腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞聯(lián)合殘余腫瘤負(fù)荷在乳腺癌新輔助化療中的預(yù)后價(jià)值及意義

鐘燕燕，王進(jìn)京，鐘戀君，羅 帥，鄭 洪

乳腺癌作為全球癌癥死亡的第二大因素，其病死率占所有癌癥死亡原因的11.6%[1]。殘余腫瘤負(fù)荷(residual cancer burden, RCB)指數(shù)考慮了殘留腫瘤床、殘余腫瘤細(xì)胞比例和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等多種情況，可對乳腺癌患者術(shù)后進(jìn)行殘余疾病評估[2]。鑒于新輔助化療后仍有較多乳腺癌患者不能達(dá)到病理完全緩解(pathological complete response, PCR)(PCR指乳腺癌原發(fā)灶及腋窩淋巴結(jié)手術(shù)標(biāo)本病理檢查均未見浸潤性腫瘤細(xì)胞殘余)，采用RCB系統(tǒng)分層評估成為病理精準(zhǔn)診斷的重要內(nèi)容[3]。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)是有效且持續(xù)的抗腫瘤反應(yīng)的關(guān)鍵性基礎(chǔ)，腫瘤周圍微環(huán)境中的TILs也被認(rèn)為在腫瘤免疫機(jī)制中起著免疫應(yīng)答和調(diào)控作用[4-5]。RCB系統(tǒng)只考慮了殘余疾病情況，并未對宿主免疫應(yīng)答情況進(jìn)行考察，這有可能會對預(yù)后分析的準(zhǔn)確性造成一定程度的偏差，而RCB與TILs的結(jié)合將會為我們帶來更多有效的預(yù)后信息。本實(shí)驗(yàn)將RCB和TILs結(jié)合，定義為“RCB-TILs”指標(biāo)，分析驗(yàn)證該指標(biāo)與乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為預(yù)測臨床療效提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2019年10月遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科存檔的空心針穿刺病理活檢診斷為浸潤性乳腺癌，并接受新輔助化療后行手術(shù)切除的乳腺癌患者106例，所有病例均經(jīng)兩位以上有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)專家確診。收集其臨床和病理資料，包括患者年齡、組織學(xué)特征、免疫表型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及存活時(shí)間等，存檔蠟塊組織健全。

1.2 乳腺癌分子分型根據(jù)ER、PR、HER-2和Ki-67的免疫表型，將乳腺癌分為4個(gè)亞型：管腔A型(ER/PR陽性，且PR陽性率≥20%，HER-2陰性且Ki-67增殖指數(shù)<20%)、管腔B型(ER/PR陽性，HER2陰性，Ki-67增殖指數(shù)≥20%或PR陽性率<20%；ER/PR陽性，HER-2陽性及Ki-67增殖指數(shù)任何表達(dá)水平)、HER2過表達(dá)型(ER/PR陰性，HER-2陽性)和三陰型(ER、PR及HER-2均陰性)。本實(shí)驗(yàn)將管腔A型和管腔B型歸為激素受體陽性乳腺癌(hormone receptor positive breast cancer, HRBC)。ER、PR、HER-2和Ki-67免疫組化結(jié)果判讀及分子分型參照最新對應(yīng)指南進(jìn)行[6-8]。

1.3 RCB的組織病理學(xué)評估RCB由MD Anderson腫瘤中心提出，根據(jù)原發(fā)腫瘤(原發(fā)腫瘤床面積、腫瘤細(xì)胞占瘤床百分比和原位癌百分比)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(陽性淋巴結(jié)數(shù)量和最大轉(zhuǎn)移直徑)的數(shù)據(jù)自動計(jì)算RCB[9]。RCB計(jì)算公式為：RCB=1.4(浸潤癌所占比例×原發(fā)灶腫瘤直徑)0.17+[4(1-0.75轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目)×淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移最大徑]0.17。根據(jù)計(jì)算結(jié)果將RCB分為三類：微小殘留疾病(RCB-Ⅰ)、中度殘留疾病(RCB-Ⅱ)或廣泛殘留疾病(RCB-Ⅲ)。由于RCB-Ⅰ被認(rèn)為比RCB-Ⅱ和RCB-Ⅲ具有更好的預(yù)后，因此將RCB-Ⅰ歸為陽性，RBC-Ⅱ和RCB-Ⅲ歸為陰性。

