褪黑素對(duì)扁莖黃芪種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

謝豐璞，徐蓉蓉，高 靜，關(guān)思靜，葛甜甜，張亞麗，王 楠，顏永剛，李 鉑，黃文靜

（1陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西咸陽 712083；2秦藥特色資源研究開發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），陜西咸陽 712083；3陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西咸陽 712046）

0 引言

種子的萌發(fā)需要良好的外界環(huán)境條件重新激活代謝活動(dòng)，整個(gè)過程涉及呼吸過程、儲(chǔ)備酶解、生物合成等一系列反應(yīng)，使得種子達(dá)到發(fā)芽條件，直至長(zhǎng)成幼苗[1]。種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)都是植物發(fā)育的關(guān)鍵階段，外界不利的生存環(huán)境可能使植物初期形態(tài)的建成受到影響，甚至影響植物的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致植物無法成活。當(dāng)下全球環(huán)境日益惡劣，土地問題甚多，植物的種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)階段受到了嚴(yán)重的影響。土地鹽漬化和干旱問題一直以來是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要難題。植物在脅迫下的生長(zhǎng)發(fā)育備受關(guān)注，其研究?jī)?nèi)容涉及到旱、鹽脅迫對(duì)植物種子萌發(fā)的影響[2]，旱、鹽脅迫或者復(fù)合脅迫對(duì)植物生理生化特性的影響[3-4]，耐旱耐鹽基因的發(fā)掘與應(yīng)用及其植物新品種的理論研究[5-6]，植物抗逆育種中抗旱、耐鹽相關(guān)基因的抗逆機(jī)制研究[7-9]，以及外源物質(zhì)的添加是否對(duì)旱鹽脅迫下種子萌發(fā)或幼苗生長(zhǎng)具有緩解作用[10-11]等內(nèi)容。

為了幫助植物更好地適應(yīng)環(huán)境的變化，并保證資源的可持續(xù)性利用與發(fā)展，許多研究涉及在實(shí)驗(yàn)室模擬外界環(huán)境，通過添加外源物質(zhì)來提高植物的耐旱、耐鹽性等耐逆性，以期提高植物的抗性。所添加的外源物質(zhì)種類涉及到激素類（赤霉素、脫落酸、吲哚乙酸等）[12]、吲哚類色胺（褪黑素）[13]、酚類化合物（水楊酸）等[10]。近年來，作為一種具有多種細(xì)胞活性和生理活性的多功能小分子褪黑素的研究逐漸增多。褪黑素不僅對(duì)非生物逆境具有一定的緩解作用，還可以調(diào)控生物逆境脅迫，比如低濃度的褪黑素可以抑制一些革蘭式陽性及革蘭氏陰性的病原菌[14]?！吨袊?guó)藥典》中規(guī)定豆科植物扁莖黃芪(Astragalus complanatus)的干燥成熟種子為中藥材沙苑子，其主要功效為補(bǔ)腎助陽固精縮尿、養(yǎng)肝明目，可用于治療腎虛腰痛、遺精早泄、遺尿尿頻、白濁帶下等。當(dāng)前惡劣的環(huán)境影響扁莖黃芪的產(chǎn)量。不同的溫度、鹽和干旱脅迫條件下褪黑素發(fā)揮的作用，以及扁莖黃芪的種子和幼苗在脅迫下如何響應(yīng)褪黑素等問題尚不明確。本研究使用不同濃度的褪黑素溶液將扁莖黃芪浸種后，再以不同濃度的氯化鈉(NaCl)、聚乙二醇6000(PEG)溶液模擬不同程度的鹽脅迫和干旱脅迫條件，并將所有處理置于不同溫度下探討褪黑素對(duì)扁莖黃芪種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)的影響，以期為提高其耐逆性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)于2020年6—9月在陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)選用的扁莖黃芪種子（沙苑子）購自陜西大荔，所用鹽(NaCl)來自天津市天力化學(xué)試劑有限公司，次氯酸鈉(NaClO)和聚乙二醇6000(PEG)來自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，且均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)以扁莖黃芪的種子為研究對(duì)象，選擇完好無損、顆粒飽滿、完全成熟的種子，將種子用2%的NaClO消毒40 min后沖洗干凈，備用。配制6個(gè)不同濃度的褪黑素(MT)溶液，濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mmol/L，用 T0～T5表示，體積為 50 mL。以NaCl溶液模擬鹽環(huán)境，PEG溶液模擬干旱環(huán)境。配制3個(gè)不同濃度的PEG 6000溶液，濃度分別為15%、20%、25%，用P1、P2、P3表示；配制3個(gè)不同濃度的NaCl溶液，濃度分別為0.375%、0.635%、0.895%，用N1、N2、N3表示，且PEG和NaCl處理液滲透勢(shì)分別為-0.3、-0.5、-0.7 MPa。分別置于4個(gè)溫度(15、20、25、30℃)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以NaCl和PEG處理為實(shí)驗(yàn)組，蒸餾水處理為對(duì)照組(CK)。將選好的種子浸泡至不同濃度的褪黑素溶液中，靜置24 h。將褪黑素浸泡過的種子置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中放30粒種子，相同的處理設(shè)置3次重復(fù)，在12 h/12 h的光/暗周期交替的人工氣候箱中完成實(shí)驗(yàn)，觀察種子的萌發(fā)情況。實(shí)驗(yàn)開始起每隔24 h對(duì)各培養(yǎng)皿進(jìn)行觀察，記錄萌發(fā)種子數(shù)，補(bǔ)充相應(yīng)處理液，并每隔2天更換處理液和濾紙。

