甘草酸二胺對CRP/TGF-β介導的慢性肝炎性纖維化的作用研究

黃小區(qū) 蘇美霞 楊世春 蔡杰 潘潔婷

1湛江中心人民醫(yī)院藥學部藥庫，湛江 524000；2湛江中心人民醫(yī)院藥學部臨床藥學，湛江 524000；3湛江中心人民醫(yī)院藥學部西藥房，湛江 524000；4湛江中心人民醫(yī)院藥學部，湛江 524000

慢性肝炎性纖維化是因不同慢性疾病所致肝臟持續(xù)受損而造成的肝臟中纖維結(jié)締組織異常增生，而肝細胞外基質(zhì)大量積滯是誘發(fā)肝纖維的主要病理機制；隨纖維化進展，易出現(xiàn)肝硬化、肝衰竭，嚴重者甚至肝癌，因此抗肝炎性纖維化治療對控制患者病情發(fā)展或逆轉(zhuǎn)病理過程具有重要意義［1-2］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，C反應蛋白（C reactive protein，CRP）主要在肝臟中表達，作為炎性標志物參與大量慢性疾病的發(fā)生進展，激活補體加快機體炎癥變化，而炎癥在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮至關重要的作用［3-4］。高炎癥表達所誘導的肝纖維化與肝星形細胞激活密切，而轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）參與調(diào)控纖維化發(fā)展，與細胞膜結(jié)合作用后刺激細胞中因子從而加快膠原代謝，促進纖維化發(fā)生［5-6］。有研究報道，具有抗炎癥及纖維化作用的藥物對CRP/TGF-β活化具有抑制作用［7-8］。

甘草酸二胺為主的甘草酸劑是臨床廣泛應用的抗炎保肝藥物，其主要成分為甘草［9］。臨床已報道，其對多種肝毒劑與復合致病因子導致的肝臟損傷具有治療作用，對肝細胞膜具有一定的保護作用［10］。但該藥的作用機制不明，是否通過介導CRP/TGF-β緩解纖維化未見報道，基于此，本研究旨在探討甘草酸二胺對CRP/TGF-β介導的慢性肝炎性纖維化的作用。

材料與方法

1、實驗動物

選取SPF級SD大鼠50只，8周齡，體質(zhì)量（200±20）g/只，許可證號：SCXK（粵）2021-009。適應環(huán)境7 d后開始實驗。分為對照組、模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只。

2、試劑與儀器

甘草酸二胺［華潤雙鶴利民藥業(yè)（濟南）有限公司］、刀豆蛋白A（上海信乎生物科技有限公司）、CRP酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、層粘連蛋白（LN）ELISA試劑盒、透明質(zhì)酸（HA）ELISA試劑盒、Ⅰ型膠原蛋白（PCⅠ）ELISA試劑盒、PCⅢELISA試劑盒、蘇木精-伊紅（HE）染色液均購自麒盟（上海）生物醫(yī)學有限公司、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測試劑盒、RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒均自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易、CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ一抗、二抗均購自北京百奧萊博科技有限公司。低溫高速離心機（KS50R，湖南凱達科學儀器有限公司）、微型垂直電泳槽（VE-180，上海天能科技有限公司）、酶標儀（SuPerMax 3100，上海閃譜生物有限公司）。

3、造模與給藥

模型組、高劑量組、中劑量組及低劑量組大鼠進行肝纖維化造模，給予12.5 mg/kg劑量的刀豆蛋白A磷酸緩沖鹽溶液300 μl經(jīng)大鼠尾靜脈注射，每周1次，注射4周。造模完成后，從模型組中隨機抽取1只大鼠處死，參考《病毒性肝炎防治方案》［11］中肝纖維化分期來評估大鼠是否造模成功，如大鼠肝組織中見2期以上肝纖維化，則表明造模成功。造模成功后高劑量組給予甘草酸二胺60 mg/kg、中劑量組給予甘草酸二胺40 mg/kg、低劑量組給予甘草酸二胺20 mg/kg（上述劑量采用體表面積換算后相當于2.0倍、1.0倍及0.5倍臨床用藥劑量），在造模的同時每天進行藥物灌胃治療1次，而對照組與模型組給予等量生理鹽水灌胃，總共4周。

4、標本采集

在4周末最后1次灌胃結(jié)束后，對大鼠禁食12 h后采取腹主動脈血，分離獲取上層血清保存于-20℃中備用；取肝左葉組織，一部分制成勻漿待檢，一部分用10%甲醛溶液固定待檢。