1.4 TILs的組織病理學(xué)評估根據(jù)乳腺癌免疫腫瘤學(xué)生物標(biāo)志物工作組的報(bào)告[10]，在術(shù)前經(jīng)空心針穿刺病理標(biāo)本的HE染色切片上評估腫瘤基質(zhì)TILs。以所研究視野的比例表示，在400倍放大倍數(shù)下評估單核炎性細(xì)胞占腫瘤基質(zhì)面積的百分比，原位癌和擠壓偽影等區(qū)域不包括在內(nèi)。浸潤性腫瘤細(xì)胞巢周圍單核炎性細(xì)胞浸潤與基質(zhì)面積比例分別按>50%、10%～50%和≤10%進(jìn)行分類。>50%、10%～50%歸為TILs陽性，≤10%歸為陰性。

1.5 RCB-TILs評估RCB和TILs評估相結(jié)合，創(chuàng)建了“RCB-TILs”。RCB陽性且TILs陽性的患者被視為RCB-TILs陽性，任意RCB和(或)TILs陰性均被視為RCB-TILs陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用Pearson Chi-Square檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行分類變量相關(guān)性分析。采用Kaplan-Meier法評估無瘤生存期(disease free survival, DFS)，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素和多因素生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征乳腺癌新輔助化療前空心針穿刺及配對的新輔助化療后手術(shù)標(biāo)本TILs的HE染色如圖1所示，合計(jì)106例，均為女性患者。其中HRBC 66例，HER-2過表達(dá)型乳腺癌(HER-2 positive breast cancer, HER2BC) 24例，三陰型乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)16例。平均年齡(47.3±9.4)歲(29～72歲)。在接受新輔助化療的患者中，34例(32.1%)為RCB-TILs陽性，72例(67.9%)為陰性。依據(jù)術(shù)后病理狀態(tài)將乳腺癌患者分為病理完全緩解(pathological complete response, PCR)組和非病理完全緩解(non-pathological complete response, non-PCR)組。其中18例(17.0%)為PCR，88例(83.0%)為non-PCR。

2.2 RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系在新輔助化療后的乳腺癌組織中，RCB-TILs陽性與乳腺癌腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯及病理狀態(tài)具有相關(guān)性(P<0.05)。RCB-TILs陽性患者占腫瘤直徑<2 cm組及腫瘤直徑>2 cm組的比例分別為50%(16/32)和24.3%(18/74)，前組是后組的2.06倍，RCB-TILs陽性患者腫瘤直徑<2 cm可能性更大；RCB-TILs陽性患者占無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的比例分別為52.5%(32/61)和4.4%(2/45)，前組是后組的11.9倍，RCB-TILs陽性患者更不易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；RCB-TILs陽性患者占無脈管侵犯組及有脈管侵犯組比例分別為36.7%(33/90)和6.2%(1/16)，前組是后組的5.9倍，RCB-TILs陽性患者更不易發(fā)生脈管侵犯；RCB-TILs陽性患者占PCR組及non-PCR組的比例分別為72.2%(13/18)和23.9%(21/88)，前組是后組的3.02倍，RCB-TILs陽性患者更易獲得PCR。RCB-TILs陽性與患者年齡、Ki-67增殖指數(shù)及組織學(xué)分級無關(guān)(P>0.05，表1)。

ABC

表1 RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

2.3 RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系隨訪106例患者，中位隨訪時(shí)間34個(gè)月(3～75個(gè)月)，其中85例患者存活且未發(fā)生病變復(fù)發(fā)、惡化、轉(zhuǎn)移等，21例無瘤生存。根據(jù)RCB-TILs狀態(tài)進(jìn)行DFS分析，結(jié)果顯示新輔助化療后乳腺癌RCB-TILs陽性患者的DFS長于RCB-TILs陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049 9，圖2)。

