一種提高動物源性食品中克倫特羅的檢測精度的方法

黃永生，何玉榆，李湘媛，邱永為*

(1.深圳市質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測研究院，廣東 深圳 518000；2.廣東省市場監(jiān)督管理局食用農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518000)

克倫特羅(clenbuterol)，化學(xué)名為1-(4-氨基-3,5-二氯苯基)-2-(叔丁基-D9-氨基)乙醇，俗稱“瘦肉精”，是一種β2-腎上腺素受體促效劑(β2-adrenergic agonist)，臨床上常被用作緩和氣喘急性發(fā)作時(shí)的支氣管擴(kuò)張劑，用于治療哮喘以及休克等疾病[1]。此類藥物對動物脂肪的合成具有抑制作用，進(jìn)而改變禽畜體內(nèi)的代謝途徑，有效促進(jìn)禽畜的肌肉生長和骨骼肌蛋白的合成，提高家畜體內(nèi)的瘦肉比例，因此常被非法商家當(dāng)做特殊用途的飼料添加劑加入家畜的飼料中，以提高畜牧生產(chǎn)效益[2]。但是，這種做法會導(dǎo)致動物源性食物中的克倫特羅含量超標(biāo)，且由于其具有穩(wěn)定的性質(zhì)，家畜攝入后很難代謝分解，容易在體內(nèi)聚積，會隨著屠宰后進(jìn)入市場。在國內(nèi)外也引發(fā)過一系列的由于克倫特羅殘留導(dǎo)致食物中毒的事件，引起人們的高度重視[3-4]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在第235 號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中將克倫特羅及其鹽類物質(zhì)列為年度監(jiān)測計(jì)劃。在第176 號等公告明確了在動物飼養(yǎng)過程中禁止使用鹽酸克倫特羅。因此，開發(fā)和研究高效的克倫特羅檢出分析技術(shù)一直是食品安全檢測領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

當(dāng)前，動物源性食物中的克倫特羅的檢測主要采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)[5]、膠體金免疫層析法[6-7]、表面等離子體共振生物芯片[8]、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometer，GCMS)、高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS) 等[2，9-11]。ELISA 靈敏度較高，但易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，重現(xiàn)性較差；膠體金免疫層析法適合大規(guī)模檢測，但易受環(huán)境因素影響，導(dǎo)致檢查結(jié)果存在一定誤差；表面等離子體共振生物芯片適合現(xiàn)場實(shí)時(shí)連續(xù)快速檢測，但靈敏度較低；GC-MS 的處理過程繁瑣效率過低。對此，利用LC-MS 檢測克倫特羅就成為了較好的選擇，其擁有高效的分離能力和準(zhǔn)確的定性定量能力，具有靈敏度高、所得信息量大、效率較高等優(yōu)點(diǎn)。

本研究參考了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025 公告-18-2008《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、GB/T21313-2007《動物源性食品中-受體激動劑殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/ 質(zhì)譜法》、GB/T22286-2008《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜在法》[13-15]等，并對上述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了相應(yīng)的優(yōu)化整合，對動物源性食品中的克倫特羅進(jìn)行定性與定量分析，優(yōu)化了前處理操作，采用了多種反應(yīng)監(jiān)測模式測定，有效地提高了工作效率，為動物源性食品中克倫特羅的檢測提供有力的技術(shù)支持。

1 使用材料及操作步驟

1.1 操作儀器與所用試劑

1.1.1 儀器

安捷倫1290 液相色譜儀、AB Science 質(zhì)譜儀、漩渦混合儀、電子天平、恒溫水浴搖床、氮吹儀、超純水儀、超聲波清洗機(jī)、冷凍離心機(jī)、混合型陽離子(mixed-mode cation exchanger，MCX)固相萃取柱(規(guī)格：3 cc，60 mg)。

1.1.2 藥品與試劑

0.2 mol/L 乙酸銨(pH=5.2)；0.1 mol/L高氯酸溶液；5%氨化甲醇；甲醇(色譜純)、甲酸(色譜純)；乙酸(分析純)；氫氧化鈉(分析純)；β-葡萄糖醛苷酸酶/ 芳基硫酸酯酶(20 U/mL)；復(fù)溶液：甲醇/ 水/ 甲酸(10∶90∶0.09，v/v/v)。

