一種中藥抑菌洗液體外抑菌實(shí)驗(yàn)觀察

鄭春嬋 唐三梅 蔣小麗 鄒銳濤 蔡桂月 何仁亮 譚帥 鄒艷君

1南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院皮膚科，廣州 510091；2簡(jiǎn)陽(yáng)市人民醫(yī)院皮膚科，成都 641403；3南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科，深圳 518000；4深圳君康仁泰生物科技有限公司，深圳 518000

近年來(lái)，中藥抑菌洗劑由于抑菌效果顯著，耐藥性低，安全性高，無(wú)明顯毒副作用而得到臨床推廣［1-3］。澤爾復(fù)皮膚抑菌洗劑是一種復(fù)方中藥制劑，具有清潔、殺菌、止癢等功效，可用于皮膚及黏膜相關(guān)細(xì)菌感染的治療，臨床上廣泛應(yīng)用于皮膚科及婦科瘙癢性、炎癥性疾病的輔助治療。澤爾復(fù)皮膚抑菌洗液對(duì)皮膚刺激性小，臨床應(yīng)用效果較好，但目前對(duì)于該洗劑抑菌效果的研究數(shù)據(jù)較為缺乏，本文以人體皮膚常見(jiàn)致病菌：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌和白色念珠菌為實(shí)驗(yàn)菌，初探此復(fù)方中藥皮膚抑菌洗劑的抑菌效果，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

材料與方法

1、材料

1.1、儀器 生物安全柜（品牌：BLOBASE，型號(hào)：BSC-1500ⅡA2-X）；比 濁 儀（品 牌：梅 里 埃，型 號(hào)：DensiCHEK）；血平板（江門：江門市凱林貿(mào)易有限公司，批號(hào)：190820）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：190710）；沙氏瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：190817）。

1.2、試藥 澤爾復(fù)皮膚抑菌洗劑（深圳君康仁泰生物科技有限公司，批號(hào)：2020101601），其主要成分：黃柏、胡黃連、地膚子、蒼術(shù)、地榆、苦參、馬齒莧等提取物的中成藥液體制劑。

1.3、菌株 大腸桿菌（菌號(hào)：ATCC25922）；金黃色葡萄球菌（菌號(hào)：ATCC25923）；銅綠假單胞菌（菌號(hào)：ATCC27853）；白色念珠菌（菌號(hào)：ATCC64550）。以上菌株均由南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

2、方法

2021年9月至11月于南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院采用平皿稀釋法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1、復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)菌株 將4種標(biāo)準(zhǔn)菌株從液氮罐中取出復(fù)融，加樣器吸出20 μl接種于血平板，培養(yǎng)24 h后，再轉(zhuǎn)種1次，培養(yǎng)24 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2、調(diào)菌懸液 將4種實(shí)驗(yàn)菌株24 h斜面培養(yǎng)物用無(wú)菌PBS（1×，pH 7.1～7.2）洗下，制成菌懸液，吸取0.1 ml菌懸液，加入0.9 ml PBS液，同樣的方法反復(fù)稀釋3次，濃度由2.0 MIC稀 釋 至6×105cfu/ml（細(xì) 菌）或2×104cfu/ml（酵母菌）。

2.3、配制測(cè)試樣液 測(cè)試樣液由筆者自制，選用澤爾復(fù)皮膚抑菌洗液、滅菌生理鹽水、無(wú)菌PBS液，配制為1～4號(hào)測(cè)試樣液（梯度濃度：100.0%、50.0%、25.0%和12.5%），每種測(cè)試樣液配4管（每管5 ml），同時(shí)設(shè)對(duì)照樣液4管（5 ml滅菌生理鹽水）。