圖2 RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 Cox單因素及多因素生存分析新輔助化療后乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)因素Cox單因素分析顯示，患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、分子分型、病理狀態(tài)、Ki-67增殖指數(shù)、RCB-TILs狀態(tài)、TILs強(qiáng)度均對患者DFS無明顯影響(P>0.05)；Cox多因素分析顯示，RCB-TILs陽性是經(jīng)新輔助化療患者的有利因素，結(jié)果表明與RCB-TILs陰性相比，RCB-TILs陽性更有助于延長患者的DFS(HR=0.068，P=0.003，表2)。

表2 乳腺癌患者預(yù)后的Cox單因素和多因素生存分析

3 討論

乳腺癌的新輔助化療方法已被廣泛接受并應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)一個(gè)精準(zhǔn)有效的指標(biāo)預(yù)測新輔助化療預(yù)后對乳腺癌患者臨床后續(xù)診療評估至關(guān)重要。RCB可以準(zhǔn)確識別出具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的TNBC及HER2BC患者[11]。RCB分類越高，后續(xù)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散的可能性越大，可以為新輔助化療后non-PCR患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)做一系列的連續(xù)性預(yù)測，成為乳腺癌預(yù)后評估更加準(zhǔn)確的方式[12-14]。

研究表明，乳腺癌組織中高TILs浸潤表現(xiàn)出更好的預(yù)后，并且還可以通過TILs的浸潤程度評估新輔助化療的治療效果[15]。經(jīng)新輔助化療的原發(fā)性TNBC中治療前高TILs與PCR率的增加、更長的DFS和總生存期(overall survival, OS)具有相關(guān)性[16]。作為預(yù)測新輔助化療療效指標(biāo)，PCR有助于預(yù)測TNBC和HER2BC患者預(yù)后，但有研究指出其不作為預(yù)測HRBC的生存指標(biāo)，同時(shí)，在對治療反應(yīng)的預(yù)測中，TILs也僅能預(yù)測TNBC和HER2BC對新輔助化療的反應(yīng)[17]。Laas等[18]研究發(fā)現(xiàn)，將TILs評估聯(lián)合RCB評分可有效提高RCB評估系統(tǒng)的預(yù)測效能。

本實(shí)驗(yàn)將RCB和TILs結(jié)合，分析RCB-TILs在乳腺癌新輔助化療中的預(yù)后作用及臨床意義。有研究顯示RCB-TILs是新輔助化療后所有浸潤型乳腺癌復(fù)發(fā)的重要預(yù)測因子，可能成為代表新輔助化療療效的有效指標(biāo)，且RCB-TILs陽性TNBC患者占比更多，HRBC患者占比更少，與RCB-TILs陰性患者相比，陽性患者更易獲得PCR[19]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致。本實(shí)驗(yàn)Cox多因素分析顯示，RCB-TILs陽性是行新輔助化療患者的有利因素，Kaplan-Meier分析顯示RCB-TILs陽性患者的DFS更長。Pinard等[20]的研究結(jié)果亦證實(shí)RCB指數(shù)和CD4+TILs的組合有助于改善新輔助化療后TNBC患者預(yù)后的預(yù)測能力。TNBC殘余疾病中TILs的水平與新輔助化療后乳腺癌患者RFS和OS改善明顯相關(guān)，并且為RCB指數(shù)增加了進(jìn)一步的預(yù)后信息[21]。且RCB-TILs受試者工作特征曲線分析表明，RCB-TILs對所有乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)測能力均優(yōu)于TILs和RCB，RCB-TILs陽性有助于延長所有患者DFS，可能成為新輔助化療后乳腺癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測因素[19]。除此之外，RCB-TILs陽性患者的腫塊更小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管侵犯更少。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合新輔助化療前TILs浸潤情況，RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯等具有相關(guān)性，其可能成為新輔助化療后乳腺癌DFS的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，對臨床后續(xù)的診療及評估具有指導(dǎo)意義。