1.4 種子萌發(fā)指標(biāo)與幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

連續(xù)記錄13天后，培養(yǎng)皿中無種子發(fā)芽，停止觀察。計(jì)算種子最終發(fā)芽率、平均發(fā)芽時(shí)間。

式中，nt為第t天的發(fā)芽數(shù)，n為最終發(fā)芽數(shù)。

第14天，從相同處理的培養(yǎng)皿中，選取6個(gè)發(fā)芽與長(zhǎng)勢(shì)良好的幼苗，用濾紙吸干幼苗上的水分，用刻度尺測(cè)定胚根、胚軸、子葉的長(zhǎng)度，并將其放至烘箱，溫度設(shè)置為80℃，烘4 h，稱量干重。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013軟件和IBM SPSS Statistics 21統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)萌發(fā)和生長(zhǎng)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，并進(jìn)行差異顯著性分析（LSD法，P＜0.05）和多因素方差分析；Canoco軟件進(jìn)行t值雙序圖分析；使用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析與預(yù)測(cè)，并用SigmaPlot 14.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫下扁莖黃芪種子萌發(fā)的影響

鹽脅迫下（表1），經(jīng)不同濃度的褪黑素溶液處理后，扁莖黃芪種子在3個(gè)脅迫濃度間最終發(fā)芽率差異不明顯。15℃時(shí)，N2T5最終發(fā)芽率最高(88.89%)，顯著高于同組其他處理(P＜0.05)，而N3T5最低(56.67%)；20℃時(shí)，CK最終發(fā)芽率最高(86.67%)，顯著高于同組其他處理(P＜0.05)，而N3T2最低(50%)；25℃時(shí)，N2T4最終發(fā)芽率(82.22%)顯著高于同組其他處理(P＜0.05)，最低值出現(xiàn)在N3T5(52.69%)；30℃時(shí)，N1T3最終發(fā)芽率最高(81.11%)，而N3T5的最低(40%)。

表1 不同處理下褪黑素對(duì)扁莖黃芪種子最終發(fā)芽率的影響(±s，n=3)%

表1 不同處理下褪黑素對(duì)扁莖黃芪種子最終發(fā)芽率的影響(±s，n=3)%

脅迫類型 處理 15℃ 20℃ 25℃ 30℃空白對(duì)照鹽脅迫CK N1T0 N1T1 N1T2 N1T3 N1T4 N1T5 N2T0 N2T1 N2T2 N2T3 N2T4 N2T5 N3T0 N3T1 N3T2 N3T3 N3T4 N3T5 84.44±11.71ab 65.55±6.94abc 81.11±3.85ab 62.22±8.39bc 73.33±3.33abc 81.11±8.39ab 83.33±5.77ab 76.67±12.02abc 84.44±6.94ab 76.67±6.67abc 82.22±5.09ab 73.33±3.33abc 88.89±3.85a 73.33±12.02abc 85.56±5.09ab 78.89±8.39abc 75.56±13.88abc 70.00±3.33abc 56.67±4.71c 86.67±3.33a 72.22±3.85abc 66.67±3.33abc 60.00±3.33bc 80.00±8.82ab 70.00±6.67abc 66.67±8.82abc 58.89±13.47bc 55.56±5.09bc 60.00±3.33bc 65.56±6.94abc 72.22±10.72abc 66.67±10abc 65.00±16.50abc 70.00±3.85abc 50.00±1.92c 70.00±7.70abc 65.00±6.94abc 58.33±15.03bc 63.33±6.67abc 81.11±1.92ab 72.22±3.85abc 65.56±4.71abc 81.11±8.39ab 76.67±6.67ab 62.22±7.07abc 60.00±8.82bc 68.89±5.09abc 62.22±5.09abc 66.67±4.71abc 82.22±1.92a 73.33±3.33abc 72.22±3.85abc 60.83±7.42abc 73.33±6.67abc 68.89±5.09abc 72.22±7.70abc 52.69±5.73c 63.33±10ab 65.56±1.92ab 70.00±8.82ab 75.56±10.72ab 81.11±9.62a 72.22±5.09ab 70.00±8.82ab 67.78±1.92ab 61.11±9.62ab 53.33±8.82ab 67.78±5.09ab 58.89±15.03ab 61.11±15.40ab 64.44±8.39ab 61.67±2.36ab 53.33±0.00b 46.67±0.00b 60.00±16.50ab 40.00±6.67b

續(xù)表1

干旱脅迫下（表1），隨著溫度的升高，扁莖黃芪最終發(fā)芽率整體降低。不同濃度的褪黑素溶液處理在一定程度上緩解了干旱脅迫造成的影響，同一溫度下隨著干旱程度的增加，扁莖黃芪種子最終發(fā)芽率降低。15℃時(shí)，CK的最終發(fā)芽率最高(84.44%)；20℃時(shí)，與CK組相比，P1脅迫下，T3處理的最終發(fā)芽率最高(88.89%)；25℃時(shí)，處理組P1T3發(fā)芽率最高，CK與脅迫P1的各處理間無顯著性差異，當(dāng)脅迫為P2和P3時(shí)，各處理組發(fā)芽率顯著性降低(P＜0.05)，尤其是P3；30℃時(shí)，CK與處理組P1T0、P1T2和P1T4無顯著性差異，但處理組P2T0、P2T2、P2T4和P2T5發(fā)芽率顯著降低(P＜0.05)，隨著脅迫程度的增加，部分處理組種子出現(xiàn)未發(fā)芽的情況，尤其是脅迫為P3時(shí)，各處理組均未發(fā)芽。

