鹽堿土壤放線菌的資源分布、新物種資源及分離方法研究概況

羅 優(yōu)，肖 洋，周庭宇，王 越，謝 宸，李冬瑩，陳雪麗

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與環(huán)境資源研究所，哈爾濱 150086）

0 引言

鹽堿生境是指表層鹽堿集聚，是鹽土和堿土以及各種鹽化、堿化土壤的總稱，由一種或幾種鹽漬土組成[1]。中國鹽堿生境面積較廣，類型多樣，主要分布在西北、華北、西部、華東和東北等地區(qū)[2]。DNA測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步以及多相分類方法的發(fā)展，為大量的鹽堿土壤放線菌的挖掘與分類提供了客觀可靠的手段。許多研究表明，已從鹽堿土壤環(huán)境中分離出大量放線菌，其對(duì)極端條件有特殊適應(yīng)機(jī)制且在生物技術(shù)方面具有很大的潛力[3]，如抗生素、殺菌劑和抗病毒等[4]。但社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展導(dǎo)致鹽堿生境持續(xù)惡化，鹽堿生境極端放線菌資源的挖掘與多樣性保護(hù)刻不容緩。

因此，充分了解鹽堿土壤放線菌的資源分布，包括其多樣性和新物種資源，進(jìn)一步分析歸納具有針對(duì)性的分離篩選技術(shù)，是鹽堿土壤放線菌挖掘和多樣性保護(hù)的重要前提。

1 鹽堿土壤放線菌的資源分布與新物種資源

隨著微生物系統(tǒng)學(xué)的不斷發(fā)展，越來越多的微生物物種資源被人們所發(fā)掘；但目前所發(fā)現(xiàn)的鹽堿土壤放線菌資源只是自然界中物種數(shù)量的極少數(shù)，還有很多的未知鹽堿土壤放線菌資源未被發(fā)掘。而充分認(rèn)識(shí)鹽堿土壤放線菌的資源分布情況，包括其多樣性和新物種資源，是挖掘鹽堿土壤放線菌資源的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1.1 鹽堿土壤放線菌的地理分布

在中國，鹽堿土壤的分布區(qū)域非常廣泛，主要是分布在秦嶺淮河以北，大致可劃分為濱海鹽漬區(qū)、東北鹽漬區(qū)、黃淮海鹽漬區(qū)、甘新青鹽漬區(qū)[5]。其氣候區(qū)分布特點(diǎn)多種多樣，囊括了濕潤(rùn)區(qū)、半濕潤(rùn)區(qū)、半干旱區(qū)、干旱區(qū)、半漠境區(qū)、漠境區(qū)等，因此也造就了鹽堿土壤中嗜鹽耐堿放線菌資源的多樣性。其中，甘新青鹽漬區(qū)是中國鹽堿土壤可培養(yǎng)放線菌資源研究最多的區(qū)域。潘媛媛等[6]在東北鹽漬區(qū)中的松嫩平原的鹽堿地耐鹽菌生物多樣性的研究中，純培養(yǎng)放線菌占比達(dá)到17.5%，其主要的分類群為庫克菌屬(Kocuria)、喬治菌屬(Georgenia)、劉志恒菌屬(Zhihengliuella)。且研究者對(duì)中國鹽堿生境中放線菌資源有極大興趣，因而放線菌資源純培養(yǎng)的調(diào)查研究也逐年增加。

