持續(xù)冷暴露通過循環(huán)miRNA影響小鼠血脂代謝的實(shí)驗(yàn)研究

姬寒蕊，吳圣賢

高脂血癥是指由于脂肪代謝或運(yùn)轉(zhuǎn)異常而使血液中脂質(zhì)水平異常的一種疾病。近年來，隨著膳食結(jié)構(gòu)的改變和社會(huì)老齡化的加速，高脂血癥已成為動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性腦卒中、急性心肌梗死等疾病的主要危險(xiǎn)因素，可直接或間接地導(dǎo)致以上疾病發(fā)生或加重，提高其致殘率及死亡率，積極探究血脂代謝紊亂的調(diào)控機(jī)制十分必要。近年來，發(fā)現(xiàn)了一類天然存在的非編碼RNA，稱為microRNA(miRNA)，miRNA為脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[1-2]，在調(diào)節(jié)血脂代謝和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展進(jìn)程中具有關(guān)鍵作用，探究miRNA表達(dá)與血脂代謝的關(guān)系，對(duì)于防治高脂血癥具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立 實(shí)驗(yàn)選用C57BL/6J雄性小鼠建立高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥模型，將90只小鼠隨機(jī)分為兩組，即4 ℃冷暴露組和30 ℃等熱區(qū)對(duì)照組，每組45只。4 ℃冷暴露組常溫下飼養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)入18 ℃環(huán)境飼養(yǎng)箱內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，轉(zhuǎn)入4 ℃環(huán)境飼養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)4周；30 ℃等熱區(qū)對(duì)照組結(jié)束常溫飼養(yǎng)4周后直接轉(zhuǎn)入30 ℃環(huán)境飼養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)5周。高脂飲食配方為15%脂肪、0.25%膽固醇，12 h/12 h光/暗循環(huán)。

本實(shí)驗(yàn)中所有動(dòng)物飼養(yǎng)條件以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵守醫(yī)院重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)制定的相關(guān)規(guī)定。

1.2 血脂水平檢測 取200～300 μL小鼠血清，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測血脂四項(xiàng)，即總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.3 病理學(xué)檢測 取出固定于4%多聚甲醛中的脂肪組織，清洗切塊后放置于石蠟組織包埋盒中，盒外標(biāo)記信息。包埋盒置于自動(dòng)脫水石蠟組織制備儀中脫水、過夜，切片機(jī)切片，40 ℃溫水臺(tái)中使切片舒展開，將水控干后烤片，常溫干燥環(huán)境中保存以備用。取小鼠脂肪組織的石蠟包埋切片，進(jìn)行常規(guī)免疫組織化學(xué)染色和蘇木精-伊紅(HE)染色，免疫組化一抗使用兔抗線粒體解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)抗體(貨號(hào)AB-10983)，購自Abcam公司，二抗為兔二步法檢測試劑盒(貨號(hào)PV-9001)，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。中性樹膠封片后，光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。觀察小鼠肩胛區(qū)、腹股溝區(qū)、附睪區(qū)脂肪組織HE染色情況，比較各部位脂肪組織細(xì)胞面積大小、數(shù)目、小房室形成情況；并分析各部位脂肪組織棕色化標(biāo)志物UCP1免疫組化陽性染色面積。

1.4 二代測序及初步分析 使用Trizol法進(jìn)行血清外泌體RNA提取和純化，Agilent2100檢測各樣本RNA濃度。采用BGISEQ-500測序技術(shù)，對(duì)富集到的18-30nt small RMA片段進(jìn)行測序。對(duì)測序得到的目標(biāo)序列進(jìn)行分類注釋，將數(shù)據(jù)與第22版的miRBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，挑選出比對(duì)上的miRNA的成熟體和前體信息；同時(shí)miRNA的前體能夠形成發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)，使用miRDeep2軟件進(jìn)行新的miRNA預(yù)測。使用TPM對(duì)每個(gè)樣品的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后對(duì)組間樣本進(jìn)行miRNA差異表達(dá)分析，找到表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的miRNA。通過R語言對(duì)miRNA的表達(dá)量進(jìn)行差異性分析。使用miRanda和TargetScan靶基因預(yù)測軟件對(duì)鑒定得到的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，借助GeneOntology 數(shù)據(jù)庫和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)進(jìn)行基因本體(GO)功能顯著性富集分析和信號(hào)通路顯著性富集分析。測序過程由武漢華大基因研究所完成。

2 結(jié) 果

2.1 兩組體重、血脂水平比較 與30 ℃等熱區(qū)對(duì)照組相比，4周4 ℃持續(xù)冷暴露可使小鼠體重減輕約12.85%(P<0.001)，TC水平降低16.10%，LDL-C水平降低約23.41%，TG水平降低約26.51%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組體重、血脂水平比較

