酵母β-葡聚糖提取方法及免疫活性研究

吳豪益，王彥波，傅玲琳，劉福奇，韓軍花

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大學(xué)實(shí)驗(yàn)室與資產(chǎn)管理處，浙江 杭州 310018；3.美贊臣嬰幼兒營養(yǎng)品研發(fā)中心（中國）有限公司，廣東 廣州 510623）

β-葡聚糖是一類天然多糖，由D-葡萄糖單體通過β-糖苷鍵連接而成，作為細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)元件，在細(xì)菌、真菌（包括酵母）、藻類和植物中廣泛存在。研究發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖的理化性質(zhì)及生物活性均與其分子空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[1]。不同來源的β-葡聚糖以及不同的提取、純化方法都會(huì)影響其分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響相應(yīng)的生物活性[2-3]。研究顯示，來源于啤酒酵母的酵母β-葡聚糖（yeast β-glucan）在 β-1，3 主鏈上有高度支鏈度，分子量比較大。并且其表現(xiàn)出增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、調(diào)節(jié)血糖和腸道微生態(tài)的生理作用，因此被認(rèn)為是一種安全天然有效，具有免疫調(diào)節(jié)的功能食品原料[4]。

酵母β-葡聚糖在2008年獲得美國食品藥品管理局的食品安全性認(rèn)證（Generally Recognized as Safe，GRAS）（GRN00239），隨后常被用于支持健康免疫功能的功能性食品、飲料、保健食品和運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)產(chǎn)品。中國衛(wèi)生部發(fā)布的《中華人民共和國衛(wèi)生部公告2010年第9號(hào)》公告，認(rèn)定酵母β-葡聚糖為新資源產(chǎn)品，可以添加到乳制品、功能飲料、焙烤制品、糖果等各種食品中。2012年第6號(hào)公告已將酵母β-葡聚糖使用范圍擴(kuò)大至嬰兒配方乳粉，本文為其在食品領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用提供了參考。

1 酵母β-葡聚糖的制備

1.1 酸堿法

酸法和堿法是最早應(yīng)用于酵母β-葡聚糖浸提的方法之一。在早期的研究中，一般使用醋酸、甲酸等有機(jī)酸在90℃左右的條件下對(duì)酵母細(xì)胞水浴3 h左右，再經(jīng)過離心、沉淀以及干燥等操作得到酵母β-葡聚糖產(chǎn)物[5-6]。黃丹等[7]研究發(fā)現(xiàn)，使用酸法得到的產(chǎn)物雖然產(chǎn)率較高（21.58%），但是純度較低，雖然經(jīng)過一系列的優(yōu)化但純度（71.46%）仍無法提高到理想程度。而在對(duì)堿法提取的研究中，使用NaOH處理酵母細(xì)胞，并輔以高壓等手段，使所得產(chǎn)品純度達(dá)到90%以上，滿足食品以及醫(yī)療等領(lǐng)域的要求。但堿法過程中產(chǎn)生的廢液難以處理，限制了其在大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用[8-9]。為將酸堿兩種提取方式的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來，于明秀和Pengkumsri等[6，10]對(duì)酸堿結(jié)合的方法進(jìn)行探究及優(yōu)化，將酵母細(xì)胞自溶后，先后用強(qiáng)堿（NaOH）和弱酸（CH3COOH）處理，所得的酵母β-葡聚糖產(chǎn)品的得率和純度都較單獨(dú)處理的酸法和堿法有提升，且產(chǎn)品改性后能滿足醫(yī)療領(lǐng)域的需求。但是由于酸堿廢液的環(huán)境污染問題仍然無法達(dá)到有效的改善，且由于過程中使用大量的酸堿造成提取成本的增加。因此，酸堿法處理無法滿足目前食品以及藥品市場(chǎng)對(duì)酵母β-葡聚糖的需求，也無法滿足市場(chǎng)對(duì)綠色生產(chǎn)的要求。

