炎癥和維持組織穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。奶牛乳腺上皮細(xì)胞的乳脂合成對(duì)乳品質(zhì)的提高至關(guān)重要，SP1作為調(diào)控基因表達(dá)普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，探究奶牛1基因的結(jié)構(gòu)及其對(duì)乳脂合成的影響，對(duì)于揭示奶牛乳脂合成的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。大量研究表明，轉(zhuǎn)錄因子SP1在細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝中起到關(guān)鍵作用，但其對(duì)奶牛乳脂合成的調(diào)控研究還鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)多種生物信息學(xué)軟件分析SP1蛋白的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特征，采用PCR方法構(gòu)建1重組過(guò)表達(dá)載體。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)期奶牛乳腺組織SP1的表達(dá)情況。分離并純化奶牛乳腺上皮細(xì)胞，通過(guò)在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和干擾1，檢測(cè)SP1表達(dá)對(duì)TAG合成的影響。本研究為SP1的蛋白結(jié)構(gòu)和功能的相適應(yīng)性及其對(duì)奶牛乳脂合成的調(diào)控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選取6頭健康的泌乳早期荷斯坦奶牛(第3胎次，52～54月齡產(chǎn)犢)，其中3頭母牛在從妊娠期開(kāi)始到泌乳，第90天屠宰，3頭在干奶第30天屠宰。放血后在無(wú)菌環(huán)境下去除結(jié)締組織和脂肪組織，將乳腺實(shí)體組織剪成約1 cm的小塊置于液氮中速凍，然后-80 ℃保存，用于后續(xù)RNA和蛋白質(zhì)的提取。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)，將新鮮泌乳期奶牛乳腺組織置于D-hanks平衡鹽溶液中，立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol Reagent(15596026，Invitrogen)、Prime ScriptRT reagent Kit(RR037A，TaKaRa)；Prime STAR HS DNA Polymerase(R010A，TaKaRa)；Ace QqPCR SYBRGreen Master Mix kit(Q111-02，Vazyme)；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(AE0201-A，SparkJade)；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自擎科生物技術(shù)有限公司。

冷凍離心機(jī)(5418R，Eppendorf)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems 7500 Realtime PCR system，USA)；PCR儀(Mastercycler nexus，Eppendoff)；生物樣本低溫快速制備系統(tǒng)(BSH-C2，GeneReady)；NanoDrop One/One(ND-ONE-W，Thermo Fisher)。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上查找到的奶牛1基因序列(NM_001078027.1)，采用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增1基因CDS區(qū)全長(zhǎng)引物及熒光定量PCR引物，詳見(jiàn)表1。引物經(jīng)過(guò)Blast特異性比對(duì)后，送由擎科生物公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.4 SP1基因克隆

TRIzol法提取泌乳期奶牛乳腺組織總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop檢測(cè)RNA的質(zhì)量及濃度。再根據(jù)PrimeScript RT Reagent Kit說(shuō)明書(shū)對(duì)得到的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系：5×Prime Script Buffer 4 μL，Oligo(dT)(50 μmol·L)和Random 6 mers(100 μmol·L)各1 μL，總RNA 1 μg，PrimeScript RT Enzyme 1 μL，加入ddHO至20 μL。將混合物置于37 ℃孵育15 min，85 ℃ 5 s反轉(zhuǎn)錄酶變性滅活，得到的cDNA產(chǎn)物-20 ℃保存。

PCR擴(kuò)增體系：cDNA模板1 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 1 μL，上、下游引物(10 mmol·L)各1 μL，dNTP(2.5 mmol·L)4 μL，加ddHO至50 μL。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸3 min，共32個(gè)循環(huán)。取5 μL PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，將純化后的PCR產(chǎn)物與pcDNA3.1(+)載體分別用d Ⅲ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切，膠回收產(chǎn)物25 ℃連接2 h，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃震蕩培養(yǎng)1 h。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布在帶有Amp抗性的LB瓊脂平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種在帶有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。菌液送交擎科生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)。將正確的菌液(記作：pcDNA3.1-SP1)提質(zhì)粒備用。

1.5 SP1基因的生物信息學(xué)分析

NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中查找并獲得不同物種1基因序列：牛(NM_001078027.1)、豬(XM_005652567.3)、馬(XM_023643655.1)、兔(XM_008256514.2)、小鼠(NM_013672.2)、大鼠(NM_012655.2)、獼猴(NM_001266924.1)、山羊(NM_001285760.1)、斑馬魚(yú)(NM_212662.2)、人(NM_001251825.2)，利用Mega 7.0軟件進(jìn)行同源性比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