2.2 免疫組化和HE染色結(jié)果 對(duì)小鼠肩胛區(qū)棕色脂肪組織進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示，4 ℃冷暴露組與30 ℃等熱區(qū)對(duì)照組相比，脂肪細(xì)胞體積明顯縮小，體型苗條，顯微鏡下可以看到細(xì)胞核染色較深，呈現(xiàn)出棕色化表現(xiàn)。此外，腹股溝脂肪組織HE染色發(fā)現(xiàn)，在30 ℃等熱區(qū)對(duì)照組小鼠的脂肪組織中，染色較淺，為細(xì)胞圓潤的單房脂滴；而4 ℃冷暴露組脂肪組織染色較深，為相對(duì)瘦小的多房脂滴。兩組附睪區(qū)脂肪組織HE染色無明顯區(qū)別。UCP1免疫組織化學(xué)染色提示，與30 ℃等熱區(qū)對(duì)照組相比，4 ℃冷暴露組UCP1可見明顯陽性表達(dá)。詳見圖1～圖6。

圖2 兩組腹股溝區(qū)脂肪組織HE染色圖

圖5 兩組腹股溝區(qū)脂肪組織UCP1免疫組化圖

圖6 兩組附睪區(qū)脂肪組織UCP1免疫組化圖

2.3 兩組小鼠miRNA表達(dá)譜分析 對(duì)兩組樣本進(jìn)行miRNA差異表達(dá)分析，找到上調(diào)和下調(diào)的miRNA。結(jié)果顯示，4 ℃持續(xù)冷暴露組與30 ℃等熱區(qū)對(duì)照組間miRNA表達(dá)譜對(duì)比，篩選出組間顯著差異表達(dá)miRNA 共451條，其中140條miRNA表達(dá)顯著上調(diào)，311條miRNA表達(dá)顯著下調(diào)。顯著差異表達(dá)的前10位未知及已知的miRNA見表2及表3。

表2 兩組顯著差異表達(dá)的未知miRNA(前10位)

表3 兩組顯著差異表達(dá)的已知miRNA(前10位)

2.4 靶基因預(yù)測和GO功能注釋 結(jié)合靶基因預(yù)測結(jié)果與查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，顯著差異表達(dá)的前20位miRNA中，預(yù)測到的novel_mir114、novel_mir389、novel_mir431可靶向作用于低密度脂蛋白受體(LDLR)基因(NM_010700)。此外，查閱既往研究發(fā)現(xiàn)，mmu-miR-344b-3p、mmu-miR-23b-5p、mmu-miR-149-5p、mmu-miR-130b-5p等與脂肪細(xì)胞形成、分化以及肝臟脂質(zhì)代謝等密切相關(guān)，可作用于調(diào)控血脂代謝的相關(guān)基因。同時(shí)4 ℃冷暴露組和30 ℃等熱區(qū)對(duì)照組miRNA差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，這4條miRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)。

GO顯著性富集分析結(jié)果見圖7，分別以不同顏色標(biāo)注。同時(shí)分析結(jié)果顯示，4 ℃冷暴露組與30 ℃等熱區(qū)對(duì)照組相比，差異表達(dá)miRNA靶基因涉及的生物學(xué)過程主要為生物調(diào)節(jié)(biological regulation)、細(xì)胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)、單生物過程(single-organism perocess)。詳見表4。

圖7 GO顯著性富集分析結(jié)果(紅色為基因的分子功能；綠色為細(xì)胞成分；藍(lán)色為參與的生物學(xué)過程)

表4 兩組差異表達(dá)miRNA GO生物學(xué)過程(前10位)

2.5 KEGG信號(hào)通路分析 通過KEGG顯著性富集能確定差異表達(dá)小RNA的靶基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。分析顯示，主要富集的生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括細(xì)胞進(jìn)程(cellular processes)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、人類疾病(human diseases)、新陳代謝(metabolism)、有機(jī)體系統(tǒng)(organismal systems)等。RichFactor系差異小RNA的靶基因中位于該信號(hào)通路條目的基因數(shù)目與所有有注釋基因中位于該信號(hào)通路條目的基因總數(shù)的比值，富集的程度越大，則RichFactor越大。Q值是經(jīng)過多重假設(shè)檢驗(yàn)校正之后的P值，取值范圍為0～1，越接近于零，代表富集越顯著。詳見表5、圖8。

表5 兩組差異表達(dá)miRNA信號(hào)通路條目(前20位)

圖8 信號(hào)通路富集統(tǒng)計(jì)散點(diǎn)圖(排名前20位)