1.2 高壓微射流均質(zhì)法

高壓微射流均質(zhì)法（high pressure microfluidization，HPM）作為一種比較新興的食品加工處理手段，在酵母β-葡聚糖提取的應(yīng)用中也表現(xiàn)出良好的效果。HPM利用高壓使液體物料被泵入并分成兩個(gè)微流，隨后在一個(gè)反應(yīng)腔室發(fā)生相互碰撞，使微粒受到強(qiáng)烈的剪切、撞擊及空穴效應(yīng)，使得細(xì)胞破碎、內(nèi)容物溢出，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)化合物的高效提取[11-12]。Williams等[13]用HPM技術(shù)從釀酒酵母中提取β-葡聚糖，在保持其生理活性的同時(shí)能夠顯著降低其分子量，獲得溶解度更好的高品質(zhì)產(chǎn)品。Liu等[14]對(duì)HPM過程中的最佳處理?xiàng)l件進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)隨著HPM壓力升高可以明顯提高可溶性β-D-葡聚糖的產(chǎn)量，在壓力達(dá)到165.48 MPa時(shí)，提升效果最佳。在腔室壓力為165.48 MPa、停留時(shí)間為10 min/200 mL的條件下制得的β-葡聚糖產(chǎn)品不僅產(chǎn)量和純度優(yōu)于傳統(tǒng)酸堿浸提法，且可溶性更佳，蛋白質(zhì)含量更低，適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[15]，HPM技術(shù)與其他方式優(yōu)化組合后，較單一的提取方法在提取效率、得率和純度上顯著提高。高潔等[16]在前期研究的基礎(chǔ)上，采用高壓微射流均質(zhì)與復(fù)合酶解結(jié)合的方法制備酵母β-葡聚糖，見圖1，高壓微射流1處理?xiàng)l件：壓力210 MPa、循環(huán)3次、質(zhì)量濃度20%（濕重）；復(fù)合酶解條件：酶添加量1.0%、溫度55℃、pH7.0、酶解50 min、料液比濕重（質(zhì)量比）1∶4；高壓微射流2處理?xiàng)l件：壓力210 MPa、循環(huán)3次，制得的酵母β-葡聚糖產(chǎn)物純度為（81.07±0.82）%，總糖含量為（91.51±1.60）%，基本可以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的純度和得率要求。但是可能由于過程中的高壓環(huán)境使得酵母的立體結(jié)構(gòu)被破壞，得到的酵母β-葡聚糖產(chǎn)物為粗糙扁平狀，這對(duì)葡聚糖的功能效果可能會(huì)產(chǎn)生一定的影響。

圖1 高壓微射流均質(zhì)與復(fù)合酶解結(jié)合方法Fig.1 The method of combining HPM and compound enzymatic hydrolysis

1.3 超聲波法

目前，超聲波技術(shù)作為一種非熱加工技術(shù)，由于其空化效應(yīng)能夠有效地增強(qiáng)物質(zhì)的提取分離效果，作為一種輔助提取手段在對(duì)天然產(chǎn)物和生物活性物質(zhì)的提取中表現(xiàn)出巨大的潛力[17]。早期研究采用超聲波技術(shù)處理酵母泥，多糖得率能夠達(dá)到33%～36%，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)酸堿法20%左右的多糖得率。在此基礎(chǔ)上，李紅梅等[18]利用Box-Behnken優(yōu)化超聲波輔助提取技術(shù)中的關(guān)鍵因素，如處理時(shí)間及超聲功率，采用的自溶超聲波耦合技術(shù)在提取酵母β-葡聚糖時(shí)提取率達(dá)到50.5%。自溶超聲耦合技術(shù)在超聲技術(shù)的基礎(chǔ)上利用酵母細(xì)胞在特定環(huán)境下的自溶，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，與超聲輔助提取效果起到協(xié)同效果。Zheng和Kim等[19-20]發(fā)現(xiàn)，超聲波處理與堿處理分別使酵母β-葡聚糖的粒徑從 8.80 μm 減少到 1.77 μm 和 7.19 μm，相比于堿處理，超聲波處理在松動(dòng)葡聚糖聚集結(jié)構(gòu)，擴(kuò)大比表面積，增強(qiáng)其可溶性方面有更大的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)超聲波技術(shù)與酶解相結(jié)合處理時(shí)，前者通過增大酶接觸面積大大增強(qiáng)了酶解效率，使酵母β-葡聚糖的產(chǎn)率提高到32.3%，純度達(dá)到98.8%，遠(yuǎn)超于單一處理模式[21]。超聲與上述輔助手段的聯(lián)合處理得到的酵母β-葡聚糖產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)和生物活性保留上有較大的改善?？梢?，這類提取方式是酵母β-葡聚糖在工業(yè)中高效提取的潛在方法。