2.4、體外抑菌實(shí)驗(yàn) 取上述菌懸液分別在每個(gè)測(cè)試樣液內(nèi)滴加0.1 ml，均勻混合。作用2 min、5 min、10 min、20 min，用無(wú)菌塑料吸管分別吸取0.5 ml測(cè)試樣液加入含2 ml PBS的試管內(nèi)，充分混勻，倍比稀釋1次（0.5 ml+0.5 ml），然后取其中2個(gè)稀釋度，分別吸取50 μl置于血平板，各接種2個(gè)點(diǎn)，用涼至40～45℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、沙氏瓊脂培養(yǎng)基15 ml作傾注，轉(zhuǎn)動(dòng)血平板，使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板，（35±2）℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌48 h，沙氏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)白色念珠菌72 h，作活菌菌落計(jì)數(shù)。同時(shí)以滅菌生理鹽水作為空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5、抑菌率計(jì)算及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［4］抑菌率計(jì)算公式：抑菌率=（對(duì)照樣液平均菌落數(shù)-被試樣液平均菌落數(shù)）/對(duì)照樣液平均菌落數(shù)×100%。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：抑菌率50%～＜90%，產(chǎn)品有抑菌作用；抑菌率≥90%，產(chǎn)品有較強(qiáng)抑菌作用。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0軟件，組內(nèi)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表述，多組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析與相關(guān)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

澤爾復(fù)皮膚抑菌洗劑原液（100.0%）、50.0%、25.0%和12.5%稀釋液作用2 min、5 min、10 min和20 min對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌率均超90%以上，見(jiàn)表1。不同濃度澤爾復(fù)皮膚抑菌洗劑抑菌率效果比對(duì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表2。相關(guān)分析顯示抑菌率與抑菌洗劑濃度呈正相關(guān)，作用2 min、5 min、10 min、20 min皮爾遜（Pearson）相關(guān)系數(shù)分別為0.769、0.789、0.950、0.806（均P＜0.05）。在相同濃度下，抑菌率與菌株種類、作用時(shí)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。表明澤爾復(fù)皮膚抑菌洗劑對(duì)上述4種菌株均有較強(qiáng)的抑菌效果，其抑菌效果與藥液的濃度呈正相關(guān)。

表1 澤爾復(fù)皮膚抑菌洗劑的抑菌效果實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 不同濃度澤爾復(fù)抑菌洗劑的抑菌率效果對(duì)比（±s）

表2 不同濃度澤爾復(fù)抑菌洗劑的抑菌率效果對(duì)比（±s）

時(shí)間2 min 5 min 10 min 20 min不同濃度12.5%0.92±0.010.93±0.010.93±0.010.95±0.0225.0%0.93±0.010.94±0.010.95±0.010.97±0.0150.0%0.95±0.020.96±0.020.97±0.010.98±0.01100.0%0.97±0.020.99±0.031.00±0.001.00±0.00 F值5.9477.03052.9938.912 P值0.0100.006＜0.0010.002

討論

皮膚科的許多瘙癢性及炎癥性疾?。ㄈ鐫裾?、特應(yīng)性皮炎、脂溢性皮炎、癢疹等）常伴有皮膚表面細(xì)菌感染，臨床多采用口服抗組胺藥、外用糖皮質(zhì)激素制劑及保濕劑治療，而這些藥物不能從根本上殺滅皮膚表面細(xì)菌，且長(zhǎng)期口服抗生素容易引起耐藥性。因此，瘙癢性皮膚病容易反復(fù)發(fā)作，患者常搔抓患處，易引發(fā)細(xì)菌定植而加重其瘙癢的臨床癥狀，形成惡性循環(huán)。隨著對(duì)中藥的深入研究，大量研究發(fā)現(xiàn)中藥洗劑特別是復(fù)方中藥洗劑具有良好的清潔、殺菌、止癢能力，可減少皮膚表面致病菌的定植，打破瘙癢反復(fù)發(fā)作的惡性循環(huán)［1，3-5］，可用于慢性皮膚瘙癢性疾病的輔助治療，且長(zhǎng)期外用不容易引起耐藥。

