間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)MPTP誘導(dǎo)急性帕金森小鼠模型的治療作用

帕金森病(Parkinson's disease, PD)是中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。其主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性變性丟失，紋狀體區(qū)多巴胺含量減少,以及殘存的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)形成以突觸共核蛋白(α-Synuclein, α-Syn)為主要成分的嗜酸性包涵體—路易小體(Lewy body, LB)。

帕金森疾病的治療目前仍無顯著有效的藥物，干細(xì)胞治療是諸多方法中很有前景的一種，尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)。間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多功能性細(xì)胞，表現(xiàn)出低免疫原性，具有多向分化的同時(shí)，還具有免疫調(diào)節(jié)的生物學(xué)潛能，可以離體擴(kuò)大培養(yǎng)

，根據(jù)文獻(xiàn)，其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病有一定的治療作用

?，F(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)，MSC的治療作用主要來源于間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌作用產(chǎn)生的外泌體(exosomes，Exo)和可溶性因子，其中外泌體中含有microRNA、蛋白質(zhì)在內(nèi)的多種物質(zhì)，可以發(fā)揮靶向調(diào)節(jié)作用

，其能夠通過血腦屏障

，在治療神經(jīng)疾病方面更有優(yōu)勢(shì)。文獻(xiàn)顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(mesenchymal stem cells-derived exosomes, MSC-Exo)能夠到達(dá)黑質(zhì)，顯著抑制6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)誘導(dǎo)的PD大鼠疾病模型

，能夠抑制PD小鼠模型的氧化應(yīng)激

。本文探討通過尾靜脈注射MSC-Exo對(duì)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine, MPTP)誘導(dǎo)的急性帕金森小鼠模型的治療作用，從神經(jīng)元損失到炎性變化以及氧化應(yīng)激等多方面觀察效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 從西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買8～12周的C57BL/6小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，期間自由飲食飲水，12h∶12h晝夜環(huán)境。

1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的提取鑒定 取小鼠皮下脂肪，剪碎后，用0.1%膠原酶Ⅰ 37℃消化40min，然后 200目濾網(wǎng)過濾后，1000rpm，5min離心，培養(yǎng)液懸浮后，接種培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液為改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)+10%優(yōu)級(jí)胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)

。培養(yǎng)至4到6代時(shí)，在細(xì)胞長(zhǎng)至融合后，更換為無血清DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集上清提取外泌體。首先以300g，10min離心去除細(xì)胞以及碎片等，然后取上清2000g，10min離心去除較小的細(xì)胞碎片，接著以10000g，30min離心清除凋亡體，最后100000g，70min超速離心沉淀外泌體，所有離心步驟均為4℃處理，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)重懸外泌體后-80℃保存。采用BCA(bicinchoninic acid)法對(duì)外泌體進(jìn)行定量，免疫印跡法檢測(cè)外泌體標(biāo)志分子CD63 (1∶1000, Abcam, California, USA)和CD81 (1∶1000, Abcam, California, USA)的表達(dá)。

1.3 MPTP誘導(dǎo)小鼠帕金森模型 將45只小鼠分為3組，分別為Sham組、PD組和PD+MSC-Exo組，每組15只，Sham組在造模時(shí)給予生理鹽水，PD組腹腔注射MPTP誘導(dǎo)急性PD模型，PD+MSC-Exo組在PD造模后尾靜脈注射給予MSC-Exo。用MPTP(M2690, Tokyo Chemical IndustryTCI，日本)誘導(dǎo)小鼠急性帕金森模型，MPTP用生理鹽水溶解，配成2mg/ml試劑，小鼠連續(xù)腹腔注射4次MPTP，間隔2h，每次按照20mg/kg給藥，總劑量是80mg/kg

。2h后，尾靜脈給予MSC-Exo，每只50ug/150ul

。在第4天，14天，30天時(shí)取材。

自從有了小弟，我們家增添了許多歡聲笑語。我喜歡給他喂飯，看他一口接一口香香地吃著，心里美滋滋的。我喜歡和他一起洗澡，看他笨手笨腳去爬海洋球的池子，可愛極了！我喜歡和他一起玩滑滑梯，看他從滑梯上滑下來那股高興勁兒，我比他還要開心！也不知道為什么會(huì)這樣，大概跟他在一起時(shí)，我也覺得自己變小了、可以無憂無慮了吧。