2 酵母β-葡聚糖免疫活性

2.1 基于細(xì)胞模型研究

在體外研究中，酵母β-葡聚糖表現(xiàn)出對(duì)免疫細(xì)胞、受體及細(xì)胞因子等參與免疫系統(tǒng)因子的調(diào)節(jié)作用。Angulo等[22]利用酵母β-葡聚糖刺激山羊的單核細(xì)胞，在培養(yǎng)4 d～6 d后，表現(xiàn)出典型的巨噬細(xì)胞形態(tài)，且上調(diào)了巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物（CD11b和F4/80）的基因表達(dá)，從而在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）攻擊下發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)的細(xì)胞存活和高吞噬能力。在前期的一些研究中發(fā)現(xiàn)，酵母β-葡聚糖在體外表現(xiàn)出促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞增殖的作用，且有助于白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10 IL-10）、腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）等細(xì)胞因子的產(chǎn)生[23-24]，對(duì)免疫效果有顯著的增強(qiáng)作用。此外，在已有的研究報(bào)道中，酵母β-葡聚糖表現(xiàn)出與抗腫瘤單克隆抗體的協(xié)同作用，對(duì)抗腫瘤效果及多種凋亡調(diào)節(jié)蛋白水平有顯著的改善。酵母β-葡聚糖可以直接抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，也可以刺激自然殺傷細(xì)胞或中性粒細(xì)胞在與葡聚糖受體結(jié)合時(shí)殺死癌細(xì)胞[25]。在近期研究中發(fā)現(xiàn)，酵母β-葡聚糖作為一種新型的自噬抑制劑在癌癥治療方面取得了進(jìn)展，其通過增加溶酶體pH值和抑制溶酶體組織蛋白酶活性來抑制自噬降解，從而對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和代謝以及體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用[26]。

2.2 基于動(dòng)物模型研究

目前酵母β-葡聚糖在很多動(dòng)物試驗(yàn)研究中表明，其在提高機(jī)體免疫能力、抗腫瘤等方面有顯著的效用，被用作動(dòng)物免疫刺激劑。Wang等[27]在研究中發(fā)現(xiàn)，口服硫酸化的酵母β-葡聚糖通過顯著改變細(xì)胞因子的濃度，提高 γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和 IL-6濃度，降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）濃度，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖從而有效改善雞的免疫系統(tǒng)，同時(shí)增加有益的腸道細(xì)菌，促進(jìn)腸道免疫系統(tǒng)的功能。利用口服插管方式對(duì)鰨魚模型進(jìn)行酵母β-葡聚糖給藥，通過取血分析和對(duì)魚腸道菌群的16S rDNA組學(xué)測(cè)序，結(jié)果表明魚腸道IL1B和IRF7表達(dá)上調(diào)且腸道微生物中的弧菌比例顯著降低，實(shí)現(xiàn)對(duì)模型免疫的調(diào)節(jié)[28]。并且當(dāng)酵母β-葡聚糖作為補(bǔ)充物添加于飼料中時(shí)，能夠有效提高養(yǎng)分消化率，通過增加免疫球蛋白濃度和刺激堿性磷酸酶來增強(qiáng)免疫力[29]，在提高機(jī)體先天性免疫力和特異性病原體抵抗力方面體現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。在小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，酵母β-葡聚糖能夠有效預(yù)防小鼠單增李斯特菌、炭疽芽孢桿菌以及白色念珠菌的感染[30-31]。Chan等和Alexander等[32-33]基于之前所報(bào)道的抗腫瘤機(jī)制，證明了酵母衍生的β-葡聚糖顆粒在小鼠肺部轉(zhuǎn)移樣黑色素瘤模型中的抗腫瘤功效。近期有研究表明，酵母β-葡聚糖與鋅復(fù)合后的產(chǎn)物在納米載體遞送下對(duì)機(jī)體的抗炎和促炎細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8）有明顯的增強(qiáng)作用，對(duì)提高機(jī)體體液免疫、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）活性，增強(qiáng)腸黏膜免疫有顯著調(diào)節(jié)作用[34-35]。

2.3 基于臨床研究

近年來，酵母β-葡聚糖在臨床人體免疫方面的應(yīng)用也受到學(xué)者的關(guān)注。研究表明，針對(duì)不同年齡階段人群的雙盲選實(shí)驗(yàn)中，攝入酵母β-葡聚糖的受試人群較安慰劑對(duì)照人群，皮膚和呼吸道的過敏癥狀等發(fā)生率有顯著降低[36-38]。尤其在幼兒期方面以及中老年人方面表現(xiàn)出顯著的提高機(jī)體免疫力的效果，在對(duì)1歲～4歲兒童的喂食實(shí)驗(yàn)中，攝入含酵母β-葡聚糖乳品飲料的實(shí)驗(yàn)組受試結(jié)果顯示其過敏性鼻炎、喘息，過敏性咳嗽、濕疹和蕁麻疹等發(fā)生率與對(duì)照組相比有顯著降低且需要接受抗生素治療的比例減少[39]。Fuller等[36]在針對(duì)50歲～70歲中老年人范圍的研究中發(fā)現(xiàn)，每天服用250 mg酵母β-葡聚糖膠囊雖然沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是能夠有效降低發(fā)生感染癥狀的天數(shù)，同時(shí)改善情緒狀況，緩解情緒壓力。但是對(duì)于酵母β-葡聚糖在人體中調(diào)節(jié)的具體機(jī)制還不清晰，待進(jìn)一步的研究。