1.2 鹽堿土壤放線菌的多樣性

目前，在中國，主要是在西北、華北、西部、華東和東北等地區(qū)進(jìn)行鹽堿土壤放線菌資源的調(diào)查研究，且各地區(qū)差異顯著。

1.2.1 西北地區(qū) 地區(qū)鹽堿土壤放線菌資源調(diào)查研究主要分布在新疆、內(nèi)蒙古和青海。鹽堿土由于獨(dú)特的地理位置和干旱的氣候，廣泛分布于中國西北部的新疆，因此新疆成為中國鹽堿土壤放線菌資源研究的熱點(diǎn)區(qū)域，也是報(bào)道最多的[7]。新疆地區(qū)占主導(dǎo)地位的放線菌類群為放線多孢菌科(Actinopolysporaceae)[7-9]、糖霉菌科 (Glycomycetaceae)[10-11]、姜氏菌科(Jiangellaceae)[12]、博戈里亞湖菌科(Bogoriellaceae)[13]、短桿菌科(Brevibacteriaceae)[14-15]、微球菌科(Micrococcaceae)[16-18]、原小單孢菌科(Promicromonosporaceae)[19]、阮氏菌科(Ruaniaceae)[20]、棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)[21]、假諾卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)[22-24]、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)[25-26]、擬諾卡氏菌科(Nocardiopsaceae)[27-28]、生地所球菌科(Egicoccaceae)[29]。諾卡氏菌科的大多數(shù)成員都從鹽水或堿性環(huán)境中分離，能采用復(fù)雜的菌絲分化來適應(yīng)這些極端環(huán)境，從而獲得形成一些生物活性產(chǎn)物的能力[27]。利用純培養(yǎng)分離篩選技術(shù)對(duì)青海省土壤微生物群落多樣性的研究中，共分離到7個(gè)屬，包括微桿菌屬(Microbacterium)[30]、Yaniella[18]、劉志恒氏菌屬(Zhihengliuella)[31]、產(chǎn)絲菌屬(Myceligenerans)[32]、棲白蟻菌屬(Isoptericola)[33]、鏈霉菌屬(Streptomyces)[34-35]、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)[36-37]。研究表明，嗜堿放線菌可以產(chǎn)生多種堿性酶和生物活性物質(zhì)，如抗生素和酶抑制劑，在堿性環(huán)境中生長(zhǎng)的嗜堿放線菌具有典型的營養(yǎng)需求、培養(yǎng)條件和生理特性[34]。目前，對(duì)內(nèi)蒙古鹽堿土壤放線菌的研究較少，只在位于內(nèi)蒙古自治區(qū)采集的鹽堿土壤樣品中分離到Phytoactinopolyspora屬的一種新的中度嗜鹽菌[38]。

1.2.2 華北地區(qū) 該地區(qū)鹽堿土壤放線菌資源調(diào)查研究以河北省為主，都是從鹽堿地堿蓬的根際土壤分離出來。純培養(yǎng)結(jié)果表明，河北省鹽堿土壤可培養(yǎng)放線菌類群主要為Salilacibacter、Planctomonas、Hoyosella[39-41]。其次，山西省鹽堿土壤可培養(yǎng)放線菌類群，主要為原小單孢菌科(Promicromonosporaceae)[42]。

1.2.3 西部地區(qū) 研究表明，西部地區(qū)鹽堿土壤可培養(yǎng)放線菌的分類群以擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)為主[43]，包括瓊斯菌屬(Jonesia)[44]。擬諾卡氏菌屬的成員在鹽漬土或堿性土壤中占優(yōu)勢(shì)，已從中分離出較多新物種[43]。

1.2.4 華東地區(qū) 山東省東營勝利油田被原油污染的鹽堿土里面蘊(yùn)含著較為豐富的可培養(yǎng)鹽堿土壤放線菌資源，主要的分類群為Hoyosella[45]、四球菌屬(Tessaracoccus)[46]。而在山東省德州市陵縣的鹽堿土壤可培養(yǎng)放線菌資源的調(diào)查研究中，純培養(yǎng)結(jié)果表明，該地的主要分類群為冷桿菌屬(Frigoribacterium)[47]。中國對(duì)濱海鹽漬區(qū)放線菌資源的研究較少，一些學(xué)者[48]從江蘇省連云港沿海地區(qū)采集的鹽漬土壤中分離得到一株放線菌，分類群是諾卡菌屬(Nocardia)，該屬的大多數(shù)物種是從土壤樣品中分離出來的。

1.2.5 東北地區(qū) 潘媛媛等[49]對(duì)松嫩平原鹽堿土壤中耐鹽和嗜鹽細(xì)菌的微生物多樣性和分類進(jìn)行研究，純培養(yǎng)結(jié)果表明該地嗜鹽耐堿放線菌資源豐富，考克氏菌屬(Kocuria)占優(yōu)勢(shì)。鏈霉菌屬(Streptomyces)[50-51]在黑龍江地區(qū)鹽堿土壤可培養(yǎng)放線菌資源中占主導(dǎo)地位。鏈霉菌屬的成員因具有產(chǎn)生多種次生代謝物的能力而被廣泛關(guān)注，包括產(chǎn)生抗菌和抗腫瘤活性的化合物[50]。

1.2.6 西南地區(qū) 云南省玉溪市元江縣中存在著大量的可培養(yǎng)放線菌資源，動(dòng)孢菌科(Kineosporiaceae)[52]在其中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其次是假諾卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)[53]。

綜上所述，鹽堿生境中蘊(yùn)藏著的放線菌資源較為豐富，其中主要以微球菌科(Micrococcaceae)、假諾卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)、擬諾卡氏菌科(Nocardiopsaceae)占主導(dǎo)地位。但鹽堿土壤中還有大量的放線菌物種等著人們?nèi)ネ诰蚝瓦M(jìn)行多樣性保護(hù)。

