甲型皰疹病毒亞科的皰疹病毒囊膜糖蛋白gC對(duì)病毒感染復(fù)制的影響

豐 鑫，汪銘書*，程安春

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽病防治研究中心，成都 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)研究所，成都 611130； 3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130)

皰疹病毒科依據(jù)生物學(xué)特性和基因結(jié)構(gòu)分成3個(gè)亞科：甲型皰疹病毒亞科、乙型皰疹病毒亞科和丙型皰疹病毒亞科。病毒粒子由外至內(nèi)依次為囊膜(envelope)、皮層(tegument)、衣殼(capsid)、含雙鏈DNA基因組的核心(core)。甲型皰疹病毒亞科成員眾多，宿主廣泛，能感染哺乳類、兩棲類和禽類，主要侵害宿主的皮膚、黏膜和神經(jīng)組織，病毒還會(huì)在宿主神經(jīng)組織潛伏感染，既沒有臨床癥狀也不會(huì)向外排毒，一旦感染之后，難以徹底清除，在宿主免疫力低下時(shí)潛伏病毒又被重新激活。gC是甲型皰疹病毒亞科病毒的多功能跨膜糖蛋白，由44基因編碼，具有硫酸乙酰肝素受體功能，能促進(jìn)病毒的吸附。此外，還能介導(dǎo)病毒在低pH條件下進(jìn)入上皮細(xì)胞、參與病毒的水平傳播、與補(bǔ)體結(jié)合幫助病毒進(jìn)行免疫逃避等。本文主要綜述了gC在促進(jìn)病毒復(fù)制方面的重要作用，以期能為深入研究甲型皰疹病毒亞科病毒的生命周期和開發(fā)gC相關(guān)的亞單位疫苗與mRNA疫苗提供參考。

1 gC的基本特性

1.1 UL44基因的保守性

甲型皰疹病毒亞科的病毒基因組由共價(jià)連接的獨(dú)特長(zhǎng)區(qū)(unique long，UL)、獨(dú)特短區(qū)(unique short，US)和重復(fù)序列所組成(repeat sequence，RS)，大部分病毒的基因組長(zhǎng)度在150 kb左右，直徑為150～200 nm，包含70以上個(gè)基因。其中，常見的甲型皰疹病毒亞科的成員包括偽狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)、牛皰疹病毒Ⅰ型(bovine herpes virus 1, BHV-1)、貓皰疹病毒Ⅰ型(feline herpes virus 1, FHV-1)、雞傳染性喉氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)、馬立克病毒(Marek’s disease virus, MDV)、鴨腸炎病毒(duck enteritis virus, DEV)、人單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus 1, HSV-1)、人單純皰疹病毒2型(herpes simplex virus 2， HSV-2)和水泡帶狀皰疹病毒(varicella zoster virus, VZV)。對(duì)這些病毒編碼gC蛋白的44基因進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果見表1。以上基因序列來源于NCBI。

表1 甲型皰疹病毒亞科的病毒UL44基因序列相似性比對(duì)Table 1 Alignment of alpha herpes virus UL44 gene sequence similarity %

不同的甲型皰疹病毒亞科病毒44基因的序列相似度從25.71%到77.55%，其中以HSV-1與HSV-2基因全序列相似度最高，達(dá)到77.55%(表1)。44基因的序列相似度普遍在30%以上，揭示了不同甲型皰疹病毒亞科成員的gC蛋白之間可能存在功能的相似。

1.2 UL44基因類型

甲型皰疹病毒亞科的病毒基因轉(zhuǎn)錄遵循級(jí)聯(lián)瀑布式規(guī)律，根據(jù)基因轉(zhuǎn)錄的先后順序，分為立即早期α(immediate early, IE)、早期β(early, E)和晚期γ(late, L)基因。IE基因的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)在病毒DNA復(fù)制之前，因此其表達(dá)不依賴病毒蛋白質(zhì)的合成。48基因是IE基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，誘導(dǎo)IE基因轉(zhuǎn)錄激活，部分E基因參與核苷酸代謝和DNA合成，如編碼合成胸苷激酶(thymidine kinase, TK)、DNA聚合酶等。L基因主要編碼衣殼蛋白、主要皮層蛋白和囊膜糖蛋白。甲型皰疹病毒亞科病毒的44基因?qū)儆贚基因，L基因的表達(dá)依賴IE基因，并受到IE基因的調(diào)控。