本研究數(shù)據(jù)顯示澤爾復(fù)抑菌洗劑原液（100.0%）、50.0%、25.0%和12.5%對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均有較強(qiáng)的抑菌能力，作用2 min抑菌率即可達(dá)到90%以上，具有較強(qiáng)的抑菌效果。且隨著濃度的增加，抑菌效果也增強(qiáng)，抑菌效果與菌株種類、作用時(shí)間沒(méi)有顯著相關(guān)性，說(shuō)明澤爾復(fù)抑菌洗劑具有實(shí)際體外抗菌應(yīng)用價(jià)值，適用于皮膚及黏膜一般細(xì)菌感染性疾病的治療?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，我國(guó)的傳統(tǒng)藥物中藥富含多種活性成分，副作用少，安全性高，部分中藥還具有抑菌、抗炎、抗角化等作用［6］。本實(shí)驗(yàn)所用的澤爾復(fù)皮膚抑菌洗劑為復(fù)方中藥洗劑，其主要成分為黃柏提取物4.5%，胡黃連提取物4.5%，地膚子提取物4.5%，蒼術(shù)提取物3.5%，地榆提取物3.5%及苦參提取物2.5%等中藥。方中的黃柏可以抑制金黃色葡萄球菌、表皮癬菌感染甚至其他因素引起的炎性反應(yīng)［5，7］。研究發(fā)現(xiàn)黃柏復(fù)合洗劑有利于提高血清生長(zhǎng)因子濃度和促進(jìn)毛細(xì)血管生成，具有促進(jìn)潰瘍愈合的作用［8］。胡黃連提取物的主要化學(xué)成份為環(huán)烯醚萜苷、苯乙醇苷、酚苷、葫蘆烷型三萜、黃酮、芳香酸，有一定的抗菌活性，其抑菌作用良好［9-10］。地膚子提物對(duì)一些皮膚真菌有一定抑制作用，實(shí)驗(yàn)表明地膚子甲醇萃取液可降低病菌體內(nèi)的酶活性［11］。蒼術(shù)具有抗病原微生物、抗炎、抗肺損傷等藥理作用，能祛濕、殺菌，可用于濕疹、風(fēng)疹、皮膚瘙癢等癥，臨床療效較好［12-13］。地榆具有抑制多種致病微生物、修復(fù)皮膚的作用，可治療燒灼傷、濕疹、結(jié)核性膿瘍等疾病。實(shí)驗(yàn)證實(shí)地榆鞣質(zhì)可增加多種革蘭陽(yáng)性菌如金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的滲透性，同時(shí)改變細(xì)胞形態(tài)，而地榆鞣質(zhì)的其他抗菌機(jī)制（如抑制某種酶的活性或蛋白質(zhì)合成等）還需要進(jìn)一步研究，因此地榆可以作為一種潛在的抑菌劑［14］?？鄥⒌囊志钚砸延卸囗?xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其生物堿為其主要抑菌作用活性物質(zhì)，對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌及皮膚癬菌均有較強(qiáng)的抑制作用［12，15-16］。有研究表明苦參提取物通過(guò)多組分、多靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎作用，是一種主要用于治療由感染引起的各種炎癥性疾病的中藥［17］。因此，苦參及其制劑，如苦參洗劑、苦參注射液，在臨床廣用作于治療炎癥相關(guān)疾病的輔助治療［18］。程洪杰等［19］研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可以有效抑制白色念珠菌細(xì)胞膜成分麥角固醇的合成，黃柏中小檗堿可引起白色念珠菌分裂周期異常而出現(xiàn)遺傳物質(zhì)丟失，兩者對(duì)白色念珠菌均具有較強(qiáng)的抑制作用。澤爾復(fù)抑菌洗劑由上述中藥通過(guò)現(xiàn)代工藝加工而成，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其組方的藥物所含活性成份可有效去除皮膚表層的細(xì)菌，減少感染的機(jī)會(huì)，起到清潔皮膚，減輕患處瘙癢和不適癥狀的作用，值得進(jìn)一步進(jìn)行綜合性應(yīng)用研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明鄭春嬋：撰寫論文；唐三梅：研究設(shè)計(jì)；蔣小麗：參與實(shí)驗(yàn)；鄒銳濤：收集數(shù)據(jù)；蔡桂月：分析數(shù)據(jù)；何仁亮：指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)及論文修改；譚帥：論文格式排版；鄒艷君：提供實(shí)驗(yàn)試劑抑菌洗液