1.3 鹽堿土壤放線菌的新物種資源分類

了解從鹽堿生境通過純培養(yǎng)分離出來的放線菌新物種情況，對(duì)相關(guān)生境放線菌資源的挖掘與多樣性的保護(hù)具有重要理論價(jià)值。由于從常見物種中尋找新的藥物化合物變得更加困難，許多研究者已轉(zhuǎn)向來自不尋常和未被探索的一些極端生境中挖掘放線菌資源，如鹽漬土[50]。經(jīng)總結(jié)，從2000年至今在中鹽堿生境中已有96株放線菌新物種被報(bào)道，分別屬于2個(gè)綱、11個(gè)目、18個(gè)科和40個(gè)屬。其中，擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)占主導(dǎo)地位，有13個(gè)放線菌新物種；其次是鏈霉菌屬(Streptomyces)、糖霉菌屬(Glycomyces)和鏈單孢菌屬(Streptomonospora)占比較高，分別是11、6、5個(gè)放線菌新物種；放線多孢菌屬(Actinopolyspora)、Phytoactinopolyspora、涅斯捷連科氏菌屬(Nesterenkonia)和糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)，都是4個(gè)放線菌新物種等。特別明顯的是，西北地區(qū)是這些放線菌新物種資源的主要來源地區(qū)，其中新疆地區(qū)是放線菌新物種資源最多的地區(qū)，其次是青海地區(qū)、西部地區(qū)和云南地區(qū)（圖1）。2000—2021年鹽堿土壤放線菌新物種數(shù)量呈現(xiàn)出較為穩(wěn)定的起伏增長(zhǎng)趨勢(shì)，在2016年激增達(dá)到最高數(shù)量的新物種（圖2）。

圖1 2000—2021年已發(fā)表鹽堿土壤放線菌新物種樣品來源地

圖2 2000—2021年已發(fā)表鹽堿土壤放線菌新物種數(shù)

2 鹽堿土壤放線菌的分離培養(yǎng)方法

鹽堿土壤中放線菌的最適分離培養(yǎng)方法包括土壤前處理、抑制劑選擇、培養(yǎng)基的選擇、培養(yǎng)基鹽堿的添加以及培養(yǎng)溫度與時(shí)間的選擇，可以提高鹽堿土中嗜鹽堿放線菌的篩選效率，以期能為今后鹽堿土放線菌資源的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

2.1 土樣預(yù)處理

為了使得放線菌，尤其是目的放線菌的數(shù)量大量增加，可以對(duì)土壤樣品進(jìn)行預(yù)處理，這樣減少了真菌以及非放線菌型細(xì)菌的數(shù)量。研究表明，土壤樣品加入到含有10%氯化鈉的無菌水中，再通過渦旋混合，能增加放線菌的出菌率[54]。也有研究證明，土壤樣品在28℃環(huán)境下自然風(fēng)干7天，然后將自然風(fēng)干的土壤樣品80℃干熱處理1 h，一些常見細(xì)菌與真菌數(shù)量明顯減少，有助于動(dòng)球菌屬(Kineococcus)、普氏菌屬(Prauserella)等類群的分離[52-53]。研究者采用將土壤樣品在振蕩培養(yǎng)箱中于28℃孵育2～3天的預(yù)處理方法，從黑龍江省肇東市德昌鄉(xiāng)的鹽堿土壤中分離培養(yǎng)到一株考克氏菌屬(Kocuria)的新物種[49]。將土壤樣品(5 g)懸浮在蒸餾水(2 mL)中，進(jìn)行超聲處理(160 W)3 min，再加入蒸餾水(43 mL)、3%酵母提取物(w/v，1 mL)和2.5% SDS(w/v，1 mL)，超聲處理有利于放線菌細(xì)胞和孢子從土壤中脫落，從而提高其放線菌的出菌率[50]。

2.2 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)

培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)對(duì)于放線菌的分離篩選是至關(guān)重要的，包括培養(yǎng)基種類、pH與鹽濃度的調(diào)節(jié)以及抑制劑的選擇。

2.2.1 培養(yǎng)基 許多研究表明，ISP系列培養(yǎng)基(ISP2、ISP4、ISP5)對(duì)于放線菌類群有較高的選擇性，包括涅斯捷連科氏菌屬(Nesterenkonia)、糖單孢菌屬(Saccharomonospora)和鏈單孢菌屬(Streptomonospora)，尤其是擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)[27,34]。而starchcasein agar培養(yǎng)基則對(duì)動(dòng)球菌屬(Kineococcus)、普氏菌屬(Prauserella)和鏈單孢菌屬(Streptomonospora)等放線菌類群有較強(qiáng)的選擇性[23,28,52]。腐植酸和不同濃度的vitamin agar培養(yǎng)基是分離篩選稀有嗜鹽放線菌的最佳基質(zhì)，腐植酸通過阻止培養(yǎng)基中可擴(kuò)散色素的產(chǎn)生，加強(qiáng)了放線菌的形態(tài)特征[55]。此外，除了以上ISP系列培養(yǎng)基和starch-casein agar培養(yǎng)基外，CCMS、GW1、SSC、SM3、GTY、chitin-asparagine和CMKA等培養(yǎng)基也是分離鹽堿土壤放線菌比較常用的培養(yǎng)基[8,10,13]。