本文實(shí)驗(yàn)中用MPTP成功誘發(fā)急性帕金森模型，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠給予MPTP連續(xù)4次后(2h一次，每次20mg/kg)，小鼠的神經(jīng)元顯著減少，TH表達(dá)降低，給阿樸嗎啡后，PD小鼠的轉(zhuǎn)圈數(shù)達(dá)到200多以上，出現(xiàn)典型的帕金森癥狀，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，PD小鼠給予MSC-Exo后癥狀顯著緩解，轉(zhuǎn)圈數(shù)相比PD組顯著下降，并且神經(jīng)元損失減少，TH的表達(dá)量也明顯上升，表明MSC-Exo對(duì)帕金森的治療具有顯著作用，能夠保護(hù)神經(jīng)元，改善行為學(xué)特性。另外，我們還發(fā)現(xiàn)PD小鼠紋狀體的炎癥因子TNFα、IL-1β和氧化應(yīng)激分子Nrf2、Keap1的表達(dá)顯著高于Sham組，給予MSC-Exo后小鼠的這些因子表達(dá)顯著下降。我們的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致，有臨床試驗(yàn)用自體脂肪MSC治療帕金森病人，發(fā)現(xiàn)對(duì)運(yùn)動(dòng)障礙有一定的治療效果

，給PD大鼠移植MSC同樣能夠顯著減少轉(zhuǎn)圈數(shù)，增加TH的表達(dá)

，關(guān)于MSC-Exo對(duì)PD治療效果的研究目前較少，Chen等

發(fā)現(xiàn)Exos在體內(nèi)通過血腦屏障到達(dá)黑質(zhì)，能夠緩解PD小鼠中阿樸嗎啡誘導(dǎo)的不對(duì)稱旋轉(zhuǎn)，減少黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失和凋亡，并上調(diào)紋狀體多巴胺水平，Ma等

發(fā)現(xiàn)在PD小鼠中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的Exo通過攜帶miR-181a-2-3p減輕多巴胺神經(jīng)元的凋亡，并通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Oxidase 4, NOX4)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通過抑制氧化應(yīng)激。表明在帕金森疾病狀態(tài)下，整個(gè)紋狀體腦區(qū)的細(xì)胞都處于炎癥和應(yīng)激狀態(tài)，MSC-Exo通過整體調(diào)控這種失控狀態(tài)而達(dá)到治療作用，但是具體的作用分子有待進(jìn)一步研究，后續(xù)研究中會(huì)用組學(xué)等方法確定MSC-Exo的具體作用物質(zhì)，以及它的靶向分子，為MSC-Exo治療帕金森提供更為具體的證據(jù)。

2 結(jié)果

2.3 免疫印跡結(jié)果 在第4天，PD組小鼠紋狀體的TH蛋白表達(dá)相比于Sham組顯著降低(

<0.05)，而與PD組相比，PD+MSC-Exo組的TH表達(dá)量上升(

<0.05)，見表2，圖2。PD組小鼠在第4天時(shí)，腦組織的炎癥因子TNFα和IL-1β表達(dá)顯著高于Sham組(

<0.01)，而PD+MSC-Exo組的這兩種炎癥因子的表達(dá)明顯低于PD組(

<0.01)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，第4天時(shí)，氧化應(yīng)激通路分子Nrf2和Keap1相較于Sham組在PD組高表達(dá)(

<0.01)，而與PD組相比在PD+MSC-Exo組顯著下調(diào)(

<0.01)。見表3，圖3。

由于陽極銅飛邊毛刺多、幾何尺寸誤差偏大，蒸汽供應(yīng)不穩(wěn)定，陰極銅外觀質(zhì)量不佳，表面粒子較多，直到10月份，外觀質(zhì)量得到穩(wěn)定。投產(chǎn)以來，陽極板平均銅含量達(dá)到99.6%，加之新液生產(chǎn)，電解液雜質(zhì)含量低，陰極銅成分均達(dá)到高純銅標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)5批陰極銅成分見表2。

2.1 小鼠行為學(xué)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，連續(xù)4次(間隔2h)給MPTP后，成功誘發(fā)小鼠急性帕金森模型，行為學(xué)癥狀明顯，在第4、14、30天，給予阿撲嗎啡后，PD+MSC-Exo組和PD組小鼠的轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著高于Sham組(

<0.01)，PD+MSC-Exo組小鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯低于PD組(

<0.01)。見表1。

3 討論

MSC因其具有自我復(fù)制、多向分化、免疫調(diào)控、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等生物學(xué)特性，目前已成為基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)應(yīng)用最為廣泛的干細(xì)胞之一，其來源的外泌體能夠穿透血腦屏障，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療以及靶向載藥中有巨大的潛在價(jià)值。MPTP具有多巴胺神經(jīng)毒性，進(jìn)入腦部后，能夠進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)末梢和胞體，破壞黑體多巴胺能神經(jīng)元，導(dǎo)致紋狀體神經(jīng)末梢、多巴胺地址的大量減少，最后產(chǎn)生神經(jīng)毒性，誘發(fā)帕金森疾病

。MSC衍生外泌體成分可對(duì)抗神經(jīng)炎癥，增強(qiáng)抗氧化能力和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)