鹽脅迫和干旱脅迫下，各溫度平均發(fā)芽時(shí)間隨著脅迫程度的增加不同程度增加（表2）。鹽脅迫下，扁莖黃芪平均發(fā)芽時(shí)間在15～25℃時(shí)隨著脅迫程度的增加而增加，但30℃時(shí)在3個(gè)脅迫間無顯著差異。15℃時(shí)，N3T3的平均發(fā)芽時(shí)間（4.83天）顯著大于其他處理組(P＜0.05)，而N1T2（1.90天）的顯著小于其他處理組(P＜0.05)；20℃時(shí)，N3T0的平均發(fā)芽時(shí)間（4.66天）顯著大于其他處理組(P＜0.05)，而CK組最小（1.88天）；25℃時(shí)，除N1T4的平均發(fā)芽時(shí)間（1.78天）顯著小于其他處理組外，其余各處理均大于CK組（1.79天），最大值出現(xiàn)在處理組N3T5（5.22天）。30℃時(shí)，N3T0處理組發(fā)芽時(shí)間最長(zhǎng)（2.82天），而N1T5處理組發(fā)芽時(shí)間最短（1.89天）。干旱脅迫下，扁莖黃芪在15、20、30℃時(shí)，P2和P3脅迫下平均發(fā)芽時(shí)間明顯大于P1，且20～30℃時(shí)各處理組的平均發(fā)芽時(shí)間均大于CK組。15℃時(shí)，P3T4平均發(fā)芽時(shí)間最長(zhǎng)（8天）；20℃時(shí)，P3T4發(fā)芽時(shí)間（8天）顯著大于其他處理；25℃時(shí)，發(fā)芽時(shí)間在3個(gè)脅迫間差異不是很明顯；30℃時(shí)，P2T0發(fā)芽時(shí)間（5.17天）顯著大于其他處理(P＜0.05)。

表2 不同處理下扁莖黃芪種子平均發(fā)芽時(shí)間的變化(±s，n=3) d

表2 不同處理下扁莖黃芪種子平均發(fā)芽時(shí)間的變化(±s，n=3) d

脅迫類型 處理15℃20℃25℃30℃空白對(duì)照鹽脅迫鹽脅迫CK N1T0 N1T1 N1T2 N1T3 N1T4 N1T5 N2T0 N2T1 N2T2 N2T3 N2T4 N2T5 N3T0 N3T1 N3T2 N3T3 N3T4 N3T5 P1T0 P1T1 P1T2 P1T3 P1T4 P1T5 P2T0 P2T1 P2T2 P2T3 P2T4 P2T5 P3T0 P3T1 P3T2 P3T3 P3T4 P3T5 3.15±0.10bcd 2.24±0.13efg 2.27±0.14defg 1.90±0.34g 2.08±0.03fg 2.15±0.36efg 2.16±0.11efg 2.47±0.10cdefg 2.19±0.19efg 2.05±0.18fg 2.37±0.42defg 3.10±0.39bcde 2.60±0.31cdef 3.34±0.11bc 2.85±0.13cdef 3.23±0.09bcd 4.83±0.17a 3.53±0.47bc 4.25±0.12ab 3.00±0.27ab 2.86±0.14ab 3.10±0.34ab 3.22±0.18ab 3.19±0.40ab 3.35±0.12ab 6.16±0.28a 5.40±0.62a 5.58±0.00a 4.84±0.39ab 5.75±0.042a 5.10±0.27ab 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 5.00±0.00ab 8.00±0.00a 5.5±0.70ab 1.88±0.26d 2.35±0.25bcd 2.0±0.15cd 2.27±0.14bcd 1.89±0.04cd 2.41±0.21bcd 2.02±0.14cd 3.18±0.04ab 2.16±0.08bcd 2.67±0.17bcd 2.19±0.25bcd 2.34±0.09bcd 2.36±0.28bcd 4.66±0.17a 2.89±0.07ab 4.34±0.07a 2.89±0.14ab 3.17±0.15ab 2.98±0.03ab 2.94±0.49f 3.29±0.54ef 3.22±0.69ef 2.99±0.48f 2.63±0.29fg 2.17±0.19g 5.86±0.29b 4.67±0.12c 5.00±1.06bc 4.00±0.55d 3.84±0.15de 3.58±0.45e 5.50±0.35bc 6.50±0.70ab 6.00±0.00b 7.25±1.06ab 8.00±0.00a 6.20±0.00b 1.79±0.19g 2.24±0.44efg 2.26±0.08efg 1.93±0.38g 2.06±0.17fg 1.78±0.08g 2.51±0.58def 3.80±0.44abcd 3.25±0.56cdef 2.64±0.19def 3.26±0.25cdef 3.56±0.63cde 3.27±0.20cdef 4.34±0.34ab 4.17±0.29abc 3.76±0.50bcd 4.07±0.11abc 4.59±0.51ab 5.22±0.25a 2.86±0.50a 2.66±0.17ab 2.98±0.17a 2.70±0.31ab 3.41±0.20a 3.24±0.46a 3.00±0.24a 3.30±0.24a 2.33±0.24b 3.48±0.94a 3.66±0.48a 2.99±0.15a 2.00±0.14bc 0.00±0.00 4.00±0.11a 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 2.05±0.41a 2.00±0.09a 1.93±0.20a 2.06±0.14a 2.31±0.03a 2.27±0.09a 2.39±0.05a 2.26±0.10a 2.38±0.16a 2.24±0.08a 2.08±0.03a 2.25±0.41a 2.19±0.19a 2.52±0.08a 2.25±0.48a 2.53±0.75a 2.50±0.00a 2.38±0.50a 2.15±0.19a 2.68±0.14ab 2.66±0.01ab 2.63±0.09ab 2.75±0.11ab 2.46±0.24ab 2.67±0.30ab 5.17±1.18a 0.00±0.00 1.67±0.71ab 0.00±0.00 4.25±1.06ab 3.29±0.40ab 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00