1.2 檢測樣品制備

取適量新鮮肌肉樣品組織，將其攪碎至均勻態(tài)，于-20 ℃避光保存。

1.3 標(biāo)液配制

取出克倫特羅的標(biāo)準(zhǔn)品，稱取適量，將其用甲醇配成0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，將其置于-20 ℃冰箱中保存，有效期4 個(gè)月；之后對克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇進(jìn)行逐級稀釋，配制成相應(yīng)濃度的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g(± 0.01 g)試樣，置于50 mL 離心管中，加入8.0 mL 0.2 moL/L 乙酸銨溶液(pH=5.2)和40 μL β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶(20 U/mL)，加蓋2 000 r/min渦旋振蕩8 min，37 ℃恒溫?fù)u床避光酶解18 h。酶解后放置至室溫，在酶解液中加入300 μL 高氯酸(將pH 調(diào)至1.00)，渦旋30 s，10 000 r/min低溫離心5 min，移上清液于另一離心管中。在殘?jiān)屑尤? mL 0.1 mol/L 高氯酸溶液，渦旋30 s，10 000 r/min 低溫離心5 min，合并上清液。上清液中加入570 μL 5 mol/L 的NaOH(將pH 調(diào)至4.00)，備用。

MCX 固相萃取柱分別依次用5 mL 甲醇、5 mL 水活化。取備用液全部過柱，再依次用5 mL 水、5 mL 甲醇淋洗小柱，抽干。用5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集至15 mL 塑料離心管。洗脫液在50 ℃下氮?dú)獯蹈?，加入?fù)溶液將吹干后洗脫液定容至1.00 mL，渦旋劇烈震蕩5 min，使用1 mL 注射器過0.22 μm 的濾膜，供液質(zhì)聯(lián)用儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025 號公告-18-2008《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置儀器條件，配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液(0.25 μg/kg、0.50 μg/kg、1.00 μg/kg、2.50 μg/kg、5.00 μg/kg)，待儀器條件合適后，對標(biāo)液進(jìn)行測定，對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，其相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 98。

2.2 方法檢出限測定

以空白的畜禽肌肉樣品作為基質(zhì)，制作陽性樣，濃度C(0.25 μg/kg)，按照上述的方法進(jìn)行前處理操作，之后用液質(zhì)聯(lián)用儀測定，測得克倫特羅的信噪比為S/N=16.5，由此得到其檢出限為0.045 5 μg/kg。

2.3 回收率及精密度確定

以空白畜禽肌肉組織為基質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收率測定試驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為0.25 μg/kg、1.00 μg/kg、2.50 μg/kg。將加標(biāo)后的樣品及空白的組織樣品按照前處理的方法操作，上機(jī)進(jìn)行測試，得到相應(yīng)的精密度及回收率結(jié)果如表1、表2 所示。根據(jù)表1 與表2 中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，且回收率表現(xiàn)較好，克倫特羅的回收率范圍為93.2%～99.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～2.2%。該方法的檢出限較低、重復(fù)性較好，也能保持較為優(yōu)異的回收率，可用于克倫特羅的定性、定量檢測。

3 結(jié)論

本研究提出了一種高效檢測克倫特羅的方法，優(yōu)化了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提取步驟，采用乙酸銨對酶解后的畜禽肌肉組織進(jìn)行提取，得到的溶液通過離心后取上清液進(jìn)行過柱凈化，利用液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行測定。整個(gè)過程所進(jìn)行操作簡單，前處理時(shí)不需要太精密的儀器，同時(shí)所需的有機(jī)試劑較少。結(jié)果表明，該方法的檢出限低，回收率較好，且重復(fù)效果好，有效地消除了基質(zhì)效應(yīng)的干擾，提高了克倫特羅的方法檢測的準(zhǔn)確性及精密度，有效地節(jié)約了檢測的成本與時(shí)間，提升了檢測的效率。通過不同中的抽檢樣品的實(shí)際測試證明，本方法適用于絕大多數(shù)畜禽肌肉組織中克倫特羅的快速定性、定量檢測。