利用ExPASy網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protscale/)在線分析預(yù)測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛SP1蛋白的親水性和理化性質(zhì)；利用NCBI上的Conserved Domains程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)中國(guó)荷斯坦牛SP1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；采用NPSSOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在線軟件分別預(yù)測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛SP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用STRING(htps:/string-db.org/)在線預(yù)測(cè)與SP1可能相互作用的蛋白質(zhì)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SP1基因的mRNA表達(dá)

TRIzol法提取不同時(shí)期奶牛乳腺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同時(shí)期荷斯坦奶牛乳腺組織中1基因的表達(dá)水平。采用Applied Biosystems 7500 Real-time PCR system儀器和Ace QqPCR SYBRGreen Master Mix kit試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL：Ace QqPCR SYBRGreen Master Mix 10 μL；上、下游引物(10 μmol·L)各0.4 μL；模板DNA 2 μL，加ddHO至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以-的CT值為內(nèi)參，1基因表達(dá)量的計(jì)算方法為2，ΔCT=CT1-CT-。

1.7 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

泌乳期奶牛乳腺實(shí)體組織經(jīng)過(guò)清洗、消毒處理后，采用組織塊法分離乳腺上皮細(xì)胞。將剪碎的乳腺組織以適當(dāng)密度均勻接種于預(yù)鋪鼠尾膠原的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，倒置于含5% CO，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待組織塊牢固地貼在瓶底時(shí)，加入含20%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液，同時(shí)添加青霉素(100 U·mL)和鏈霉素(100 μg·mL)。觀察組織塊周?chē)莱黾?xì)胞的狀況，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底時(shí)輕輕吹掉組織塊，并根據(jù)細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的敏感性不同，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化。將1×10個(gè)純化后的細(xì)胞接種至35 mm玻底培養(yǎng)皿中，用4%多聚甲醛固定后加入5% BSA的PBST溶液封閉1 h，然后用角蛋白18(Keratin 18，CK18)抗體(兔源，1∶100稀釋，ABclonal)4 ℃孵育過(guò)夜，清洗一抗后用FITC標(biāo)記山羊抗兔的二抗(1∶200稀釋，ABclonal)孵育1 h，用1 μg·mL的DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，激光共聚焦顯微鏡觀察CK18在細(xì)胞中的表達(dá)。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將2×10個(gè)純化后的乳腺上皮細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合單層時(shí)，更換成無(wú)血清的培養(yǎng)液，每孔加入2.5 μg的pcDNA3.1-SP1質(zhì)粒及5 μL Lipofectamine 2000的混合物，對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體；對(duì)于基因沉默，每孔加入10 μL1 siRNA(20 μmol·L)及5 μL Lipofectamine 2000的混合物，對(duì)照組每孔加入10 μL Negative control(20 μmol·L)。轉(zhuǎn)染后6 h換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)在37 ℃、CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。1 siRNA干擾片段序列為(sense):5′-GCGUUUCUGCAGCUACCUUGA-3′；Negative control序列為(sense):5′-UUCUCCGAAC-GUGUCACGUTT-3′。

1.9 Western blot檢測(cè)SP1蛋白的表達(dá)

取20 mg不同時(shí)期的奶牛乳腺組織加入200 μL RIPA裂解液，用組織破碎儀低溫勻漿，充分裂解后，12 000 r·min離心10 min，取上清備用；對(duì)不同處理的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液低溫裂解細(xì)胞，12 000 r·min離心10 min，取上清備用。采用BCA濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定乳腺組織或細(xì)胞的總蛋白濃度。然后取20 μg蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到NC膜。5%脫脂乳封閉1 h后分別與SP1和β-actin特異性抗體(均為兔源，1∶1 000稀釋，ABclonal)4 ℃孵育過(guò)夜。將NC膜用TBST沖洗3次后，用HRP標(biāo)記的山羊抗兔的二抗在37 ℃孵育1 h，TBST洗3次，采用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)印跡進(jìn)行檢測(cè)。采用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，與內(nèi)參β-actin進(jìn)行比較，分析SP1蛋白的表達(dá)情況。