，因此MSC-Exo應(yīng)該對(duì)帕金森也有良好的治療效果。

2.2 尼氏染色結(jié)果 在第30天尼氏染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，PD組小鼠的陽性染色顯著減少，神經(jīng)元損失嚴(yán)重，而與PD組相比，PD+MSC-Exo組的神經(jīng)元損失減少，數(shù)量增多，見圖1。

1.4 評(píng)定指標(biāo) ①旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)：在第4、14和30天，進(jìn)行阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，每組10只，以評(píng)估受損紋狀體的超敏反應(yīng)。小鼠皮下注射阿撲嗎啡(0.05 mg/kg)后，放到旋轉(zhuǎn)儀中，觀察旋轉(zhuǎn)情況，同時(shí)使用視頻跟蹤系統(tǒng)測(cè)量30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)。②尼氏染色：在第30天用4%多聚甲醛全身灌注固定后，取大腦進(jìn)行石蠟包埋，每組5只，切片到紋狀體，依次過二甲苯、無水乙醇、95%酒精、80%酒精、70%酒精和蒸餾水，然后1%焦油紫染色30min，蒸餾水清洗，70%酒精分色數(shù)秒至數(shù)分鐘，依次經(jīng)70%酒精、80%酒精、95%酒精，各2min脫水，無水乙醇2次，每次5min，二甲苯2次，每次10min，DPX封片。顯微鏡下觀察拍片分析。③免疫印跡：取第4天的紋狀體，每組5只，RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液超聲(50w，5min)提取蛋白，12000rpm，10min，4℃離心，取上清液，BCA法進(jìn)行定量。進(jìn)行SDS-PAGE，每孔蛋白30ug，80V 30min，120V 1h；然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，300 mA恒定電流，120 min將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)(Millipore,MA,USA)膜；室溫下將膜在封閉液中封閉2 h，然后一抗孵育過夜核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2) (1∶1000)、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(kelch-likeECH-associated protein 1, Keap1) (1∶1000)、酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase , TH)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNFα)、白介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)，三羥甲基氨基甲烷緩沖液(tris buffered saline with tween, TBST)洗滌后，室溫下孵育二抗2 h，TBST 洗滌3次。加上發(fā)光液后使用Bio-Rad成像系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules, California, USA)顯示條帶，Image Lab軟件分析灰度值。

唐五代時(shí)期，“過”用于非位移動(dòng)詞后的情況開始出現(xiàn)，如：例(12)，且“過”在這些例子中不再表示動(dòng)作行為的趨向，其語義已經(jīng)虛化，在這些例子中“過”表示動(dòng)作行為的完成和結(jié)束，即“過1”，至此動(dòng)態(tài)助詞“過1”產(chǎn)生，用例不是很多。但是唐五代“過”作趨向補(bǔ)語的用例特別的多，比魏晉時(shí)期增多，如：例(11)等。

類似地，MSC-Exo對(duì)癲癇小鼠也具有治療作用，能夠提高其認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶能力，降低炎癥

，能夠改善阿爾茨海默病小鼠的認(rèn)知損傷，減少海馬神經(jīng)元丟失，抑制海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激

，減輕小鼠缺血后的神經(jīng)功能缺損、梗死體積、腦水腫和神經(jīng)元損傷，降低中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，具有神經(jīng)保護(hù)作用

。表明MSC-Exo確具有免疫調(diào)控和神經(jīng)保護(hù)作用，在治療帕金森疾病方面具有巨大的應(yīng)用潛力。

許多研究者采用菜薹的帶柄子葉、原生質(zhì)體、游離小孢子等進(jìn)行培養(yǎng)，均取得了一定的成果[2-4]。張鵬等[5]研究認(rèn)為菜薹以子葉-子葉柄為外植體，不定芽誘導(dǎo)率最高。而何曉明等[6]則認(rèn)為菜薹再生能力在不同品種間差異很大，Zhang等[7]指出大白菜的基因型對(duì)它的再生能力影響極大，雖然一些菜薹品種已經(jīng)可以進(jìn)行再生，但是由于材料的專一性強(qiáng)，許多未研究過的品種在基因工程技術(shù)方面的應(yīng)用還是會(huì)受到限制。因此，筆者以未報(bào)道的紅菜薹為研究對(duì)象，以帶柄的子葉為外植體，探討TDZ、NAA等不同激素濃度對(duì)再生體系的影響，旨在為其在生物技術(shù)育種層面上的研究奠定基礎(chǔ)。

在MPTP誘發(fā)的急性帕金森小鼠模型中，給予MSC-Exo后，神經(jīng)元的損失減少、TH表達(dá)上升，炎癥因子和氧化因子分子的表達(dá)也趨于正常，顯示MSC-Exo在治療帕金森以及其他神經(jīng)疾病方面具有廣泛的潛力。

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