2 gC參與病毒吸附

2.1 gC與糖胺聚糖結(jié)合促進(jìn)病毒吸附感染

在病毒的生命周期中，病毒首先通過與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合從而吸附到細(xì)胞上。在甲型皰疹病毒亞科中，囊膜糖蛋白gC、gB與宿主細(xì)胞表面受體硫酸乙酰肝素結(jié)合，介導(dǎo)病毒吸附至宿主細(xì)胞上。隨后gD能與細(xì)胞表面受體HVEM、nectin-1、nectin-2和3-O-HS特異性結(jié)合，與受體結(jié)合后gD構(gòu)象發(fā)生變化，以此作為信號(hào)傳遞給gH/gL異二聚體，在gH/gL的協(xié)助下，gB以預(yù)融合狀態(tài)進(jìn)行病毒包膜與細(xì)胞膜的融合。此外gB、gD、gH和gL是甲型皰疹病毒亞科的病毒侵入細(xì)胞的必須蛋白，gC是參與入侵的重要蛋白，但非必須蛋白，它們參與了病毒在不同pH條件下進(jìn)入不同類型細(xì)胞的過程(圖1)。

圖1 gC參與HSV-1吸附和融合宿主細(xì)胞膜的過程Fig.1 gC participates in the process of HSV-1 adsorption and fusion host cell membrane

在多數(shù)甲型皰疹病毒亞科的病毒中，如HSV-1、EHV-4、PRV中g(shù)C與宿主細(xì)胞表面受體糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAGs)結(jié)合，以達(dá)到病毒附著在宿主細(xì)胞上的目的，但DEV、ILTV gC沒有此功能。與gC結(jié)合的GAGs主要是硫酸肝素(heparin sulfate, HS)和硫酸軟骨素(chondroitin sulfate, CS)，硫酸軟骨素通常是在硫酸肝素缺失時(shí)作為一種輔助受體與gC結(jié)合。此外，gC的N糖基化也可導(dǎo)致gC與宿主的結(jié)合受體由HS變?yōu)镃S。gC的硫酸肝素結(jié)合區(qū)域(heparin sulfate binding region, HBD)是gC與HS的結(jié)合位點(diǎn)，在HSV-1中，gC的HBD分布在其N端，主要位于gC 127—144位半胱氨酸形成的環(huán)形結(jié)構(gòu)間。最少由10～12個(gè)糖單元組成，其中，一個(gè)2-O和一個(gè)6-O硫酸鹽基團(tuán)是必須結(jié)構(gòu)單元。HBD中帶正電荷氨基殘基能與HS中帶負(fù)電荷的氨基殘基結(jié)合，達(dá)到吸附在細(xì)胞表面的目的。

gC與GAGs的結(jié)合受到gC黏液樣區(qū)域(mucin-like region，MLR)的調(diào)控。MLR是高度O糖基化的區(qū)域，位于gC與GAGs結(jié)合位點(diǎn)附近。缺失gC黏液性區(qū)域的HSV-1吸附到細(xì)胞膜的能力降低，宿主細(xì)胞表面釋放的病毒粒子減少?？偟目磥韌C能夠介導(dǎo)病毒吸附，不過并不是介導(dǎo)吸附的唯一蛋白，gB同樣在病毒吸附過程中發(fā)揮重要作用，此外，MLR能夠調(diào)控gC 的吸附作用。

2.2 gC促進(jìn)低pH途徑中HSV的進(jìn)入

HSV進(jìn)入細(xì)胞具有中性pH和低pH兩種機(jī)制，HSV利用低pH機(jī)制進(jìn)入上皮細(xì)胞，利用中性pH機(jī)制進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞。HSV利用不同的途徑來感染重要的靶細(xì)胞，gC在病毒通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入上皮細(xì)胞時(shí)起促進(jìn)作用，gC存在時(shí)可增加病毒的融合，提高HSV的入胞效率，在gC缺失之后HSV-1進(jìn)入CHO-HVEM和HEKa等上皮細(xì)胞的效率相較于野毒有明顯的降低，HSV-1缺失gC后進(jìn)入CHO-HVEM的效率下降50%，進(jìn)入HEKa細(xì)胞的效率下降35%，而gC對(duì)病毒進(jìn)入如Vero細(xì)胞等非上皮細(xì)胞效率無明顯影響。