2.2 不同溫度下褪黑素對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫下對(duì)扁莖黃芪幼苗生長(zhǎng)的影響

由表3可知，同一溫度下，胚根長(zhǎng)隨著鹽脅迫和干旱脅迫滲透勢(shì)的增加而降低；同一滲透勢(shì)脅迫下，胚根長(zhǎng)隨著溫度的增加而先增加后減少；而胚根長(zhǎng)隨著溫度和脅迫滲透勢(shì)的變化而變化不同。鹽脅迫下，溫度為20℃和25℃時(shí)扁莖黃芪經(jīng)褪黑素處理后幼苗胚根長(zhǎng)勢(shì)最好；胚根在經(jīng)褪黑素處理后增加，其長(zhǎng)度大于T0和CK純水處理組，25℃時(shí)N1T3處理的胚根長(zhǎng)達(dá)到最大值(5.07 cm)。干旱脅迫下，20℃時(shí)扁莖黃芪經(jīng)褪黑素處理后幼苗胚根長(zhǎng)勢(shì)最好，而15℃和30℃時(shí)2種脅迫下扁莖黃芪胚根長(zhǎng)勢(shì)最差；25℃時(shí)，P1T2處理的胚根長(zhǎng)達(dá)到最大值(7.07 cm)。

表3 不同處理下扁莖黃芪幼苗胚根的變化(±s，n=3) cm

表3 不同處理下扁莖黃芪幼苗胚根的變化(±s，n=3) cm

脅迫類型空白對(duì)照鹽脅迫鹽脅迫處理CK N1T0 N1T1 N1T2 N1T3 N1T4 N1T5 N2T0 N2T1 N2T2 N2T3 N2T4 N2T5 N3T0 N3T1 N3T2 N3T3 N3T4 N3T5 P1T0 P1T1 P1T2 P1T3 P1T4 P1T5 P2T0 P2T1 P2T2 P2T3 P2T4 P2T5 P3T0 P3T1 P3T2 P3T3 P3T4 P3T5 15℃0.82±0.27abcde 0.83±0.093bcde 1.62±0.13a 0.96±0.18bcde 0.83±0.13bcde 0.68±0.10de 0.46±0.13e 1.28±0.08abcd 1.47±0.17ab 0.95±0.21bcde 0.84±0.12bcde 0.54±0.25e 1.00±0.24abcde 0.82±0.13cde 0.78±0.14de 0.67±0.23de 0.41±0.12e 0.60±0.11e 0.73±0.17de 1.00±0.20bcd 1.23±0.21bc 1.45±0.18b 2.05±0.23a 1.18±0.17bcd 1.20±0.16bcd 0.66±0.16def 1.10±0.19bcd 0.79±0.20cdef 1.09±0.22bcd 0.34±0.06fg 0.47±0.13efg 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 20℃2.89±0.42bcd 4.40±0.1a 2.45±0.45bcde 2.97±0.42bcd 3.12±0.49bc 3.28±0.40ab 1.42±0.24efg 2.20±0.41cdef 1.83±0.43defg 2.95±0.37bcd 2.17±0.48cdef 2.77±0.15bcd 1.58±0.30efg 0.92±0.28g 1.50±0.32efg 1.33±0.10efg 1.40±0.20efg 1.37±0.38efg 1.12±0.20fg 6.42±0.15a 6.67±0.15a 5.27±0.15ab 6.65±0.05a 6.60±0.07a 3.82±0.1bc 3.07±0.14c 4.00±0.07bc 2.83±0.07c 3.12±0.14c 4.53±0.14bc 3.68±0.17bc 1.12±0.03d 1.00±0.00d 1.40±0.07d 0.13±0.05d 0.85±0.00d 1.02±0.00d 25℃1.56±0.25de 2.55±0.26d 4.53±0.24ab 4.18±0.25abc 5.07±0.11a 4.60±0.28ab 4.38±0.32abc 0.97±0.23ef 3.53±0.15c 1.9±0.27de 1.87±0.25de 3.87±0.29bc 1.72±0.20def 0.80±0.28f 0.98±0.19ef 1.22±0.27ef 1.183±0.36ef 1.25±0.23ef 1.35±0.12ef 2.32±0.20c 5.35±0.25ab 7.07±0.21a 4.88±0.21b 4.77±0.14b 4.37±0.17b 1.70±0.12cd 1.83±0.22cd 1.45±0.20cd 1.77±0.20cd 1.72±0.1cd 1.85±0.07cd 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 30℃0.66±0.13cd 2.03±0.21ab 2.72±0.17a 2.77±0.17a 1.83±0.12b 2±0.14ab 1.4±0.14bc 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 2.12±0.17a 1.32±0.12bc 1.38±0.18bc 1.02±0.11cd 1.57±0.17b 1.47±0.18b 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00