5、大鼠肝組織病理形態(tài)學觀察

取部分待檢肝組織進行石蠟包埋后切片（4 μm大?。?，采取HE染色，并在光學顯微鏡下觀察肝病理組織形態(tài)改變，拍照記錄。

6、血清CRP、ALT、AST及纖維化相關指標檢測

采用ELISA試劑盒檢測CRP；用試劑盒檢測ALT、AST水平及纖維化相關指標（HA、LN、PCⅠ、PCⅢ）含量，參考試劑盒說明書進行基本操作。

7、PCR檢測肝組織CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA表達情況

取部分待檢肝組織，采用RNA提取試劑盒進行RNA提取，然后cDNA第一鏈合成試劑盒配置反轉(zhuǎn)錄體系轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PCR試劑盒配置PCR反應體系，對CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ、β肌動蛋白基因（β-actin）cDNA進 行PCR反 應，以β-actin為 內(nèi)參，按 照 公式2-△△ct計算CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA表達量。

8、Western blot法檢測肝組織CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ蛋白表達情況

取部分待檢肝組織，將組織中蛋白采用RIPA裂解液進行提取，應用BCA法檢測當中的蛋白總量，同時取30 μg蛋白與上樣緩沖液充分混合后，在高溫環(huán)境下變性同時對蛋白行電泳分離，把蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜中，給予5%脫脂牛奶在常規(guī)室內(nèi)溫度下在PVDF膜下封閉1 h，將CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ一抗按照1∶1000進行稀釋，并在4℃PVDF膜過夜，次日1∶2000稀釋二抗室溫孵育PVDF膜1 h，最后在凝膠成像儀中讀取蛋白條，按照蛋白條吸光值，以β-actin為內(nèi)參，計算CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ蛋白表達。

9、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件錄入數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

結(jié)果

1、甘草酸二胺對肝纖維化模型大鼠肝組織病理形態(tài)學的影響

對照組大鼠肝纖維化結(jié)構(gòu)正常，肝索整齊排列；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維組織伴增生結(jié)構(gòu)，已出現(xiàn)少數(shù)假小葉；低劑量組、中劑量組及高劑量組隨藥物劑量增加，肝組織損傷較模型組顯著減輕。見圖1。

圖1 甘草酸二胺對肝纖維化模型大鼠肝組織病理形態(tài)學的影響（HE×200）。對照組（A）與模型組（B）給予等量生理鹽水灌胃，低劑量組（C）采用甘草酸二胺20 mg/kg灌胃，中劑量組（D）采用甘草酸二胺40 mg/kg灌胃，高劑量組（E）采用甘草酸二胺60 mg/kg灌胃

2、甘草酸二胺對血清CRP、ALT、AST水平的影響

與對照組相比，模型組CRP、ALT、AST水平均顯著升高（均P＜0.05）；與模型組比較，隨劑量增加低劑量組、中劑量組、高劑量組CRP、ALT、AST明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 甘草酸二胺對大鼠血清CRP、ALT、AST水平的影響（±s）

表1 甘草酸二胺對大鼠血清CRP、ALT、AST水平的影響（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與高劑量組比較，dP＜0.05；高劑量組采用甘草酸二胺60 mg/kg灌胃，中劑量組采用甘草酸二胺40 mg/kg灌胃，低劑量組采用甘草酸二胺20 mg/kg灌胃，對照組與模型組給予等量生理鹽水灌胃；CRP為C反應蛋白，ALT為谷丙轉(zhuǎn)氨酶，AST為谷草轉(zhuǎn)氨酶

組別對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組F值P值n 1010 1010 10 CRP（mg/L）7.34±1.19121.98±1.37a 87.20±1.29b 53.19±1.23bcd 18.29±1.20bc 99.077＜0.001 ALT（U/L）48.32±16.92169.31±20.31a 112.87±19.28b 87.29±18.78bcd 57.92±17.38bc 68.502＜0.001 AST（U/L）29.28±18.12163.08±25.97a 139.98±23.09b 102.35±21.34bcd 78.98±19.87bc 57.565＜0.001

3、甘草酸二胺對肝纖維化相關指標的影響

與對照組相比，模型組HA、LN、PCⅠ、PCⅢ水平均顯著升高（均P＜0.05）；與模型組比較，隨劑量增加低劑量組、中劑量組、高劑量組HA、LN、PCⅠ、PCⅢ水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 甘草酸二胺對大鼠肝纖維化相關指標的影響（±s）

表2 甘草酸二胺對大鼠肝纖維化相關指標的影響（±s）

注：高劑量組采用甘草酸二胺60 mg/kg灌胃，中劑量組采用甘草酸二胺40 mg/kg灌胃，低劑量組采用甘草酸二胺20 mg/kg灌胃，對照組與模型組給予等量生理鹽水灌胃。HA為透明質(zhì)酸，LN為層粘連蛋白，PCⅠ為Ⅰ型膠原蛋白；PCⅢ為Ⅲ型膠原蛋白。與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與高劑量組比較，dP＜0.05