1.10 SP1表達(dá)對(duì)TAG合成的影響

細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染1基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和RNAi，48 h后細(xì)胞用裂解液低溫裂解約10 min，短暫離心后收集上清，采用TAG檢測(cè)試劑盒(E1003，普利萊)測(cè)定不同處理組奶牛乳腺上皮細(xì)胞中TAG含量；相應(yīng)細(xì)胞樣品的蛋白濃度由BCA濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.11 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。不同處理的兩組數(shù)據(jù)之間采用檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)?！?”代表<0.05，表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著；“**”代表<0.01，表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著；>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 SP1基因克隆

提取奶牛乳腺組織總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增1基因CDS區(qū)，經(jīng)過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后得到清晰明亮的條帶，大小與實(shí)際(2 361 bp)相符(圖1)。將PCR產(chǎn)物與pcDNA3.1(+)載體通過(guò)酶切、連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)比結(jié)果顯示該基因片段與預(yù)期序列一致，成功克隆出奶牛1基因。

圖1 SP1基因CDS區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of SP1 gene CDS region

2.2 奶牛SP1基因序列同源性分析

根據(jù)NCBI已發(fā)布的各物種基因序列，通過(guò)Mega7.0軟件對(duì)不同物種1序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示中國(guó)荷斯坦奶牛1基因與馬、豬、兔、獼猴、小鼠、大鼠、人的同源性分別為95.43%、95.43%、91.65%、94.29%、90.07%、91.55%、88.65%。其中，奶牛1序列與山羊的相似度最高為98.94%；與斑馬魚(yú)的相似度最低為40.35%。使用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖2所示，奶牛1序列同源性與山羊最近，與斑馬魚(yú)最遠(yuǎn)。

圖2 SP1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree of SP1 gene

2.3 SP1蛋白結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析

通過(guò)ExPASy-ProtParam網(wǎng)站對(duì)SP1蛋白分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白分子質(zhì)量為80 902.17 u，等電點(diǎn)為6.94，不穩(wěn)定指數(shù)為53.09，屬于不穩(wěn)定蛋白。1基因共編碼786個(gè)氨基酸，其中絲氨酸(Ser)含量最高(13.0%)，色氨酸(Trp)含量最低(0.5%)(表2)。帶負(fù)電氨基酸(Asp + Glu)42個(gè)，帶正電氨基酸(Arg + Lys)41個(gè)。預(yù)測(cè)的溶解度(歸一化后)為0.504，該蛋白屬于可溶性蛋白。

表2 中國(guó)荷斯坦牛SP1蛋白氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of SP1 protein in China Holstein dairy cows

疏水性分析對(duì)于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)都具有重要的指導(dǎo)意義。利用Protscale軟件在線分析奶牛SP1蛋白氨基酸序列的親疏水性。如圖3A所示，親水性氨基酸大于疏水性氨基酸，總平均親疏水性為-0.438，說(shuō)明SP1是親水性蛋白。通過(guò)NCBI的Conserved Domains程序預(yù)測(cè)中國(guó)荷斯坦牛SP1蛋白保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，該蛋白包含一個(gè)超家族結(jié)構(gòu)域，為SP1-4N超家族結(jié)構(gòu)域，位于第58～628位氨基酸處。在627～656、657～686、687～714位氨基酸區(qū)段包含3個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)(圖3B)。使用NPSSOPMA和SWISS-MODEL分別預(yù)測(cè)中國(guó)荷斯坦牛SP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋(17.68%)、延伸鏈(20.87%)、無(wú)規(guī)則卷曲(52.29%)、β-轉(zhuǎn)角(9.16%)，如圖3C所示，不同二級(jí)結(jié)構(gòu)在氨基酸序列中的位置，柱的寬窄代表上述蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例大小。利用SWISS-MODEL在線預(yù)測(cè)奶牛SP1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3D)，發(fā)現(xiàn)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果包含上述預(yù)測(cè)得到的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元。

A.奶牛SP1蛋白疏水性預(yù)測(cè)；B.奶牛SP1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；C.奶牛SP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；D.奶牛SP1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)A. Hydrophobicity prediction of SP1 protein in dairy cow；B. Conserved domain prediction of SP1 protein in dairy cow；C. Secondary structure prediction of SP1 protein in dairy cow；D. Tertiary structure prediction of SP1 protein in dairy cow圖3 SP1蛋白結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Analysis of SP1 protein structure