2.4 免疫活性機(jī)制

酵母β-葡聚糖由于其顯著的免疫調(diào)節(jié)作用而受到廣泛的關(guān)注，酵母β-葡聚糖免疫活性機(jī)制見圖2。酵母β-葡聚糖進(jìn)入消化道后，通過食道和胃進(jìn)入小腸。在腸壁上的M細(xì)胞將β-葡聚糖從腸腔轉(zhuǎn)運(yùn)到淋巴組織[40]，該區(qū)域富含免疫細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，可連續(xù)監(jiān)測(cè)通過腸道的成分，尤其是有害微生物。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在其外表面具有專門的受體，可以識(shí)別并結(jié)合有害微生物中常見的分子結(jié)構(gòu)[41]。以巨噬細(xì)胞為例，由于酵母β-葡聚糖分子特殊結(jié)構(gòu)，會(huì)被巨噬細(xì)胞上的受體識(shí)別后結(jié)合，并由此激活巨噬細(xì)胞，并使其具有破壞有害微生物的能力[42]。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，喂養(yǎng)酵母β-葡聚糖的個(gè)體內(nèi)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞具有更高的吞噬活性及吞噬細(xì)胞的百分比[40]，可見酵母β-葡聚糖對(duì)這些細(xì)胞類型的氧化代謝產(chǎn)生了積極的作用，這是一種強(qiáng)烈的呼吸爆發(fā)刺激。利用致敏蛋白刺激淋巴細(xì)胞時(shí)，來自酵母β-葡聚糖喂養(yǎng)組的淋巴細(xì)胞具有較高的增殖率[43]，這也證明了酵母β-葡聚糖對(duì)細(xì)胞免疫的積極影響。此外，盡管酵母β-葡聚糖開始在腸道中發(fā)揮作用，但也有研究表明，酵母β-葡聚糖分子可以被巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至體內(nèi)其他部位的淋巴組織，從而可以激活其他免疫細(xì)胞[40]。而由于酵母β-葡聚糖被免疫細(xì)胞上受體所識(shí)別并結(jié)合是具有專一性的，因此具有不同分子結(jié)構(gòu)的β-葡聚糖在免疫系統(tǒng)的作用也不同，具體的免疫機(jī)制仍需要進(jìn)一步的探索。

圖2 酵母β-葡聚糖免疫活性機(jī)制Fig.2 Yeast β-glucan immune activity mechanism

3 結(jié)論與展望

目前，酵母β-葡聚糖在化工、水產(chǎn)以及食品方面的應(yīng)用受到越來越廣泛的關(guān)注。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，到2022年，全球酵母β-葡聚糖市場(chǎng)將達(dá)到4.765億美元，這表明β-葡聚糖的應(yīng)用具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。但是在國?nèi)市場(chǎng)中，酵母β-葡聚糖仍然存在產(chǎn)量低、品質(zhì)不高等問題，無法滿足市場(chǎng)日益增長(zhǎng)的需求。目前常用的提取手段包括酸堿法提取、高壓微射流均質(zhì)法以及超聲輔助提取法，這些方法都還存在產(chǎn)率低、純度難以滿足市場(chǎng)需求、生產(chǎn)過程污染嚴(yán)重等問題。尋找一種工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高且產(chǎn)品質(zhì)量良好的生產(chǎn)方式有助于提高酵母β-葡聚糖商業(yè)價(jià)值，推廣其在各領(lǐng)域的應(yīng)用，順應(yīng)其國際發(fā)展趨勢(shì)。目前在細(xì)胞模型、動(dòng)物模型和初步臨床上對(duì)酵母β-葡聚糖進(jìn)行了一系列研究，β-葡聚糖均表現(xiàn)出了提高機(jī)體免疫能力的作用。但是其對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的具體機(jī)制還存在一些疑問，某些提出的機(jī)制仍基于假設(shè)，尚未闡明潛在的作用機(jī)制。未來的研究應(yīng)集中在探索酵母β-葡聚糖與不同主體之間的深層相互作用機(jī)制，以及不同機(jī)制之間的相互聯(lián)系。這對(duì)于了解人和動(dòng)物中酵母β-葡聚糖引起的變化將是有益的，這也將有助于酵母β-葡聚糖的開發(fā)和應(yīng)用。