明趕飲對急性酒精中毒模型大鼠解酒保肝作用及其機制研究

黃項鳴 陸 敏 樊欣鈺 張夢秋

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇南京210028；2.南京市棲霞區(qū)西崗社區(qū)醫(yī)院，江蘇南京210033）

急性酒精中毒（acute alcohol intoxication，AAI）是因機體短時間內(nèi)攝入大量酒精導致酒精代謝中的有害物質(zhì)如乙醛堆積而發(fā)生[1]，表現(xiàn)為行為意識異常、上腹部不適、惡心嘔吐、心率增高等癥狀乃至危象。酒精導致的疾病、死亡是全球性重大公共衛(wèi)生健康問題之一，而中國是因酒精問題致死人數(shù)最多的國家[2]，防治酒精致病值得全社會高度關(guān)注。自古以來，中藥在解酒、治酒病方面有明確的療效記載[3]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，部分中藥單味藥、復方、制劑不僅可緩解酒后癥狀，亦可調(diào)理長期過量飲酒導致的慢性肝臟疾病[4-6]，具有預防、改善癥狀等作用，且簡便廉驗、副作用小。明趕飲由全國名老中醫(yī)王德明教授驗方“決明方”化裁而來[7-8]，由陳皮、決明子、牡蠣等“藥食同源”之品配伍而成。臨床發(fā)現(xiàn)，飲酒前服用明趕飲對酒后不適癥狀有明顯緩解作用。本研究制作AAI模型大鼠，觀察明趕飲對AAI模型大鼠的解酒、保肝作用，并探索其作用機制，為明趕飲解酒保肝制劑的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，體重180～200 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，動物使用許可證號：SCXK（蘇）2016-0010。動物飼養(yǎng)于（22±2）℃的環(huán)境中，相對濕度為50%～60%，晝夜各12 h循環(huán)，每籠3只飼養(yǎng)，自由攝食飲水。本實驗經(jīng)南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會審查批準。

1.2 藥物與試劑 明趕飲為中國中醫(yī)科學院江蘇分院南院協(xié)定方，處方由決明子15 g、牡蠣30 g、陳皮9 g、荷葉10 g、生甘草6 g等藥物組成，煎煮3次，合并濾液濃縮至中藥濃度為0.76 g/mL。牡蠣大豆肽肉堿口服液（含多肽900 mg、牛磺酸50 mg、左旋肉堿60 mg等成分，國食健注G20110347，批號：20220111284，以下簡稱牡蠣大豆肽肉堿），濃縮至濃度為0.0101 g/mL，購自深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司。濃度為95%的食用酒精（使用時稀釋至50%）、0.9%氯化鈉注射液（批號：H33021037）購自浙江莎普愛思藥業(yè)股份有限公司；95%乙醇（批號：10009164）、叔丁醇（批號：40084062）購自國藥集團化學試劑上海有限公司；異氟烷（批號：R510-22）購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色液（批號：KGA224）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（批號：C010-2-1）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒（批號：C009-2-1）、總膽紅素（TBil）試劑盒（批號：C019-1-1）、直接膽紅素（DBil）試劑盒（批號：C019-2-1）、乙醇脫氫酶（ADH）試劑盒（批號：A083-2-1）購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器 Millipore公司Direct-Q with pump型超純水儀；蘇州凈化設(shè)備有限公司SW-CJ-2FD型超凈化工作臺；BeckMan公司Allegra X-15R、Microfuge 20R離心機；北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司BS224型電子天平；上海博迅實業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器；北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司ZS-MV-Ⅳ型小動物麻醉機；BeckMan公司DU730紫外分光光度計；Berthold公司LB941微孔板式多功能酶標儀；島津中國有限公司GC2010 pro氣相色譜儀。

