洗脫劑極性對沉積物長鏈烯酮硅膠柱層析效果的影響

陳國生，孔德明,2,3，邱梓惠，馮偉家，楊嘉雯

（1.廣東海洋大學(xué)海洋與氣象學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.陸架及深遠海氣候、資源與環(huán)境廣東省高等學(xué)校重點實驗室，廣東 湛江 524088；3.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518108）

長鏈烯酮是一類產(chǎn)生于顆石藻的生物標(biāo)志物，其碳數(shù)在37～39 并含有2～3 個碳碳雙鍵[1-2]。其中，研究最多的是碳數(shù)為37（C37）的長鏈烯酮，其不飽和度指標(biāo)=C37:2/ (C37:3+C37:2)被作為一種重建古海表溫度（SST）的指標(biāo)[3-4]。用于計算的C37:3和C37:2烯酮分子差異僅在于烴鏈上的一個碳碳雙鍵，其分子性質(zhì)穩(wěn)定且差異很小，在海洋環(huán)境中遷移、埋藏過程中不容易發(fā)生差異化降解，因此被廣泛應(yīng)用于SST重建[5-8]。

為準(zhǔn)確測定長鏈烯酮分子含量，需從沉積物提取有機質(zhì)并進行硅膠柱層析，以得到雜質(zhì)較少的含烯酮組分。目前不同實驗室對柱層析的洗脫劑的選擇有所差異。白亞之等[9]和李松等[10]使用的洗脫劑正己烷（H）和二氯甲烷（D）體積比分別為1∶2和1∶1以得到含烯酮組分；張靜靜等[11]使用VH∶VD=2∶8 的洗脫劑分離南海表層沉積物的長鏈烯酮；Kong等[12]則使用純D 作洗脫劑分離長鏈烯酮。柱層析過程可能對烯酮含量準(zhǔn)確測定產(chǎn)生影響的有2個主要因素，一是烯酮能否被完全洗脫，二是否有雜質(zhì)分子干擾烯酮分子色譜峰。如果洗脫劑的極性過小，會導(dǎo)致烯酮不能被完全洗脫；而過大則會引入諸如酯類或醚類分子干擾烯酮色譜峰，均可能增加重建SST 的誤差。因此，有必要研究不同極性洗脫劑對C37和C38烯酮分子的分離效果，評估不完全洗脫對的影響，并探尋適宜配比的洗脫劑以保證長鏈烯酮可被恰好完全洗脫。本研究以不同比例H和D混合組成洗脫劑，分析其對C37和C38烯酮的硅膠柱層析分離效果，探討長鏈烯酮分子間的極性差異和不完全洗脫對指標(biāo)的影響，以期得到適宜長鏈烯酮的洗脫劑配比。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本實驗的沉積物樣品是2016 年廣東海洋地質(zhì)調(diào)查局南海航次采集的南海北部深海（112.479°E，15.442 °N，水深1 985 m）表層沉積物，為青灰色黏土質(zhì)，在預(yù)實驗中測得樣品的長鏈烯酮含量高、可重復(fù)性強，適合用于本實驗。

1.2 實驗材料與器材

試劑為二氯甲烷（D）、正己烷（H）、甲醇（M）、甲苯（T），均來自ANPEL 公司（上海），純度級別均為農(nóng)殘級（GC residue analysis）、孔徑63～210 μm 的硅膠來自Sigma公司（美國）。

器材為5.5 mm 玻璃滴管、4 mL 細胞瓶、不同容量的試劑瓶等玻璃器皿，使用前需450 ℃灼燒；硅膠色譜小柱固定架、Angilent-7890B氣相色譜儀等。

1.3 制備硅膠層析柱

根據(jù)需要選取適量孔徑63～210 μm 的硅膠，配制體積比為93∶7 的D-M 混合溶液對硅膠進行索氏抽提，約72 h 后取下烘干，量取1.5 mL 抽提后的硅膠填裝于450 ℃灼燒后5.5 mm 玻璃滴管中，將裝制好的硅膠色小柱置于110 ℃烘箱中活化8 h以上，去除硅膠表面因氫鍵所吸附的水分，恢復(fù)硅膠的極性（硅醇基的吸附力）。

1.4 樣品前處理

將沉積物冷凍干燥后搗碎混合均勻，稱取約5 g樣品于60 mL 玻璃管中，按固液質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶2 的比例加入體積比為9∶1 的D-M 混合溶液，超聲破碎抽提30 min，重復(fù)3 遍；獲得的抽提液在氮氣環(huán)境下吹干后加入60 g/L 的KOH 甲醇溶液皂化8 h 以上，然后加50 g/L 的NaCl 溶液混合，加H 振蕩，收集上清液，重復(fù)4遍。