2.2.2 pH的影響 堿是鹽堿土壤中的不可或缺的因素，因此在進(jìn)行分離培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的時(shí)候，其培養(yǎng)基的pH應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。分離培養(yǎng)鹽堿土壤放線菌時(shí)常用Na2CO3、NaOH、KOH和K2CO3來調(diào)節(jié)pH[34]。大量研究表明，較多鹽堿土壤放線菌在分離培養(yǎng)在pH 7.0～7.5時(shí)能被分離篩選出來[11,23,28]。一些學(xué)者將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為pH 10～10.5，有助于棲白蟻菌屬(Isoptericola)[33]、鏈霉菌屬(Streptomyces)[34]、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)[27]和生地所球菌屬(Egicoccus)[29]等放線菌類群的選擇性分離。

2.2.3 鹽濃度的影響 鹽是鹽堿土壤中另一不可或缺的因素，因此調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的鹽濃度對(duì)于有選擇性地分離放線菌是十分重要的。常用NaCl、CaSO4和KCl來進(jìn)行培養(yǎng)基鹽濃度的調(diào)節(jié)，而大量鹽堿土壤放線菌是在培養(yǎng)基鹽濃度為5%～15%時(shí)被分離出來[28,42-43]。研究表明，培養(yǎng)基鹽濃度高達(dá)20%時(shí)，有助于Yaniella[18]、普氏菌屬(Prauserella)[23]、鏈霉菌屬(Streptomyces)[35]和擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)[56]等放線菌類群的分離。

2.2.4 抑制劑的選擇 一些特定的抑制劑的使用有利于抑制非放線菌型細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，使得目的放線菌的數(shù)量顯著增加[55]。放線菌酮(cycloheximide)、萘啶酮酸(nalidixic acid)、制霉菌素(nystatin)和重鉻酸鉀(potassium dichromate)是鹽堿土壤放線菌分離過程中常用的抑制劑。研究表明，在培養(yǎng)基中添加放線菌酮(50 mg/L)以及萘啶酮酸(20 mg/L)主要的分離物種為鏈霉菌屬(Streptomyces)[50-51]。此外，一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)重鉻酸鉀(70 mg/L)能有選擇性地分離到動(dòng)球菌屬(Kineococcus)[52]。

2.3 培養(yǎng)溫度與時(shí)間

截至目前，大量的已發(fā)表鹽堿土壤放線菌，培養(yǎng)溫度范圍在28～37℃，培養(yǎng)溫度為28℃時(shí)分離的放線菌物種最多[18,23,26]，其次是37、30、32、35℃。值得注意的是，鹽堿土壤放線菌的培養(yǎng)時(shí)間范圍長(zhǎng)達(dá)5周，大部分放線菌在培養(yǎng)2周時(shí)生長(zhǎng)，但也有一部分生長(zhǎng)較為緩慢，長(zhǎng)達(dá)5周[41]，因此在進(jìn)行鹽堿土壤放線菌的分離培養(yǎng)時(shí)，適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間能夠分離到一些稀有的新物種。

3 展望

鹽堿土壤放線菌因具有適應(yīng)極端環(huán)境條件的獨(dú)特性，在生物科技創(chuàng)新領(lǐng)域占據(jù)著重要地位。且隨著純培養(yǎng)技術(shù)以及現(xiàn)代測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展與成熟，越來越多的鹽堿土壤放線菌新物種及其功能基因被挖掘和開發(fā)。值得注意的是，由于目前人們并沒有充分掌握最適鹽堿土壤放線菌自然狀態(tài)的預(yù)處理、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，這些基于人工條件挖掘出來的鹽堿土壤放線菌只是自然界微生物的極少部分。

深入了解鹽堿土壤放線菌的資源分布、新物種資源和多樣性，有利于系統(tǒng)保護(hù)并充分利用其基因資源，而分析歸納鹽堿土壤放線菌的分離培養(yǎng)技術(shù)，則為充分挖掘新物種資源奠定基礎(chǔ)。目前，純培養(yǎng)技術(shù)與免培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，更有助于更全面的挖掘與分析鹽堿土壤的放線菌物種多樣性，以此來豐富微生物資源庫，也為生物技術(shù)創(chuàng)新提供特殊的材料支持。