2 實驗方法

2.1 分組、造模與給藥 將60只SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為空白組、模型組、陽性對照組和明趕飲高、低劑量組，每組12只。適應性飼養(yǎng)結(jié)束后，禁食12 h?？瞻捉M、模型組予等量生理鹽水灌胃，陽性對照組、明趕飲高劑量組、明趕飲低劑量組分別灌胃給予牡蠣大豆肽肉堿濃縮液0.101 g/kg或明趕飲水煎劑濃縮液7.6 g/kg、3.8 g/kg。第1次灌胃結(jié)束30 min后，空白組予生理鹽水灌胃，其余各組采用一次灌胃過量酒精的方式建立大鼠AAI模型[9-11]，予50%食用酒精溶液15 mL/kg灌胃。

2.2 觀察指標

2.2.1 一般情況 觀察各組大鼠藥物灌胃前后有無死亡，外觀、行為活動、糞便、食量等有無明顯異常；觀察酒精灌胃后各組大鼠有無出現(xiàn)死亡、興奮狂躁、共濟失調(diào)、活動減少、嗜睡等表現(xiàn)。

2.2.2 翻正反射試驗 第2次灌胃后，除空白組外，其余各組大鼠各取6只進行試驗。以背部朝下姿勢置于籠內(nèi)，每5 s糾正其姿勢使背部朝下，直到大鼠不能立刻自行糾正為止[12]。當大鼠保持30 s無法自主翻轉(zhuǎn)，即可認為翻正反射消失（醉酒）；當大鼠又可自行翻轉(zhuǎn)，則認為翻正反射恢復（醒酒），超過12 h未醒者按12 h記錄。逐一統(tǒng)計大鼠灌酒后的醉酒潛伏期（自灌酒至翻正反射消失的時間）、睡眠時間（自翻正反射消失至恢復的時間）、醒酒時間（自灌酒至翻正反射恢復的時間）。

2.2.3 血乙醇濃度及動力學參數(shù) 取各組另6只大鼠（空白組隨機取6只大鼠）進行血乙醇濃度檢測。大鼠于第2次灌胃后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0 h在淺麻醉狀態(tài)下經(jīng)尾靜脈取血，采用頂真空氣相色譜法測定大鼠不同時間點的血乙醇濃度，并獲得血乙醇動力學參數(shù)：達峰時間、達峰濃度和血乙醇濃度-時間曲線下面積。

2.2.4 血清AST、ALT、TBil、DBil含量 所有大鼠第2次灌胃后12 h，即完成上述試驗或檢測后，用4%水合氯醛按10 mL/kg腹腔注射，麻醉后腹主動脈取血5 mL，常溫下靜置血樣15 min，4 ℃、400×g離心10 min，取血清，檢測AST、ALT、TBil、DBil含量。

2.2.5 肝組織ADH活性 麻醉后取大鼠肝臟組織，置于10%甲醛、戊二醛溶液于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。檢測時剪碎組織，加入9倍體積生理鹽水，冰水浴制備勻漿，4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清，根據(jù)試劑盒說明書檢測樣本中ADH活性。

2.2.6 肝臟組織病理形態(tài)觀察及病理學評分 取大鼠肝組織制備石蠟切片，置于電熱恒溫干燥箱中，60 ℃烘烤2 h；對干燥的石蠟切片進行二甲苯脫蠟，下行梯度乙醇水化，蒸餾水洗；使用蘇木素染色2 min，鹽酸酒精分化數(shù)秒，水洗返藍；使用伊紅染液染片1 min，水洗沖掉殘留染液；切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥、二甲苯透明、中性樹膠封片；使用相差顯微鏡于400倍視野下隨機選擇一個視野觀察并拍照。結(jié)合朔伊爾分級評分系統(tǒng)[13]，使用以下標準對肝組織進行病理學評分：0分，無炎癥或輕微門靜脈炎癥；1分，門靜脈炎癥無壞死/小葉炎癥無壞死；2分，輕度局限性板狀壞死/輕度局灶性小葉壞死；3分，中度局限性板狀壞死/中度局灶性小葉壞死；4分，重度局限性板狀壞死/橋接壞死。