1.5 不同極性配比洗脫劑的選擇

純H 無法洗脫長鏈烯酮，而純D 在洗脫長鏈烯酮的同時，部分干擾雜質(zhì)也一起被洗脫，由此推測長鏈烯酮系列分子的極性介于H 和D 之間。因此，本實驗設(shè)置體積比從18∶1 到1∶2 的H-D 作為洗脫劑進行樣品洗脫。將前處理得到的萃取物轉(zhuǎn)移進硅膠柱，依次加入約4 mL 以極性遞增的配比洗脫劑順序進行洗脫，同時，另取前處理的樣品先后加入4 mL T和D洗脫。

1.6 樣品檢測

本實驗樣品檢測使用Angilent 7890B 氣相色譜儀，色譜柱為DB-1 毛細管色譜柱，Agilent 122-1062（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；氫氣作為載氣。自動進樣器注入樣品2 μL；升溫程序為60 ℃維持1 min，以20 ℃/min 的速率升至270 ℃，以10 ℃/min 升至300 ℃，以5 ℃/min 升至310 ℃，最后由氫焰離子檢測器（FID）進行檢測。

2 結(jié)果與分析

本實驗選取南海表層沉積物作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，檢測出的長鏈烯酮為C37和C38，C37分為甲基（Me）的C37:3和C37:2兩類，C38則為甲基（Me）和乙基（Et）的C38:3和C38:2四類，其中，C37:2、C38:2Et 和C38:2Me 含量高，而C37:3、C38:3Me 和C38:3Et含量較低（圖1）。這是由于南海地處熱帶與亞熱帶，海表常年高溫，因而顆石藻更偏好合成不飽和鍵較少的長鏈烯酮。樣品色譜峰基線平穩(wěn)，無雜質(zhì)峰干擾目標(biāo)烯酮峰，是良好的標(biāo)準(zhǔn)樣品。本實驗的長鏈烯酮結(jié)構(gòu)式見圖2。

圖1 沉積物所含長鏈烯酮色譜峰Fig.1 Chromatographic peaks of long-chain alkenones in sediments

圖2 C37和C38烯酮分子結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structural formulas of C37 and C38 alkenones

2.1 不同極性洗脫劑的分離效果比較

本實驗使用T 和D 對標(biāo)準(zhǔn)樣品進行淋洗，發(fā)現(xiàn)C38:2Et 和C38:3Et 在T 中被完全洗脫，而C37:3、C37:2、C38:2Me 和C38:3Me 在T 和D 兩種洗脫劑分離的樣品中（圖3）。為進一步研究烯酮分子的分離效果，本實驗改變H 與D 體積比從18∶1 到1∶2，使洗脫劑極性逐漸增大，對標(biāo)準(zhǔn)樣品的長鏈烯酮進行洗脫。測定的色譜峰結(jié)果見圖4。使用VH∶VD為18∶1～9∶1的洗脫組分中均無發(fā)現(xiàn)長鏈烯酮。VH∶VD為8∶1 時洗脫組分中檢測到較小的C38:2Et 色譜峰，到VH∶VD為7∶1 時峰面積明顯增大。至VH∶VD為6∶1 時，洗脫組分中開始檢測到微量的C38:3Me，至VH∶VD為5∶1時，洗脫物中檢測到較小的C37:2、C38:2Me 和C38:3Et色譜以及較大的C38:2Et色譜峰。至VH∶VD為4∶1時，洗脫物色譜峰中依次出現(xiàn)C37:2、C38:3Et、C38:3Me、C38:2Et、C38:2Me，且峰面積比之前組分顯著更大。至VH∶VD為3∶1洗脫物中，出現(xiàn)少量的C37:3，而C38:2Et明顯減少；到VH∶VD為2∶1的洗脫物中，不再出現(xiàn)C38:2Et色譜峰，說明C38:2Et在VH∶VD為3∶1時已被完全洗脫。VH∶VD為2∶1與1∶1 的洗脫物中，均有C37:3、C37:2、C38:2Me 和C38:3Et；在VH∶VD為1∶2 的洗脫物中，兩個平行樣品的基線都十分平穩(wěn)，無任何長鏈烯酮色譜峰出現(xiàn)。