2.4 SP1蛋白質(zhì)互作分析

通過(guò)STRING網(wǎng)站分析與奶牛SP1蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示，SP1蛋白與組蛋白去乙?；?(Histone deacetylase 1，HDAC1)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(transcription factor AP-1，AP-1)、細(xì)胞腫瘤抗原p53(tumor protein 53，TP53)、雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)、CREB結(jié)合蛋白(recombinant CREB binding protein，CREBBP)、MYC原癌基因蛋白(MYC proto-oncogene，MYC)、轉(zhuǎn)錄因子RELA(transcription factor p65，p65)、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白(retinoblastoma protein 1，RB1)和TATA盒結(jié)合蛋白(TATA-binding protein，TBP)等蛋白存在相互作用(圖4)。其中，與E1A結(jié)合蛋白P300(recombinant E1A binding protein P300，EP300)的結(jié)合分值最高，為0.998。該結(jié)果暗示SP1在細(xì)胞增殖和代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控等途徑發(fā)揮重要作用。

圖4 SP1蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Analysis of SP1 protein interaction network

2.5 SP1在奶牛乳腺組織中的表達(dá)

為比較1基因在奶牛不同生理時(shí)期乳腺組織中的表達(dá)，采用熒光定量PCR方法分別檢測(cè)了3頭泌乳期和3頭干奶期奶牛乳腺組織中1基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果如圖5A所示，1 mRNA在泌乳期奶牛乳腺組織中的表達(dá)顯著高于干奶期(<0.01)。隨后采用Western blot方法檢測(cè)不同生理時(shí)期奶牛乳腺組織中SP1蛋白水平的表達(dá)變化，以β-actin為內(nèi)參。圖5B和5C結(jié)果顯示，SP1蛋白在泌乳期奶牛乳腺組織中的表達(dá)顯著高于干奶期(<0.01)，暗示SP1可能在奶牛乳腺泌乳過(guò)程中發(fā)揮作用。

A. 熒光定量PCR檢測(cè)不同時(shí)期乳腺組織SP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)；B. Western blot檢測(cè)不同時(shí)期乳腺組織SP1蛋白的表達(dá)；C. 乳腺組織SP1蛋白相對(duì)表達(dá)量。*.P<0.05;**.P<0.01，下同A. The relative mRNA expression of SP1 in mammary tissue at different physiology stages was detected by fluorescence quantification PCR; B. The expression of SP1 protein in mammary tissue at different physiology stages was detected by Western blot; C. Relative expression level of SP1 protein in mammary tissue. *. P<0.05; **. P<0.01; the same as below 圖5 不同時(shí)期奶牛乳腺組織中SP1的表達(dá)Fig.5 Expression of SP1 in mammary gland tissue of dairy cows at different physiology stages

2.6 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

原代培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞如圖6A所示，在相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)第5天時(shí)組織塊周?chē)莱龃罅砍衫w維細(xì)胞；培養(yǎng)第10天可見(jiàn)少量乳腺上皮細(xì)胞呈現(xiàn)島嶼狀生長(zhǎng)；培養(yǎng)第15天可見(jiàn)大量乳腺上皮細(xì)胞。CK18是上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，通過(guò)免疫熒光的方法檢測(cè)細(xì)胞中CK18的表達(dá)情況來(lái)判定乳腺上皮細(xì)胞的純化程度，結(jié)果如圖6B所示，圖中淺灰色細(xì)絲狀為FITC標(biāo)記的CK18，灰色橢圓形為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核。CK18在乳腺上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，表明已獲得純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞。

A.相差顯微鏡觀察奶牛乳腺上皮細(xì)胞(200×)；B.激光共聚焦顯微鏡觀察乳腺上皮細(xì)胞中CK18的表達(dá)：a.FITC標(biāo)記的CK18，淺灰色細(xì)絲狀；b.DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核，灰色橢圓形；c. a和b的合成圖A. Cultured bovine mammary epithelial cells were observed by phase contrast microscope (200×); B. The expression of CK18 was observed by confocal laser microscopy: a. FITC-labeled cytokeratin 18, grey filamentous; b. DAPI-labeled nucleus, grey oval; c. Merge of a and b圖6 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定Fig.6 Culture and identification of bovine mammary epithelial cells

2.7 SP1表達(dá)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞TAG合成的影響

為研究1基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞乳脂合成的影響，本研究將牛pcDNA3.1-SP1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和1 RNAi干擾片段分別轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞。Western blot結(jié)果顯示，pcDNA3.1-SP1轉(zhuǎn)染的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中SP1的表達(dá)極顯著高于對(duì)照組(圖7A和7B，<0.001)；1過(guò)表達(dá)顯著提高細(xì)胞中TAG含量(圖7C，<0.01)。相反，將1 RNAi片段轉(zhuǎn)染至奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，極顯著降低了細(xì)胞中SP1的表達(dá)(圖7D和7E，<0.001)；TAG的合成顯著下降(圖7F，<0.01)。以上結(jié)果表明SP1能夠正向調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳脂的合成。