2.3 統(tǒng)計學方法 用graphpad Prism 9對數(shù)據(jù)進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料數(shù)據(jù)以（±s）表示，2組間數(shù)值比較采用 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況比較 第1次灌胃前后，各組大鼠無死亡，外觀、行為活動、糞便、食量等均未見明顯異常。第2次灌胃后，除空白組外，其余各組大鼠均出現(xiàn)明顯醉酒表現(xiàn)，多表現(xiàn)為興奮狂躁、共濟失調(diào)，隨后出現(xiàn)活動減少、昏睡等。所有大鼠觀察期間內(nèi)均未出現(xiàn)死亡。各給藥組大鼠酒后精神狀態(tài)、活動能力均較模型組明顯改善，明趕飲高劑量組大鼠嗜睡狀態(tài)明顯輕于陽性對照組。

3.2 各組大鼠翻正反射試驗結(jié)果比較 與模型組比較，陽性對照組和明趕飲高劑量組大鼠醉酒潛伏期明顯延長（P＜0.05，P＜0.01），各給藥組睡眠時間、醒酒時間顯著縮短（P＜0.01）；與陽性對照組比較，明趕飲高劑量組大鼠睡眠時間、醒酒時間顯著縮短（P＜0.05）；明趕飲高劑量對AAI模型大鼠翻正反射試驗各指標的改善均顯著優(yōu)于低劑量（P＜0.01）。詳見表1。

表1 各組大鼠翻正反射試驗結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠翻正反射試驗結(jié)果比較（±s）

注： 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與明趕飲低劑量組比較，△△P＜0.01。

組別 動物數(shù)/只 醉酒潛伏期/min 睡眠時間/min 醒酒時間/min空白組 6 - - -模型組 6 18.35±3.73 640.77±42.57 659.12±44.99陽性對照組 6 24.52±4.34* 424.36±27.35** 448.88±27.89**明趕飲高劑量組 6 27.97±2.9**ΔΔ 352.50±37.29**#△△ 380.47±34.81**#△△明趕飲低劑量組 6 18.84±2.83# 509.75±44.93**## 528.59±45.65**##

3.3 各組大鼠血乙醇濃度及動力學參數(shù)比較 灌胃50%食用酒精后0.5 h，明趕飲高劑量組大鼠血乙醇濃度明顯低于模型組（P＜0.05）；灌胃50%食用酒精后1.0、1.5、2.0、3.0、5.0 h，各給藥組大鼠血乙醇濃度明顯低于模型組（P＜0.01）。與陽性對照組比較，灌胃50%食用酒精后5.0 h，明趕飲高劑量組大鼠血乙醇濃度明顯降低（P＜0.01）。灌胃50%食用酒精后1.5、2.0、3.0、5.0 h，明趕飲高劑量組大鼠血乙醇濃度明顯低于低劑量組（P＜0.01）。詳見表2。與模型組比較，各給藥組大鼠的血乙醇濃度達峰時間均有所縮短，而達峰濃度、血乙醇濃度-時間曲線下面積均顯著降低（P＜0.01）；其中明趕飲高劑量組達峰濃度顯著低于低劑量組（P＜0.01），血乙醇濃度-時間曲線下面積明顯低于陽性對照組和明趕飲低劑量組（P＜0.01）。詳見圖1、表3。

表2 各組大鼠灌胃50%食用酒精后不同時間血乙醇濃度比較（±s） 單位：mg/dL

表2 各組大鼠灌胃50%食用酒精后不同時間血乙醇濃度比較（±s） 單位：mg/dL

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對照組比較，##P＜0.01；與明趕飲低劑量組比較，△△P＜0.01。

組別 動物數(shù)/只灌胃50%食用酒精后0.5 h 1.0 h 1.5 h 2.0 h 3.0 h 5.0 h空白組 6 - - - - - -模型組 6 233.87±30.42 313.54±20.93 327.37±21.67 318.21±22.76 251.42±20.51 184.08±22.75陽性對照組 6 206.59±25.69 234.45±27.17** 223.48±28.25** 194.82±19.69** 155.26±19.46** 88.07±14.77**明趕飲高劑量組 6 190.73±19.77* 216.08±21.52** 200.41±29.26**△△ 164.54±17.07**△△ 136.48±10.87**△△ 55.02±7.13**##△△明趕飲低劑量組 6 225.64±29.73 253.39±32.94** 277.45±17.21**## 256.67±20.61**## 192.65±18.90**## 107.89±9.46**