圖3 T和D作洗脫劑的烯酮色譜Fig.3 Chromatograms of the separation of alkenones by Toluene and Dichloromethane

圖4 不同體積比的H-D洗脫劑對烯酮的分離色譜Fig.4 Chromatograms of the separation of alkenones by H-D eluent at different volume ratios

由此可知，VH∶VD為18∶1～9∶1的洗脫劑無法從硅膠層析柱中洗脫長鏈烯酮分子，當(dāng)VH∶VD為8∶1到1∶1，烯酮陸續(xù)開始被洗脫出。其中，C38:2Et 最先被洗脫，出現(xiàn)在VH∶VD為8∶1到3∶1的洗脫物中；其次為C38:3Me 出現(xiàn)在VH∶VD為6∶1～1∶1 的洗脫物中；C37:3為最難被洗脫的烯酮分子，其在VH∶VD為3∶1～1∶1的洗脫物被檢出。當(dāng)洗脫劑VH∶VD小于3∶1，所有烯酮分子均可被洗脫出，但并不能被完全洗脫，直至VH∶VD為1∶2，不再出現(xiàn)烯酮分子被洗脫，表明洗脫完全。因此，根據(jù)本實驗的樣品用量以及洗脫效果看來，選擇洗脫劑H 和D 配比范圍適宜在3∶1～1∶2，小于1∶2則可完全將所有烯酮分子洗脫。

表1 和表2 分別給出2 個平行樣品依次被不同洗脫劑所洗脫的各烯酮分子色譜峰面積。由于各烯酮分子含量和峰面積具有較大差別，本實驗以每種烯酮分子的所有洗脫組分的峰面積作為總量，然后計算各洗脫組分其峰面積占總量的百分比（圖5），進而更清晰看出各烯酮分子被洗脫的效果。圖5顯示2 個平行樣品的各烯酮分子被洗脫規(guī)律高度相似。C38:2Et 最大占比出現(xiàn)在4∶1 的洗脫組分中，約占總量的37%～44%；C38:3Et 最大洗脫量出現(xiàn)在3∶1 組分，約占總量的40%～44%；C37:2和C38:2Me 最大洗脫量均在2∶1 組分，其中C37:2約占總量的42%～53%，C38:2Me 約占總量的44%～54%；C37:3最大洗脫量組分為1∶1，約占總量的44%～64%。而C38:3Me的洗脫效果較為特殊，在VH∶VD從6∶1 降低到2∶1 的各洗脫組分，其峰面積增加緩慢，并在VH∶VD為2∶1和1∶1 的洗脫組分中達到最大面積，但與其他洗脫組分差異并不如其他烯酮分子大?？偟目磥?，C37:3、C37:2、C38:2Me、C38:3Et 和C38:2Et 的峰面積隨著D 在洗脫劑中的占比增加而迅速增大，表明相同體積的洗脫液，極性越大而洗脫能力越高。

圖5 各洗脫組分中烯酮分子的峰面積比例Fig.5 Proportion of peak area of alkenones in each elution component

表1 平行樣品3不同洗脫劑配比對應(yīng)的各烯酮分子的峰面積Table 1 The peak area of different alkenones corresponding to different volume ratios of sample 3

表2 平行樣品4不同洗脫劑配比對應(yīng)的各烯酮分子的峰面積Table 2 The peak area of different alkenones corresponding to different volume ratios of sample 4

在柱層析分離過程中，C37和C38烯酮的分離會受到C36和C37烯酸酯等雜質(zhì)共洗脫的影響[13]。Zheng 等[14]選用不同型號的色譜柱分開長鏈烯酮和長鏈烯酸酯，成功發(fā)現(xiàn)型號為Rtx-200 (105 m ×250 μm ×0.25 μm)GC 色譜柱能成功消除二類物質(zhì)間的共洗脫，甚至能分開烯酮間的共洗脫；Wang等[15]利用AgTCM 柱分離，也能很好將長鏈烯酮和長鏈烯酸酯及系列雜質(zhì)分開。但在烯酮組分中C36和C37烯酸酯通常不到C37長鏈烯酮的10%[16]，通過皂化反應(yīng)也可去掉大部分烯酸酯和蠟酯。而對于皂化無法去除的其他雜質(zhì)，可能是導(dǎo)致不同實驗和不同處理方法長鏈烯酮重建溫度重現(xiàn)性較差的原因[17]。因此，探索洗脫劑對長鏈烯酮的分離效果，選擇適合極性的洗脫劑可能是提高重現(xiàn)性途徑之一。本實驗發(fā)現(xiàn)從VH∶VD=8∶1 時開始有烯酮分子被洗脫，在VH∶VD=3∶1 時所有C37和C38烯酮分子均可被洗脫，最終在VH∶VD=1∶2 時（圖4），既能洗脫C37和C38長鏈烯酮，又不使太多雜質(zhì)分子進入烯酮組分。本實驗平行樣品3 和4 的值分別為0.933 和0.936，用南海經(jīng)驗公式換算得到的SST 分別為27.13 ℃和27.25 ℃，重現(xiàn)性較好。對同一批樣品持續(xù)一年的前處理和檢測，重建SST的偏差均在0.5 ℃內(nèi)。