gC促進(jìn)病毒吸附的另一重要因素是gC能調(diào)節(jié)低pH誘導(dǎo)的gB構(gòu)象變化。gB屬于III類融合蛋白家族的成員，在皰疹病毒中是保守的，gB通過構(gòu)象變化來介導(dǎo)病毒的融合和進(jìn)入宿主細(xì)胞。這種構(gòu)象的改變最近發(fā)現(xiàn)是由gC參與調(diào)節(jié)的，gC調(diào)節(jié)低pH誘導(dǎo)的gB構(gòu)象變化，促進(jìn)gB在低pH途徑中與細(xì)胞膜的融合。在gC存在的情況下，gB的變構(gòu)所需的低pH可上升0.4～0.7個(gè)pH單位，使得gB可以在較高的pH條件下發(fā)生變構(gòu)，降低了gB變構(gòu)的低pH要求，而gC缺失病毒gB的變構(gòu)需要轉(zhuǎn)移至pH更低的隔室，gB與細(xì)胞膜發(fā)生融合的時(shí)間增加，其中g(shù)C主要影響gB發(fā)揮膜融合重要作用的結(jié)構(gòu)域I、II和V的變構(gòu)。這些變化對(duì)于gB是可逆的，且對(duì)病毒的進(jìn)入十分重要。gC能夠調(diào)節(jié)低pH誘導(dǎo)的gB構(gòu)象變化，來影響病毒與細(xì)胞膜的融合，但對(duì)gC能促進(jìn)低pH條件下病毒感染上皮細(xì)胞的機(jī)理尚不明確，推測(cè)可能與不同種類細(xì)胞內(nèi)的pH環(huán)境有關(guān)。

2.3 gC能介導(dǎo)病毒水平傳播

MDV是甲型皰疹病毒亞科的成員，感染宿主后能導(dǎo)致宿主產(chǎn)生腫瘤，MDV能夠通過水平傳播感染易感動(dòng)物，其gC、US2和UL13參與MDV的水平傳播，其中，gC、UL13和UL47是必須的，US2是非必須的。甲型皰疹病毒亞科的病毒的gC是I型膜蛋白，其跨膜結(jié)構(gòu)域錨定在細(xì)胞膜上，但大部分的MDV gC是通過體外分泌的，通過逆轉(zhuǎn)錄分析鑒定出2種缺失跨膜結(jié)構(gòu)域的gC mRNA剪接變體，其缺少了gC全長(zhǎng)的104對(duì)堿基和145對(duì)堿基，分別稱為gC104和gC145,與野生型MDV或回復(fù)株相比，當(dāng)只允許表達(dá)單個(gè)gC剪接變體時(shí)，MDV的水平傳播會(huì)減少，這表明了gC、gC104和gC145都是MDV在水平傳播中所必須的。此外，gC表達(dá)剪接變體還受到UL47和ICP27的調(diào)控，在UL47缺失時(shí)，利用RT-PCR對(duì)gC轉(zhuǎn)錄物豐度進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，gC全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物數(shù)量可增加84%，但gC104和gC145的剪接轉(zhuǎn)錄物數(shù)量下降45%和33%。ICP27可以抑制剪接變體，調(diào)節(jié)mRNA，在ICP27存在的情況下gC145轉(zhuǎn)錄物表達(dá)量下降58%，gC全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物表達(dá)量增加22%。

gC的水平傳播功能是相對(duì)保守的，Gallid alphaherpesvirus 3的gC缺失后病毒的水平傳播能力喪失，但在插入MDV gC替換Gallid alphaherpesvirus 3 gC后發(fā)現(xiàn)，Gallid alphaherpesvirus 3仍能在雞群中水平傳播。但并非所有甲型皰疹病毒亞科的病毒gC都具有水平傳播功能，在將ILTV gC替換MDV gC后，MDV無法實(shí)現(xiàn)個(gè)體間的水平傳播，而屬的病毒gC則能夠相互替換而均能實(shí)現(xiàn)水平傳播功能，證明gC的水平傳播功能在屬內(nèi)是保守的?？傊?，雖然對(duì)gC是如何影響MDV水平傳播的機(jī)制尚不清楚，但可以確定的是缺失gC后MDV的復(fù)制功能受到損害，不能正常釋放具有傳染性的正常病毒粒子。

3 gC介導(dǎo)病毒的免疫逃避

gC能夠與補(bǔ)體C3結(jié)合且已經(jīng)發(fā)生能夠屏蔽gB特異性抗體對(duì)gB的識(shí)別中和。這對(duì)于病毒感染之初，有效地抵抗了補(bǔ)體與抗體對(duì)病毒的中和，使病毒逃避了宿主的免疫，促進(jìn)了病毒的感染吸附。