表3 各組大鼠血乙醇動力學參數(shù)比較（±s）

表3 各組大鼠血乙醇動力學參數(shù)比較（±s）

注： 與模型組比較，**P＜0.01；與陽性對照組比較，##P＜0.01；與明趕飲低劑量組比較，△△P＜0.01。

組別 動物數(shù)/只 達峰時間/h 達峰濃度/（mg/dL） 血乙醇濃度-時間曲線下面積/（ng·L-1·h）空白組 6 - - -模型組 6 1.70±0.45 327.37±21.67 1.12±0.04陽性對照組 6 1.33±0.26 234.45±27.17** 0.87±0.03**明趕飲高劑量組 6 1.42±0.38 216.08±21.52**△△ 0.64±0.02**##△△明趕飲低劑量組 6 1.42±0.20 277.45±17.21**## 0.91±0.03**##

圖1 各組大鼠血乙醇濃度與時間曲線（n=6）

3.4 各組大鼠肝功能指標及肝臟ADH活性比較 與空白組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、TBil、DBil等肝功能指標含量及肝臟ADH活性均顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠上述指標均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），ADH活性均顯著升高（P＜0.01）；其中明趕飲高劑量組大鼠肝功能指標顯著低于陽性對照組和明趕飲低劑量組（P＜0.05，P＜0.01），ADH活性明顯高于陽性對照組和明趕飲低劑量組（P＜0.01）。詳見表4。

表4 各組大鼠肝功能指標含量及肝臟ADH活性比較（±s）

表4 各組大鼠肝功能指標含量及肝臟ADH活性比較（±s）

注： 與空白組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與明趕飲低劑量組比較，△△P＜0.01。

組別 動物數(shù)/只 AST/（IU/L） ALT/（IU/L） TBil/（μmol/L） DBil/（μmol/L） ADH/（U/mg prot）空白組 12 96.17±5.56 34.39±4.11 1.50±0.17 1.23±0.09 5.58±0.96模型組 12 159.25±5.36☆☆ 66.28±3.75☆☆ 3.11±0.33☆☆ 2.10±0.22☆☆ 7.24±1.28☆陽性對照組 12 132.60±6.22** 49.82±4.88** 2.27±0.23** 1.73±0.10** 11.55±1.43**明趕飲高劑量組 12 112.94±5.97**#△△ 44.78±3.35**#△△ 1.96±0.23**#△△ 1.50±0.09**##△△ 14.18±1.15**##△△明趕飲低劑量組 12 140.49±6.53**## 57.76±2.64**## 2.62±0.23**## 1.91±0.14*# 10.01±1.22**#

3.5 各組大鼠肝組織形態(tài)及病理學評分比較 病理圖片顯示，空白組大鼠肝臟組織形態(tài)正常（圖2-a）；模型組大鼠肝臟組織出現(xiàn)明顯炎性浸潤、細胞水腫和脂肪浸潤（圖2-b）；與模型組比較，陽性對照組（圖2-c）、明趕飲高劑量組（圖2-d）、明趕飲低劑量組（圖2-e）大鼠肝組織病理情況明顯改善。各組大鼠肝組織病理學評分比較見表5。

表5 各組大鼠肝組織病理學評分比較（±s）

表5 各組大鼠肝組織病理學評分比較（±s）

注： 與空白組比較，☆☆P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與陽性對照組比較，##P＜0.01；與明趕飲低劑量組比較，△△P＜0.01。

組別 動物數(shù)/只 肝組織病理學評分/分空白組 12 0模型組 12 3.58±0.51☆☆陽性對照組 12 1.75±0.62**明趕飲高劑量組 12 1.17±0.72**△△明趕飲低劑量組 12 2.58±0.51**##