2.2 長鏈烯酮系列分子的極性比較

長鏈烯酮的各分子極性存在微小差異，隨著洗脫劑極性逐漸增強，各烯酮分子被洗脫的順序會有所差別（圖5），其極性大小為C38:2Et＜C38:3Me＜(C38:3Et、C38:2Me和C37:2)＜C37:3。但從洗脫比例峰值來看，其極性大小順序為C38:2Et＜C38:3Et、(C38:2Me、C37:2)＜(C38:3Me、C37:3)。兩個平行樣品的結(jié)果顯示，C38:2Me 和C37:2在不同配比洗脫劑中的洗出比例非常接近，表明這兩個甲基酮分子極性非常接近。從分子結(jié)構(gòu)看（圖2），長鏈烯酮主要由甲基或乙基酮與鏈長為35 或36 的不飽和烴基構(gòu)成，由于羰基是強極性基團，甲基酮的極性大于乙基酮，極性大小應(yīng)該為(C38:2Et、C38:3Et)＜(C38:2Me、C38:3Me、C37:2和C37:3)。這與根據(jù)洗脫峰值判斷的結(jié)果一致?？梢?，推斷根據(jù)洗脫峰值對應(yīng)的洗脫劑極性來判斷烯酮分子極性的順序更為合理，極性大小順序為C38:2Et＜C38:3Et＜(C38:2Me、C37:2)＜C37:3。

2.3 洗脫效果對指標(biāo)溫度的影響

=C37:2/ (C37:2+C37:3)，因此，C37:2和C37:3的洗脫效果將會影響和重建的溫度值。假設(shè)使用VH∶VD=3∶1 的洗脫劑，其洗脫的的C37烯酮量應(yīng)為該洗脫組分與其前面各組分的累加（表3）。根據(jù)兩個平行樣品累加的C37:2和C37:3峰面積計算的分別為0.967和0.981，SST值分別為28.23 ℃和28.70 ℃；同理，VH∶VD=2∶1 時計算的分別為0.956 和0.967，SST 分別為27.87 ℃和28.24 ℃。上述情況中，VH∶VD=3∶1 和2∶1 時均未完全洗脫，而VH∶VD=1∶1 時完全洗脫得到的換算SST 為27.13 ℃和27.25 ℃，呈逐漸下降趨勢。這說明在未完全洗脫的情況下，或?qū)е碌闹亟囟绕?，原因可能是由于C37:2的極性小于C37:3，未完全洗脫時，其洗脫的比例高于C37:3，導(dǎo)致?lián)Q算的SST 偏高。因此，硅膠層析分離長鏈烯酮時，如果未完全洗脫會導(dǎo)致值偏大，從而使重建的SST高于真實值。

表3 洗脫劑極性增強時C37長鏈烯酮的累積結(jié)果Table 3 Cumulative results of C37 long chain ketene with enhanced polarity of eluent

3 結(jié)論

本研究主要通過使用不同極性的洗脫劑對長鏈烯酮分離效果進行比較與分析，得到如下結(jié)論：

1）C37和C38烯酮在VH∶VD=8∶1的配比洗脫劑開始被陸續(xù)被洗脫，VH∶VD=3∶1 時所有C37和C38烯酮分子開始被洗脫。VH∶VD小于1∶2 可完全洗脫C37和C38烯酮分子。

2）長鏈烯酮各分子的峰值出現(xiàn)在不同極性的洗脫劑中，據(jù)此可大致判斷其極性大小順序為C38:2Et＜C38:3Et＜(C38:2Me、C37:2)＜C37:3。

3）在VH∶VD=3∶1 開始C37和C38烯酮已均可被洗脫，但其均高于完全洗脫時的，因此，如果長鏈烯酮洗脫不完全，可能會使偏大，導(dǎo)致?lián)Q算的SST偏高。