A. Western blot檢測(cè)NC組和SP1過(guò)表達(dá)組SP1蛋白水平；B. SP1過(guò)表達(dá)后蛋白相對(duì)表達(dá)量；C. SP1過(guò)表達(dá)對(duì)TAG合成的影響；D. Western blot檢測(cè)NC組和SP1敲降組SP1蛋白水平；E. SP1敲降后蛋白相對(duì)表達(dá)量；F. SP1敲降對(duì)TAG合成的影響A. Western blot assays were used to evaluate the protein levels of SP1 in NC group and overexpression group; B. The relative expression level of SP1 in control and SP1 overexpressed cells; C. Effect of SP1 overexpression on TAG synthesis; D. Western blot assays were used to evaluate the protein levels of SP1 in NC group and SP1 knockdown group; E. The relative expression level of SP1 in control and SP1 knockdown cells; F. Effect of SP1 knockdown on TAG synthesis圖7 SP1對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳脂合成的影響Fig.7 Effect of SP1 on milk fat synthesis in bovine mammary epithelial cells

3 討 論

全球?qū)?yōu)質(zhì)牛奶的需求正在增長(zhǎng)，乳脂的合成過(guò)程受到環(huán)境、激素、細(xì)胞因子等多因素調(diào)控。乳腺上皮細(xì)胞是乳腺合成乳脂的最基本結(jié)構(gòu)和功能單位，乳脂從頭合成并分泌的過(guò)程首先在乙酰CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)和脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)的作用下合成并延長(zhǎng)脂肪酸C鏈，隨后由分化抗原蔟36(cluster of differentiation 36，CD36)等參與脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。最近研究發(fā)現(xiàn)，乳腺中脂肪、蛋白質(zhì)和乳糖合成所涉及的蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控被用來(lái)提高牛奶合成效率，并提出包括一些重要轉(zhuǎn)錄因子(例如Spot14、ChREBP和SP1)的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)模型。通過(guò)乳脂、蛋白質(zhì)和乳糖調(diào)節(jié)之間的相互作用來(lái)控制牛乳的合成，為研究乳脂合成基因的表達(dá)調(diào)控提供了理論依據(jù)。SP1作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與幾乎所有的細(xì)胞功能，也成為疾病或腫瘤的治療靶點(diǎn)。本試驗(yàn)初步探究了奶牛乳腺中轉(zhuǎn)錄因子SP1的結(jié)構(gòu)及其對(duì)乳脂合成的調(diào)控作用，對(duì)提高乳脂合成分泌具有重要的試驗(yàn)價(jià)值。

由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，SP1蛋白的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)在中國(guó)荷斯坦奶牛中尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)奶牛1基因的同源性及序列分析發(fā)現(xiàn)，1基因在不同物種間高度保守，且與山羊的同源性最高。氨基酸序列分析結(jié)果顯示，SP1屬于親水性可溶蛋白，其DNA結(jié)合區(qū)位于C末端，主要由3個(gè)典型的Cys2His2型鋅指結(jié)構(gòu)組成。先前的研究發(fā)現(xiàn)，SP1通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子的表達(dá)，控制RNA聚合酶Ⅲ介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，為其調(diào)控下游眾多基因的表達(dá)創(chuàng)造條件。SP1通過(guò)結(jié)合基因調(diào)控區(qū)的GC/GT盒以及與其他蛋白質(zhì)相互作用，發(fā)揮對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)或抑制作用。SP1也可直接與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中TBP相關(guān)因子TAF4等蛋白相互作用，從而通過(guò)招募基本轉(zhuǎn)錄裝置或促進(jìn)其裝配而激活基因轉(zhuǎn)錄。在啟動(dòng)子處，SP1招募組蛋白去乙?；负鸵阴；竵?lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)該處組蛋白的乙?；癄顟B(tài)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，從而激活或者抑制基因表達(dá)。SP1蛋白序列的分析對(duì)揭示其與DNA結(jié)合模式及調(diào)控基因表達(dá)的分子機(jī)制具有重要意義，為后期探究奶牛SP1蛋白功能提供了理論基礎(chǔ)。本研究中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，奶牛SP1蛋白富含無(wú)規(guī)則卷曲(52.29%)，這通常作為蛋白質(zhì)分子行使功能和構(gòu)象變化的重要區(qū)域，對(duì)研究SP1在奶牛乳腺中對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控方式以及SP1與其他蛋白質(zhì)之間相互作用的模式具有重要意義。通過(guò)STRING蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，奶牛SP1蛋白與AP-1、p65、MYC、ERα、CREBBP、TBP等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子存在相互作用，該結(jié)果暗示SP1在細(xì)胞增殖和代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控等途徑中發(fā)揮重要作用，也為探究SP1調(diào)控奶牛乳脂合成的機(jī)制提供了理論依據(jù)。