由表4可知，鹽脅迫下，實(shí)驗(yàn)組胚軸長(zhǎng)大于對(duì)照組，15～25℃時(shí)經(jīng)不同濃度褪黑素處理后扁莖黃芪胚軸在3種脅迫下長(zhǎng)勢(shì)良好。N1和N2略優(yōu)于N3，但褪黑素各濃度間在15～25℃范圍內(nèi)差異不明顯，30℃時(shí)胚軸長(zhǎng)度隨著褪黑素濃度的增加而減少；15～30℃時(shí)各處理組胚軸長(zhǎng)均大于純水處理組；30℃的胚軸長(zhǎng)在脅迫濃度為N1時(shí)整體趨勢(shì)略大于其他溫度。干旱脅迫下，胚軸在溫度為15℃和30℃、脅迫濃度為P1時(shí)，各處理胚軸整體長(zhǎng)勢(shì)良好，而溫度為20℃和25℃時(shí)，3個(gè)脅迫間差異不明顯。鹽脅迫下，30℃時(shí)N1T1處理的胚軸長(zhǎng)出現(xiàn)最大值(1.42 cm)；干旱脅迫下，15℃時(shí)P1T3處理的胚軸長(zhǎng)達(dá)到最大值(1.28 cm)。綜合來看，扁莖黃芪幼苗胚軸在鹽脅迫下的生長(zhǎng)情況優(yōu)于干旱脅迫。

表4 不同處理下扁莖黃芪幼苗胚軸的變化(±s，n=3) cm

表4 不同處理下扁莖黃芪幼苗胚軸的變化(±s，n=3) cm

脅迫類型空白對(duì)照鹽脅迫鹽脅迫處理CK N1T0 N1T1 N1T2 N1T3 N1T4 N1T5 N2T0 N2T1 N2T2 N2T3 N2T4 N2T5 N3T0 N3T1 N3T2 N3T3 N3T4 N3T5 P1T0 P1T1 P1T2 P1T3 P1T4 P1T5 P2T0 P2T1 P2T2 P2T3 P2T4 P2T5 P3T0 P3T1 P3T2 P3T3 P3T4 P3T5 15℃0.44±0.05abc 0.70±0.09a 0.63±0.11abc 0.68±0.08ab 0.62±0.15abc 0.47±0.12bc 0.55±0.08abc 0.71±0.13a 0.63±0.16abc 0.65±0.18abc 0.68±0.09ab 0.53±0.06abc 0.51±0.07abc 0.63±0.09abc 0.5±0.10abc 0.58±0.10abc 0.43±0.07c 0.54±0.05abc 0.55±0.08abc 1.10±0.12ab 1.15±0.12a 1.23±0.18a 1.28±0.11a 0.98±0.16abc 0.83±0.17bcd 0.34±0.06f 0.51±0.04ef 0.63±0.18def 0.78±0.1cde 0.56±0.08def 0.55±0.13def 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 20℃0.64±0.22d 0.78±0.09abcd 0.75±0.13abcd 0.88±0.09abc 0.97±0.10a 0.82±0.09abc 0.88±0.16abc 0.82±0.15abc 0.95±0.10ab 0.78±0.17abcd 0.8±0.14abc 0.77±0.08abcd 0.88±0.17abc 0.72±0.07bcd 0.75±0.08abcd 0.65±0.05cd 0.83±0.12abc 0.78±0.09abcd 0.71±0.04bcd 0.48±0.04abc 0.58±0.09ab 0.47±0.08abc 0.65±0.10a 0.48±0.09abc 0.58±0.09ab 0.43±0.08abc 0.47±0.08abc 0.38±0.07bcde 0.48±0.04abc 0.4±0.08abcd 0.47±0.10abc 0.30±0.10def 0.40±0.14ef 0.33±0.11def 0.27±0.05f 0.30±0.14ef 0.36±0.11cdef 25℃0.59±0.07d 0.85±0.05abcd 0.82±0.13abcd 0.75±0.10abcd 0.93±0.17abc 0.95±0.08ab 0.88±0.12abc 0.78±0.13abcd 0.95±0.18ab 0.82±0.18abcd 0.97±0.12a 1.02±0.09a 1.00±0.16a 0.60±0.08d 0.67±0.13cd 0.92±0.07abc 0.77±0.12abcd 0.68±0.13bcd 0.78±0.09abcd 0.45±0.08abcd 0.50±0.06abcd 0.52±0.04abc 0.57±0.07ab 0.55±0.04ab 0.53±0.05ab 0.39±0.08cd 0.42±0.07bcd 0.45±0.05bcd 0.52±0.04abc 0.48±0.07abc 0.35±0.05d 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 30℃0.52±0.08d 1.22±0.17ab 1.42±0.17a 1.07±0.18bc 0.93±0.15c 0.96±0.20c 0.81±0.17cd 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.97±0.15a 0.75±0.17cd 0.73±0.12cd 0.67±0.16cd 0.93±0.1bc 0.93±0.16ab 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00