3.1 gC抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的中和反應(yīng)進(jìn)行免疫逃避

gC具有補(bǔ)體C3b受體功能，能與C3b相結(jié)合抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的中和作用以及擾亂補(bǔ)體系統(tǒng)正常功能，達(dá)到免疫逃避的目的，幫助病毒潛伏在宿主體內(nèi)，這是甲型皰疹病毒亞科病毒的免疫逃避策略之一。

在激活補(bǔ)體的旁路途徑中，B因子與固相如微生物或外源性異物表面C3b結(jié)合為C3bB，在D因子、P因子(Properdin)作用下，形成C3轉(zhuǎn)化酶C3bBb，并通過C3正反饋放大環(huán)路，產(chǎn)生更多的C3轉(zhuǎn)化酶(C3bBb)和C5轉(zhuǎn)化酶(C3bBb3b)，攻膜復(fù)合物(membrane attack complex, MAC)在末端通路過程中形成。補(bǔ)體成分C3b可介導(dǎo)調(diào)理作用，C3b的裂解產(chǎn)物iC3b、C3dg均為重要的調(diào)理素，通過與吞噬細(xì)胞表面的CR1、CR3結(jié)合促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬病原微生物。此外，C3b還可共價(jià)結(jié)合免疫復(fù)合物，C3b黏附在紅細(xì)胞、血小板后將免疫復(fù)合物運(yùn)送至肝或脾被吞噬細(xì)胞吞噬清除；MAC可溶解病毒包膜，參與抗病毒防御機(jī)制。補(bǔ)體還可通過調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫來參與機(jī)體內(nèi)的免疫應(yīng)答。C3b的裂解產(chǎn)物iC3b、C3d作用于B細(xì)胞的受體復(fù)合物(CR2-CD19-CD81)來降低活化B細(xì)胞的閾值；C3a或C5a可促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞的成熟來刺激T細(xì)胞的活化。

HSV-1感染宿主細(xì)胞后gC可與補(bǔ)體C3b結(jié)合，干擾補(bǔ)體系統(tǒng)功能發(fā)揮。gC還具有加速C3、C5轉(zhuǎn)換酶復(fù)合物衰減功能，但gC對(duì)C3轉(zhuǎn)化酶的加速衰減作用呈劑量依賴性，且gC的加速C3轉(zhuǎn)化酶的衰減僅僅只針對(duì)旁路途徑產(chǎn)生的C3bB，并非是經(jīng)典途徑產(chǎn)生的C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2a)，此外，gC可以降低旁路途徑介導(dǎo)的細(xì)胞裂解的總效率，這表明gC可以影響C5/C5b與C3b的相互作用。HSV-1 gC還抑制C5和P因子與C3b的結(jié)合，這種抑制作用是通過gC在空間上阻礙了P因子和C5進(jìn)入C3b。總的來說，gC通過抑制受感染細(xì)胞的補(bǔ)體激活，可以逃避補(bǔ)體介導(dǎo)的中和作用。通過構(gòu)建gC重組蛋白，直接酶聯(lián)免疫吸附法和競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)表達(dá)的蛋白與人C3和C3片段的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)gC的重組蛋白能和C3、C3b、和C3c結(jié)合，并不與C3d結(jié)合，確定了gC與補(bǔ)體的結(jié)合位點(diǎn)在C3c上(圖2)。在探究gC抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的中和作用時(shí)，將HSV-1 gC突變株與HSV野生株與非免疫血清進(jìn)行孵育1 h，結(jié)果顯示，gC突變株的病毒滴度最高可下降5 000倍，而野生株僅僅下降2倍。且用無HSV抗體的非免疫血清與HSV-1 gC缺失株和野生株進(jìn)行孵育，也得到上述同樣的結(jié)果，表明gC抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的中和反應(yīng)與抗體無關(guān)，且這種抑制作用發(fā)生在感染的早期。

1.減少M(fèi)AC合成；2.C3b介導(dǎo)的吞噬功能降低；3.加速C3/C5轉(zhuǎn)化酶的衰變；4.免疫復(fù)合物清除率降低1. Reduced MAC synthesis; 2. Reduced C3b-mediated phagocytosis; 3. Accelerated the decay of the C3/C5 convertase enzyme; 4. Reduced clearance rate of immune complexes圖2 gC與C3b的結(jié)合對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)功能的影響Fig.2 The effect of the combination of gC and C3b on the function of the complement system