1基因作為廣泛性轉(zhuǎn)錄因子，幾乎存在于所有細(xì)胞中，參與機(jī)體生理與病理的多種調(diào)控過(guò)程。1基因敲除小鼠會(huì)出現(xiàn)發(fā)育異?，F(xiàn)象，如發(fā)育滯后、畸形、死胎等。在小鼠卵巢中1的缺失導(dǎo)致卵泡和卵母細(xì)胞在青春期前發(fā)生大規(guī)模丟失，導(dǎo)致卵巢早衰的發(fā)生，SP1通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠顆粒前細(xì)胞發(fā)育來(lái)控制原始卵泡發(fā)生。一些研究已經(jīng)證明,SP1通過(guò)調(diào)節(jié)乳脂合成過(guò)程中的眾多基因表達(dá)，參與調(diào)節(jié)人類、大鼠和山羊的脂肪酸合成。在小鼠中，約50%的1基因靶標(biāo)被轉(zhuǎn)錄因子SP1占據(jù)，協(xié)同調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。SP1在維持山羊乳腺上皮細(xì)胞乳脂滴合成方面發(fā)揮重要作用，SP1的異常表達(dá)可以抑制山羊TAG的積累以及與TAG合成和脂滴形成相關(guān)的基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，水牛脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase，)基因中的一個(gè)SNP允許轉(zhuǎn)錄因子SP1的結(jié)合，導(dǎo)致基因過(guò)表達(dá)(約2.5倍)，暗示SP1通過(guò)對(duì)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控乳脂代謝。最近研究發(fā)現(xiàn)，SP1與脂肪酸延長(zhǎng)酶7(elongation of very long chain fatty acids protein，7)啟動(dòng)子-143～+128位置堿基對(duì)的GC/GT盒特異相互作用，在乳腺上皮細(xì)胞中激活7的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，泌乳期奶牛乳腺組織中SP1的表達(dá)量顯著高于干奶期，暗示SP1在奶牛泌乳過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在泌乳期奶牛乳腺上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或干擾1，細(xì)胞中TAG的合成與SP1的表達(dá)呈正相關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)，在C57BL/6 J小鼠中SP1的表達(dá)減弱了microRNA-199a-3p對(duì)肝脂肪生成的影響，促進(jìn)TAG的積累和產(chǎn)脂基因的表達(dá)，暗示SP1在維持小鼠肝TAG穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮潛在調(diào)控作用。在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，SP1可與PPARγ相互作用控制甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)的轉(zhuǎn)錄。在大鼠肝中，1過(guò)表達(dá)增加地塞米松誘導(dǎo)的脂肪生成基因(1、)的表達(dá)和TAG的合成，暗示SP1介導(dǎo)產(chǎn)脂基因表達(dá)及TAG合成的調(diào)節(jié)。通過(guò)抑制SP1與啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，抑制1和2及其下游靶基因和的表達(dá)，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。因此，SP1的表達(dá)與乳脂合成密切相關(guān)，SP1可能通過(guò)與乳脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控下游基因表達(dá)，或直接結(jié)合在乳脂合成關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子區(qū)，影響基因表達(dá)及TAG合成。盡管SP1在調(diào)節(jié)反芻動(dòng)物的脂肪代謝中起著重要作用，本研究初步探究了奶牛1基因結(jié)構(gòu)及對(duì)乳脂合成的影響，但其對(duì)奶牛乳脂合成的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)奶牛1基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，1基因在不同物種中高度保守。PCR克隆得到中國(guó)荷斯坦奶牛1基因CDS序列，成功構(gòu)建了1基因的過(guò)表達(dá)載體。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot結(jié)果顯示，SP1在泌乳期奶牛乳腺組織中高表達(dá)。分離純化得到了奶牛乳腺上皮細(xì)胞，1基因過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)TAG合成，1基因沉默顯著抑制TAG合成，提示其在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中可以正向調(diào)控乳脂合成。該結(jié)果為深入研究SP1對(duì)泌乳奶牛乳脂合成調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)。