由表5可知，各溫度下經(jīng)過褪黑素處理扁莖黃芪子葉在鹽脅迫的生長(zhǎng)情況優(yōu)于干旱脅迫，且隨著脅迫程度的增加，子葉長(zhǎng)度減小。鹽脅迫下，各處理組子葉長(zhǎng)顯著大于CK(P＜0.05)；15℃時(shí)，各處理的子葉長(zhǎng)度較小；20℃時(shí)，N1T3子葉長(zhǎng)達(dá)到最大值(0.95 cm)。干旱脅迫下，溫度為15～25℃時(shí)，CK的子葉長(zhǎng)顯著大于各處理組(P＜0.05)，而溫度升高到30℃時(shí)，子葉長(zhǎng)度顯著增加，處理組顯著大于CK(P＜0.05)；P1的子葉長(zhǎng)大于P2，顯著大于P3(P＜0.05)。

表5 不同處理下扁莖黃芪幼苗子葉的變化(±s，n=3) cm

表5 不同處理下扁莖黃芪幼苗子葉的變化(±s，n=3) cm

脅迫類型空白對(duì)照鹽脅迫鹽脅迫處理CK N1T0 N1T1 N1T2 N1T3 N1T4 N1T5 N2T0 N2T1 N2T2 N2T3 N2T4 N2T5 N3T0 N3T1 N3T2 N3T3 N3T4 N3T5 P1T0 P1T1 P1T2 P1T3 P1T4 P1T5 P2T0 P2T1 P2T2 P2T3 P2T4 P2T5 P3T0 P3T1 P3T2 P3T3 P3T4 P3T5 15℃0.44±0.01b 0.60±0.08ab 0.64±0.07a 0.49±0.09ab 0.57±0.07ab 0.41±0.08b 0.57±0.06ab 0.64±0.05a 0.65±0.06a 0.56±0.10ab 0.60±0.06a 0.51±0.08ab 0.55±0.10ab 0.58±0.08ab 0.58±0.09ab 0.51±0.03ab 0.41±0.08b 0.50±0.06ab 0.47±0.09ab 0.31±0.01cdef 0.38±0.09bc 0.36±0.04bcde 0.39±0.04ab 0.36±0.047bcd 0.32±0.04cdef 0.29±0.05def 0.25±0.03f 0.30±0.06cdef 0.28±0.02def 0.27±0.04f 0.28±0.04ef 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 20℃0.55±0.02f 0.88±0.11abc 0.77±0.10bcd 0.90±0.00ab 0.95±0.12a 0.87±0.12abc 0.68±0.08def 0.85±0.05abc 0.87±0.08abc 0.83±0.10bcde 0.87±0.05abc 0.82±0.04bcde 0.85±0.08abc 0.70±0.089def 0.73±0.05cde 0.70±0.08def 0.72±0.07def 0.70±0.08def 0.65±0.12ef 0.48±0.04ab 0.50±0.00ab 0.40±0.06bc 0.47±0.08abc 0.47±0.05abc 0.42±0.04bc 0.30±0.08cd 0.42±0.07bc 0.30±0.06cd 0.33±0.05bcd 0.35±0.05bcd 0.37±0.05bcd 0.23±0.05e 0.25±0.07e 0.20±0.00e 0.20±0.00e 0.25±0.07e 0.24±0.05e 25℃0.44±0.10ef 0.72±0.09abc 0.88±0.08a 0.68±0.07bcd 0.70±0.089bcd 0.68±0.09bcd 0.73±0.08ab 0.58±0.04cdef 0.65±0.08bcde 0.62±0.04bcde 0.65±0.05bcde 0.67±0.08bcde 0.58±0.04cdef 0.42±0.09f 0.53±0.05def 0.57±0.05def 0.53±0.05def 0.55±0.08cdef 0.57±0.08cdef 0.36±0.08bcd 0.43±0.08abc 0.43±0.04abc 0.43±0.08abc 0.52±0.04a 0.44±0.04ab 0.26±0.04d 0.3±0.06cd 0.3±0.05cd 0.25±0.05d 0.25±0.08d 0.25±0.08d 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 30℃0.16±0.01c 0.70±0.12a 0.72±0.11a 0.72±0.11a 0.63±0.1ab 0.74±0.05a 0.48±0.09b 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.68±0.11a 0.5±0.10b 0.55±0.10ab 0.48±0.07b 0.550±.11ab 0.55±0.10ab 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00

從表6可以看出，不同的溫度、NaCl、PEG脅迫和褪黑素濃度對(duì)扁莖黃芪的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有不同程度的影響。鹽脅迫下，溫度、NaCl脅迫滲透勢(shì)和褪黑素濃度對(duì)扁莖黃芪的最終發(fā)芽率、平均發(fā)芽時(shí)間、胚根長(zhǎng)和子葉長(zhǎng)有顯著影響(P＜0.05)；干旱脅迫下，溫度和PEG脅迫滲透勢(shì)對(duì)扁莖黃芪的平均發(fā)芽時(shí)間、胚根長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)和子葉長(zhǎng)有極顯著影響(P＜0.01)，而褪黑素濃度對(duì)最終發(fā)芽率和胚根長(zhǎng)有極顯著影響(P＜0.01)。綜上可知，相同溫度下，扁莖黃芪經(jīng)褪黑素處理后，其耐鹽性大于耐旱性，且隨著脅迫程度的增加，其生長(zhǎng)受到抑制，尤其是30℃下脅迫-0.7 MPa，扁莖黃芪的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)嚴(yán)重受到影響，鹽脅迫下種子萌發(fā)后的生長(zhǎng)受到抑制，而干旱脅迫下種子出現(xiàn)未發(fā)芽的情況。