圖2 各組大鼠肝組織病理形態(tài)比較（HE，×400）

4 討論

肝臟是酒精代謝的重要器官，90%～98%的酒精通過肝臟氧化完成，其中最重要的途徑為ADH將酒精氧化為乙醛，乙醛再通過乙醛脫氫酶氧化為乙酸[14]。西醫(yī)治療AAI患者常使用促酒精代謝藥物加速乙醛、酮體排泄，以及使用促醒藥物、鎮(zhèn)靜劑、胃黏膜保護劑、血液凈化療法、（誤吸后）抗生素抗感染、維持水電解質(zhì)平衡、糾正血糖、（腦水腫）予脫水劑等對癥支持治療[1]，但對AAI的預防沒有良好措施。中藥葛根、葛花、甘草等單味藥，葛花解酲湯等經(jīng)方，對預防醉酒有明確療效記載[3]，其解酒作用已被現(xiàn)代藥理學實驗證實[4-6，10-11]。本研究所使用的明趕飲方中陳皮為君，理氣健脾和胃；臣以決明子平抑肝陽、清肝明目，牡蠣軟堅散結(jié)，化胸脅痞積；佐以荷葉升清化濕和胃，趕黃草利尿醒酒；生甘草為使調(diào)和諸藥。

本實驗根據(jù)BRANDONWARNER E[9]對嚙齒動物模型的研究，選取大鼠（無嘔吐反射）制作AAI模型。參考對AAI大鼠動物模型、中藥治療AAI模型大鼠的研究[10-11]，本研究亦采用一次性灌胃過量酒精的方式建立大鼠AAI模型。在陽性對照藥的選擇上，選用同類研究較多的海王金樽（牡蠣大豆肽肉堿口服液）[15-16]，其主要成分為多肽、?；撬?、左旋肉堿[17-18]，其中多肽成分可有效抗氧化提高肝組織ADH活性并降低丙二醛水平，對化學性肝損傷有一定保護作用[19]。提前30 min藥物干預、50%食用酒精的實驗設(shè)計，意在模擬人類飲酒規(guī)律、用藥習慣，使得實驗更具參考價值。在本研究檢測指標方面，行為學實驗（翻正反射）可直接反映藥物干預對酒后不適癥狀的緩解程度；不同時間段的血乙醇濃度檢測可動態(tài)觀察乙醇在血液中的濃度變化，ADH活性可直接反映乙醇代謝效率，對監(jiān)測乙醇在生物體內(nèi)代謝情況均有重要意義；肝細胞凋亡是過度飲酒后酒精性肝損傷的主要病理特征[4-6]，AST、ALT、TBil、DBil等肝功能指標可評價肝臟的損害程度，有效證明藥物對酒后肝損害的保護作用。

本研究結(jié)果表明，飲酒前使用明趕飲可使大鼠延遲進入醉酒狀態(tài)，更快從醉酒狀態(tài)清醒，從而顯著縮短醉酒時間；可于醉酒后顯著降低血乙醇濃度，其中高劑量明趕飲在飲酒初期即可發(fā)揮良好的降低血乙醇濃度的功效；可顯著改善酒精對大鼠肝細胞的損害，對急性酒精中毒大鼠肝功能有顯著保護作用；可顯著提高AAI模型大鼠ADH活性，以高效降低血乙醇濃度，從而改善醉酒狀態(tài)，加快醒酒，保護肝功能。高劑量明趕飲對本研究指標的改善普遍優(yōu)于陽性藥物和明趕飲低劑量，明趕飲高劑量為臨床常規(guī)劑量，佐證了臨床用藥的有效性。

綜上，明趕飲對預防、緩解急性酒精中毒有明確療效，具有解酒、保肝作用，其可能的機制為提高ADH活性。后續(xù)動物實驗可以從酒精性脂肪肝、酒精性肝炎方面繼續(xù)研究明趕飲對酒精致病類模型動物客觀指標的改善作用，可利用質(zhì)譜組學技術(shù)研究明趕飲的主要成分和物質(zhì)基礎(chǔ)，深入探討其對模型動物治療作用的潛在分子機制，進而為明趕飲的臨床使用提供客觀的科學依據(jù)?！八幨惩础泵髭s飲制劑的開發(fā)符合當前公共衛(wèi)生問題需求，是“治未病”理論創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化的成功實踐，值得進一步研究及推廣。