HSV-1和HSV2 gC都可以與C3b結(jié)合。PRV的糖蛋白III (gIII)能與補(bǔ)體的第3組分(C3)結(jié)合。馬皰疹病毒1型(EHV-1型)和4型(EHV-4型)的糖蛋白13(gp13, EHV-gC)能結(jié)合C3。HSV-1 gC與C3的結(jié)合區(qū)域主要分為4個(gè)結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域I主要包含124—137氨基酸；結(jié)構(gòu)域II主要包含276—292氨基酸；結(jié)構(gòu)域III主要包含339—366氨基酸；結(jié)構(gòu)域IV主要包含223—246氨基酸。gC抑制C5和備解素P的功能域在N端的33—123氨基酸(圖3)。

圖3 HSV-1 gC重要的結(jié)構(gòu)域[30]Fig.3 Some important domains of HSV-1 gC[30]

綜上所述，gC與補(bǔ)體激活途徑的中樞成分C3b結(jié)合后導(dǎo)致正常C3b成分減少嚴(yán)重，影響了補(bǔ)體系統(tǒng)的細(xì)胞毒作用、調(diào)理作用、清除免疫復(fù)合物等正常功能的發(fā)揮。gC這一功能在病毒逃避宿主的免疫反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用。因此，在后續(xù)甲型皰疹病毒疫苗的開發(fā)中g(shù)C作為重要的亞單位疫苗和其他諸如gD、gE蛋白亞單位疫苗一起發(fā)揮著重要作用。此外，在經(jīng)核苷修飾的mRNA在脂質(zhì)納米顆粒表達(dá)相同gC、gD和gE蛋白的mRNA疫苗的免疫效果更佳。

3.2 gC通過屏蔽gB的原表位進(jìn)行免疫逃避

在病毒和宿主對(duì)抗的過程中，病毒已經(jīng)進(jìn)化出避免宿主抗體中和的策略。皰疹病毒gC和gE是介導(dǎo)病毒免疫逃避的主要蛋白，gE作為IgG Fc受體可以和IgG的Fc部分特異性結(jié)合，抑制IgG Fc參與補(bǔ)體激活和抗體依賴的細(xì)胞毒性作用，gC除了與宿主補(bǔ)體C3b結(jié)合抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的中和反應(yīng)外，還可以保護(hù)gB免受抗體識(shí)別中和表位，此作為一種新的免疫逃避機(jī)制幫助病毒在宿主中持久感染。gB作為甲型皰疹病毒亞科的病毒侵入的必須蛋白，參與病毒的吸附和膜融合，在所有甲型皰疹病毒亞科的病毒中都是保守的。gC屏蔽gB抗原位點(diǎn)使gB特異性抗體無法準(zhǔn)確識(shí)別gB，和野生株HSV相比缺失gC后的HSV更容易被gB抗體中和，且gD和gH的抗體的活性更高。

gC功能的總結(jié)見表2。

表2 gC功能總結(jié)Table 2 Summary of gC functions

4 展 望

gC是甲型皰疹病毒亞科病毒的多功能糖蛋白，近年來研究發(fā)現(xiàn)gC在病毒的生命周期中扮演重要的角色，能結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體介導(dǎo)病毒的吸附，促進(jìn)低pH條件下病毒感染上皮細(xì)胞，影響MDV的水平傳播，此外還能作為補(bǔ)體受體干擾補(bǔ)體對(duì)病毒的中和，屏蔽gB的抗原位點(diǎn)阻礙gB抗體對(duì)gB的識(shí)別清除。gC的越來越多的功能被發(fā)現(xiàn)，不過其機(jī)制不是完全都清楚的。其中，gC免疫逃避功能受到了極大關(guān)注，gC能夠與補(bǔ)體結(jié)合，但對(duì)于如PRV、BHV-1、EHV等病毒的gC與補(bǔ)體受體結(jié)合還停留在蛋白層面，對(duì)于gC上的具體功能域還知之甚少。此外，最近發(fā)現(xiàn)gC能夠屏蔽gB的抗原表位，并且還能降低其他糖蛋白的抗體效果，gC是否也屏蔽了其他糖蛋白的抗原位點(diǎn)還不得而知，gC與gB無空間上的結(jié)合，對(duì)于gC對(duì)gB抗原位點(diǎn)的屏蔽作用目前也沒有合理的解析。目前，gC在亞單位疫苗和mRNA疫苗的研發(fā)中受到熱捧，對(duì)gC的免疫逃避功能進(jìn)行深入的研究對(duì)于疫苗的研發(fā)和甲型皰疹病毒亞科的病毒生命周期的解析具有重要意義。