表6 在不同溫度、NaCl和PEG脅迫下褪黑素對(duì)扁莖黃芪生長(zhǎng)發(fā)育的多因素方差分析（F值）

2.3 不同溫度下褪黑素對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫下對(duì)扁莖黃芪幼苗生長(zhǎng)的影響評(píng)價(jià)

2.3.1t值雙序圖分析 為確定溫度、脅迫、褪黑素對(duì)扁莖黃芪種子和幼苗指標(biāo)的具體影響，進(jìn)一步采用t值雙序圖進(jìn)行分析（圖1）。NaCl脅迫下，扁莖黃芪萌發(fā)的各項(xiàng)指標(biāo)都沒有落入褪黑素濃度(MT)的白色或者黑色圓圈內(nèi)。其中，總干重(TDW)和子葉長(zhǎng)(CL)靠近MT的黑色圓圈，說明它們與MT濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明褪黑素濃度的增加將導(dǎo)致這些指標(biāo)一定程度的下降。但MT與總干重和子葉長(zhǎng)并沒有完全落入黑色圓圈內(nèi)，說明它們之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系沒有達(dá)到顯著水平（圖1A）。NaCl脅迫下，外界溫度(T)與最終發(fā)芽率(TGP)、胚軸長(zhǎng)(HL)、子葉長(zhǎng)、總干重成顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖1B）。PEG脅迫下，TGP完全落入MT的白色圓圈內(nèi)，而CL、HL、RL、TDW、MGT靠近MT的白色圓圈，說明MT與最終發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與子葉長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)、總干重和平均發(fā)芽時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系（圖1C）。PEG脅迫下，外界溫度(T)與最終發(fā)芽率、平均發(fā)芽時(shí)間、胚軸長(zhǎng)、子葉長(zhǎng)、總干重呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與胚根長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖1D）。通過以上分析可以看出，外界溫度是鹽和干旱脅迫下扁莖黃芪種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，而褪黑素一定程度上可以緩解鹽和干旱脅迫對(duì)扁莖黃芪造成的影響。

圖1 PEG和NaCl脅迫下褪黑素對(duì)扁莖黃芪種子和幼苗特征影響的檢驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 響應(yīng)面分析 利用Design Expert軟件，以不同實(shí)驗(yàn)溫度、NaCl和PEG脅迫、褪黑素濃度為考察因素，萌發(fā)指標(biāo)（最終發(fā)芽率和平均發(fā)芽時(shí)間）和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)（胚根長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)、子葉長(zhǎng)和總干重）為響應(yīng)值，預(yù)測(cè)溫度、脅迫和褪黑素處理的最佳組合。由圖2可知，隨著溫度的增加，扁莖黃芪種子的最終發(fā)芽率、平均發(fā)芽時(shí)間增加，胚根長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)、子葉長(zhǎng)和總干重先增加后減少；隨著NaCl脅迫滲透勢(shì)的升高，最終發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)、子葉長(zhǎng)和總干重減少，而平均發(fā)芽時(shí)間增加；隨著褪黑素濃度的增加，最終發(fā)芽率、平均發(fā)芽時(shí)間、胚根長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)、子葉長(zhǎng)和總干重先增后減。由圖3可知，PEG脅迫下，最終發(fā)芽率隨溫度的增加而減少、隨脅迫滲透勢(shì)升高而降低，平均發(fā)芽時(shí)間隨著溫度的增加、PEG脅迫滲透勢(shì)的升高和褪黑素濃度的增加而增加，胚根長(zhǎng)、子葉長(zhǎng)、總干重隨著溫度的增加而先升高后降低，胚軸長(zhǎng)隨著溫度的升高而降低。隨著PEG脅迫滲透勢(shì)的增加，最終發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)、子葉長(zhǎng)和總干重均減小。NaCl脅迫下最終發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)、胚軸長(zhǎng)、子葉長(zhǎng)、總干重在20～25℃內(nèi)達(dá)到最大值，平均發(fā)芽時(shí)間在15～20℃時(shí)最短；PEG脅迫下最終發(fā)芽率、胚軸長(zhǎng)、子葉長(zhǎng)在15～20℃內(nèi)達(dá)到最大值，胚根長(zhǎng)、總干重在20～25℃內(nèi)達(dá)到最大值，平均發(fā)芽時(shí)間在25～30℃時(shí)最短。由軟件綜合預(yù)測(cè)，使扁莖黃芪萌發(fā)和生長(zhǎng)的最佳組合分別為：NaCl處理時(shí)，溫度24.72℃、NaCl滲透勢(shì)-0.36 MPa、褪黑素濃度0.41 mmol/L；PEG處理時(shí)，溫度18.38℃、PEG滲透勢(shì)-0.21 MPa、褪黑素濃度0.28 mmol/L。