3 討 論

隨著膳食習(xí)慣的改變及社會(huì)老齡化的速度加快，我國成人血脂異?；疾÷蚀蠓仙?，城鎮(zhèn)居民肥胖、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中等代謝性疾病的發(fā)生率亦不斷增加。根據(jù)《中國心血管報(bào)告2018》[3]報(bào)告中描述，目前我國心腦血管疾病的現(xiàn)患人數(shù)已達(dá)到2.9億人，其中腦卒中為1 300萬人，冠心病1 100萬人。心腦血管疾病已成為導(dǎo)致人類死亡的首位原因[4-5]。關(guān)于血脂代謝的內(nèi)在機(jī)制及臨床治療，仍有眾多問題亟待解決。大量流行病學(xué)研究顯示，在全世界范圍內(nèi)，冬季心血管事件顯著高發(fā)[6-7]，腦卒中和心肌梗死與環(huán)境氣溫下降具有明顯的相關(guān)性[8-9]，然而寒冷導(dǎo)致心血管事件增加的原因，一直沒有得到滿意的解答。miRNAs作為一種基因表達(dá)的調(diào)控因子，在肥胖、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和高尿酸血癥等代謝疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，在高脂血癥中的作用更為明顯。已有眾多研究提示，miRNA在轉(zhuǎn)錄后參與調(diào)控極低密度脂蛋白的分泌、膽固醇的內(nèi)源性合成、膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport，RCT)以及肝臟LDLR的表達(dá)等過程。外泌體是一種特殊的細(xì)胞間信號(hào)傳輸載體[10-11]，脂肪細(xì)胞為其主要來源，并可作用于包括肝臟在內(nèi)的多種靶器官[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，4周4 ℃持續(xù)冷暴露可使小鼠體重明顯減輕，TC、TG、LDL-C水平下降；病理學(xué)研究顯示，小鼠皮下棕色脂肪活化、白色脂肪棕色化增加，且免疫組化顯示UCP1增量表達(dá)，表明寒冷暴露后皮下脂肪動(dòng)員，進(jìn)而UCP1依賴性脂解。此外，課題組前期研究顯示，肝臟受到冷刺激后LDLR增量表達(dá)，從而導(dǎo)致血脂水平下降。為了進(jìn)一步探究其內(nèi)在機(jī)制，本研究對(duì)小鼠血清外泌體中的miRNAs進(jìn)行了二代測序。

表達(dá)譜初步分析發(fā)現(xiàn)，與30 ℃等熱區(qū)對(duì)照組相比，mmu-miR-344b-3p、mmu-miR-23b-5p、mmu-miR-149-5p、mmu-miR-130b-5p等在4 ℃持續(xù)冷暴露組小鼠血清中顯著下調(diào)，其中mmu-miR-344b-3p變化最顯著，而miR-130b-5p研究最為充分，且與脂質(zhì)代謝相關(guān)，不過多數(shù)研究認(rèn)為過氧化物酶體增殖劑激活受體家族(PPAR)可能為其調(diào)控脂質(zhì)代謝的潛在靶標(biāo)[13-16]。靶基因預(yù)測結(jié)果顯示，mmu-miR-149-5p可預(yù)測LDLR、 極低密度脂蛋白受體(VLDLR)、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)的轉(zhuǎn)錄激活因子2(CRTC2)、胰島素受體(INSR)等多種脂質(zhì)代謝相關(guān)基因。Zhao等[17]通過高脂飲食誘導(dǎo)建立胰島素抵抗小鼠模型，采用二代高通量測序篩選差異表達(dá)miRNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與正常小鼠相比，肝臟中miR-122-5p、miR-149-5p等顯著差異表達(dá)，miR-149-5p靶基因預(yù)測顯示可預(yù)測到CRTC2、INSR、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(Stat3)等與代謝穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因。

肝LDLR是肝臟膽固醇清除的主要途徑，其表達(dá)受到嚴(yán)格而精細(xì)的調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，新預(yù)測到的未知miRNA包括novel_mir349、novel_mir114和novel_mir287等表達(dá)顯著上調(diào)，novel_mir116、novel_mir431、novel_mir416、novel_mir389等顯著下調(diào)。靶基因預(yù)測初步發(fā)現(xiàn)novel_mir114、novel_mir389、novel_mir431等可直接靶向作用于LDLR基因。未知miRNA參與亦可能是持續(xù)冷暴露下的血脂代謝的調(diào)控機(jī)制之一。

綜上所述，4 ℃持續(xù)冷暴露小鼠血清外泌體中差異表達(dá)的miRNA可能與血脂代謝的調(diào)控機(jī)制有關(guān)。血清中的miRNA可能來源于冷暴露后活化的皮下脂肪組織，并以外泌體為載體到達(dá)肝臟，進(jìn)而參與肝臟中的LDLR膽固醇清除途徑。但目前尚無明顯證據(jù)表明其來源及具體作用靶點(diǎn)，后續(xù)可通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、熒光素酶報(bào)告基因檢測等技術(shù)手段開展深層次探究。