組別對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組F值P值n 1010 1010 10 HA（mg/L）7.98±1.2317.39±1.39a 14.27±1.28b 10.31±1.27bcd 8.38±1.25bc 99.539＜0.001 LN（μg/L）73.20±11.08119.34±14.98a 102.47±13.37b 82.37±12.84bcd 78.39±12.06bc 22.196＜0.001 PCⅠ（μg/L）8.09±1.5727.46±2.05a 22.98±1.82b 16.62±1.72bcd 10.35±1.68bc 213.251＜0.001 PCⅢ（μg/L）9.07±1.6929.91±2.17a 23.23±1.79b 17.45±1.78bcd 12.57±1.72bc 205.478＜0.001

4、甘草酸二胺對CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA表達的影響

與對照組相比，模型組CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA均顯著升高（均P＜0.05）；與模型組比較，隨劑量增加，低劑量組、中劑量組、高劑量組CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 甘草酸二胺對大鼠CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA表達的影響

5、甘草酸二胺對CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ蛋白均顯著升高（均P＜0.05）；與模型組比較，隨劑量增加，低劑量組、中劑量組、高劑量組CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ蛋白明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表4、圖2。

圖2 甘草酸二胺對大鼠CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ蛋白的電泳圖

表4 甘草酸二胺對大鼠CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ蛋白表達的影響

討論

慢性肝炎性纖維化是由于慢性、持續(xù)的細胞外基質(zhì)損傷，部分纖維化形成瘢痕組織代替肝實質(zhì)而出現(xiàn)無法逆轉(zhuǎn)的肝纖維化，進一步發(fā)展為肝硬化、肝衰竭甚至肝癌［11-13］。在機體持續(xù)炎癥及應激狀態(tài)下，肝星狀細胞從靜息狀態(tài)被激活，成為肌成纖維細胞具有可復制性，同時可刺激大量細胞外基質(zhì)，如纖維連接蛋白與細胞因子，如TGF-β產(chǎn)生；控制炎癥及細胞外基質(zhì)產(chǎn)生是減輕對肝星狀細胞刺激，可能是緩解肝纖維化的重要通路［15-17］。

甘草酸二胺主要成分為甘草，而甘草酸中皂苷類成分豐富；目前已有臨床發(fā)現(xiàn)甘草酸可抵御炎癥、抗病毒、抗肺部纖維化及提高免疫功能等效果［18-20］。故本研究旨在探討甘草酸二胺對慢性肝炎性纖維化的應用效果及介導的分子靶向機制。本實驗中發(fā)現(xiàn)，隨甘草酸二胺劑量增加，大鼠肝臟纖維化病理顯著改變，提示甘草酸二胺可改善大鼠肝纖維化，而與黃坤等［21］學者報道甘草酸二胺對大鼠肺纖維化有協(xié)同作用結(jié)論相符。肝纖維化發(fā)展時，CRP異常刺激補體系統(tǒng)加快炎癥進展，使肝細胞損傷大量分泌ALT、AST；在膠原代謝異常時，纖維結(jié)締組織中出現(xiàn)大量增生，刺激HA、LN、PCⅠ、PCⅢ合成與釋放［22-23］。本結(jié)果中觀察到，與對照組相比，模型組CRP、ALT、AST、HA、LN、PCⅠ、PCⅢ水平均顯著升高（均P＜0.05）；與模型組比較，隨劑量增加低劑量組、中劑量組、高劑量組CRP、ALT、AST、HA、LN、PCⅠ、PCⅢ水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），提示甘草酸二胺可緩解肝損傷，使肝纖維化程度減輕，與HE染色觀察到的肝組織病理改變相符。

TGF-β異常表達可介導肝纖維化進展，可靶向作用下游Smad2/Smad3通路刺激肝星狀細胞，誘導下游蛋白酶與抑制物表達變化并加快肝纖維化發(fā)生［24-27］。臨床發(fā)現(xiàn)，甘草酸二胺可抑制TGF-β的調(diào)控過程而改善腹膜纖維化進展［28-29］。本結(jié)果觀察到：與對照組相比，模型組CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA及蛋白表達均顯著升高（均P＜0.05）；與模型組比較，隨劑量增加低劑量組、中劑量組、高劑量組CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA及蛋白表達量顯著降低（均P＜0.05），表明肝纖維化大鼠肝臟伴高炎癥狀態(tài)且TGF-β通路被激活，而給予甘草酸二胺可抑制CRP、TGF-β通路，下調(diào)LN、PCⅠ、PCⅢ等蛋白的表達，進一步改善大鼠肝纖維化。

綜上所述，本研究驗證在慢性肝炎纖維化發(fā)展過程中，肝臟組織及血清處于高炎癥狀態(tài)且TGF-β活化，而隨著甘草酸二胺劑量增加，CRP、TGF-β表達逐漸降低，且可能是通過調(diào)控CRP、TGF-β發(fā)揮抗炎癥作用與控制細胞外基質(zhì)分泌。初步揭示了CRP、TGF-β在慢性肝炎性纖維化發(fā)展中的作用，為該疾病預防及治療提供新的靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突