圖2 不同溫度、NaCl脅迫、褪黑素濃度對(duì)扁莖黃芪生長(zhǎng)影響的響應(yīng)面

圖3 不同溫度、PEG脅迫、褪黑素濃度對(duì)扁莖黃芪生長(zhǎng)影響的響應(yīng)面

3 結(jié)論與討論

種子發(fā)芽和早期幼苗生長(zhǎng)被認(rèn)為是植物形態(tài)建成和生長(zhǎng)最關(guān)鍵的階段。當(dāng)生物體因干旱、低溫、高溫、鹽漬等多種逆境形成水分脅迫，滲透調(diào)節(jié)作用是植物適應(yīng)外界脅迫的重要生理機(jī)制之一。植物體內(nèi)可主動(dòng)積累各種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來提高細(xì)胞液濃度，降低滲透勢(shì)，提高細(xì)胞吸水或保水能力，從而適應(yīng)脅迫環(huán)境[15]。植物長(zhǎng)期處于鹽脅迫條件，可導(dǎo)致其體內(nèi)離子平衡失調(diào)、有毒物質(zhì)積累，最后會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。脅迫條件下植物的發(fā)芽率及外部形態(tài)是受脅迫影響的直接表現(xiàn)，脅迫越大出苗率越低，從而影響后期發(fā)育以及產(chǎn)量[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以明顯改善鹽脅迫對(duì)扁莖黃芪造成的傷害，促進(jìn)其種子萌發(fā)與生長(zhǎng)，所有處理組的種子均發(fā)芽且長(zhǎng)勢(shì)良好，只有在高溫(30℃)時(shí)，發(fā)芽后期種子長(zhǎng)勢(shì)較緩，無法進(jìn)行測(cè)量。而干旱脅迫下，低溫(15～25℃)時(shí)褪黑素促進(jìn)了扁莖黃芪的種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)，在高溫時(shí)某些處理組種子未發(fā)芽。由此說明，扁莖黃芪對(duì)溫度較為敏感，經(jīng)褪黑素處理后在15～25℃時(shí)長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于30℃。溫度是種子萌發(fā)的重要因子，種子萌發(fā)時(shí)的物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化需要酶的催化，而酶在一定的溫度范圍內(nèi)保持其活性，當(dāng)溫度升高時(shí)酶活性可能失活，無法發(fā)揮其作用[17]。此外，相同溫度下，扁莖黃芪經(jīng)褪黑素處理后，隨著脅迫程度的增加，其生長(zhǎng)仍然受到抑制，尤其是當(dāng)干旱滲透勢(shì)達(dá)到-0.7 MPa時(shí)，由于為重度脅迫，部分處理組種子未發(fā)芽。這說明扁莖黃芪耐鹽性大于耐旱性，分析其原因可能是實(shí)驗(yàn)中使用PEG溶液來模擬干旱環(huán)境，PEG為乙醇聚合物，分子量高，無法通過植物細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞，可用于調(diào)節(jié)植物所處環(huán)境的水分滲透壓[18]。而干旱則會(huì)使種子吸水速率減慢，最大吸水量減小，隨著干旱程度的增加，種子萌發(fā)受到抑制或發(fā)芽延遲的程度亦會(huì)隨之增加。所以即使經(jīng)褪黑素處理后，扁莖黃芪種子仍會(huì)出現(xiàn)未萌發(fā)的現(xiàn)象。這說明干旱脅迫對(duì)植物生理反應(yīng)的影響取決于干旱水平和植物的生長(zhǎng)階段，干旱程度越高，植物種子和幼苗的耐受性較低。

鹽漬、干旱、高溫、低溫等脅迫均屬于非生物脅迫，它們通過不同的方式影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)的某一階段受到限制，最終影響到植物生物量的形成。研究表明，外源添加褪黑素可增強(qiáng)某些植物物種的非生物脅迫耐受性。褪黑素處理可提高大豆對(duì)鹽脅迫及干旱脅迫的耐受力[19]。在低溫和干早脅迫下，褪黑素能夠緩解黑麥草的生長(zhǎng)抑制，增強(qiáng)其抗寒和抗旱性[20]。本研究中，扁莖黃芪經(jīng)褪黑素浸種后，其萌發(fā)與生長(zhǎng)在外界脅迫條件下得到了一定的改善。同樣的，在干旱和鹽脅迫條件下褪黑素處理黃瓜種子，能夠提高黃瓜萌發(fā)率，并能夠緩解干旱對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的抑制作用[21-22]。這可能是因?yàn)橥屎谒厥且环N多功能抗氧化劑、一種無受體的有害自由基清除劑，還作為酶促抗氧化防御系統(tǒng)的刺激物，可保護(hù)植物免受氧化損傷[23]。它能夠清除活性氧(ROS)、活性氮(RNS)，可緩解植物對(duì)干旱、高溫、高鹽等脅迫的耐受性[24-25]。

本研究在4個(gè)不同溫度、3個(gè)NaCl脅迫滲透勢(shì)和3個(gè)PEG脅迫滲透勢(shì)、6個(gè)褪黑素濃度的條件下進(jìn)行，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合t值雙序圖與響應(yīng)面分析得出，低溫低鹽脅迫(15～25℃，-0.3、-0.5 MPa)的條件下，褪黑素促進(jìn)了扁莖黃芪種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，而在高溫高鹽脅迫(30℃，-0.7 MPa)時(shí)，種子發(fā)芽后生長(zhǎng)受限制；低溫低干旱脅迫條件下，褪黑素促進(jìn)了扁莖黃芪的種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)，而在高溫高干旱時(shí)某些處理組種子未發(fā)芽。由此可以看出，扁莖黃芪耐低溫不耐高溫，且耐鹽性強(qiáng)于耐旱性。隨著溫度和脅迫程度的升高，褪黑素的緩解作用也受到抑制。但是，對(duì)于褪黑素在溫度、鹽脅迫和干旱脅迫等幾個(gè)因子組成的復(fù)雜環(huán)境條件下的響應(yīng)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。