具有鐵螯合能力的驢骨膠原肽酶解條件優(yōu)化及微觀形態(tài)

毛嘉敏，陳昱瑤，宋 潔，張 燕，王婧賢，李馨雨，范柳萍，成向榮

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

驢產(chǎn)業(yè)是我國名優(yōu)新特產(chǎn)業(yè)，正處于發(fā)展的重要戰(zhàn)略機遇期，逐漸向肉用、藥用、保健及生物制品開發(fā)等多用途的“活體經(jīng)濟”轉(zhuǎn)變[1]。驢的眾多副產(chǎn)品中，驢骨性平、味甘，入脾、肝、腎經(jīng)，具有滋陰補腎，強筋壯骨的功效[2]。驢骨不僅含有豐富的鈣質(zhì)，還含有骨蛋白、骨多肽、骨多糖，以及磷、鎂、錳、鋅、銅等骨生長必需的全骨營養(yǎng)素[3]。其中驢骨膠原多肽在食品、化妝品行業(yè)都具有較大的應(yīng)用前景。在目前國內(nèi)消費市場上，大多數(shù)驢骨膠原多肽的開發(fā)利用以補充膠原蛋白和鈣質(zhì)為主要方向，制備生產(chǎn)相應(yīng)的驢骨膠原鈣片、驢骨膠原肽粉等[4-5]，鮮有研究關(guān)注驢骨膠原特征氨基酸對其他微量元素的潛在作用。

鐵是人體必需的微量元素之一，影響人體各代謝通路，鐵攝入不足或吸收受到抑制時會發(fā)生缺鐵性貧血（iron deficiency anemia，IDA），出現(xiàn)疲勞、虛弱等臨床癥狀[6-7]。針對缺鐵的主要飲食策略是補充與強化[8]。在各類補鐵劑中，多肽鐵螯合物可通過肽轉(zhuǎn)運體系被機體吸收，因其較高的生物利用度與較低的副作用成為當前研究開發(fā)的熱點[9]。曹叢叢[10]的研究表明，阿膠在消化過程中產(chǎn)生的活性肽能夠與鐵離子螯合，形成的螯合物可有效促進鐵離子的吸收，具備潛在的補血活性。進一步動物試驗研究證明，這一螯合物可以提高鐵的生物利用率并改善機體鐵穩(wěn)態(tài)，有效改善IDA[11]，同時改善IDA小鼠的腸道炎癥，緩減IDA引起的腸道菌群失調(diào)[12]。另外，研究發(fā)現(xiàn)[13]，驢骨膠和驢皮膠的膠原蛋白基本相同，同宗同源，但具體氨基酸含量有所差異，驢骨膠總蛋白含量高，為 75.3%，對比驢皮膠為 75.1%，與補血、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的氨基酸（甘氨酸、脯氨酸、賴氨酸、丙氨酸）含量更高。

基于前期研究，我們推測驢骨膠原肽是一種潛在的活性成分，與驢皮膠類似，具有螯合保護亞鐵離子、促進亞鐵離子吸收的作用。因此，本研究采用酶解法制備驢骨膠原肽，并采用正交法優(yōu)化酶解條件，探究其與亞鐵離子的螯合能力，以期為后續(xù)探究驢骨膠原肽的潛在補血活性奠定基礎(chǔ)，為開發(fā)驢骨膠原肽相關(guān)產(chǎn)品提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

剔肉驢骨段：市場購置；胰蛋白酶（1∶250）、木瓜蛋白酶（≥800 U/mg）、堿性蛋白酶（≥200 U/mg）、復(fù)合蛋白酶（≥120 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（≥20 U/mg）：阿拉丁生物科技有限公司；濃鹽酸、石油醚、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、冰醋酸、抗壞血酸、七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、鄰菲羅啉、無水乙醇等試劑均為分析純：國藥化學(xué)試劑有限公司；BCA試劑盒：翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

破骨機：河北德科機械科技有限公司；KJ-300超聲波發(fā)生器：無錫市科潔超聲電子設(shè)備有限公司；高壓滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；Centrifuge 5430R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；HH-3A恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；ST3100 pH計：常州奧豪斯儀器有限公司；Epoch酶標儀：美國 Biotek公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機：寧波新芝生物股份有限公司；冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡：日本株式會社日立高新技術(shù)公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 驢骨粉的制備

取解凍后的驢骨段，去除骨髓，并浸入5%（w/v）NaOH溶液中1 h，且骨與溶液之比為1∶2（w/v）。浸泡完畢后，用去離子水反復(fù)洗滌3次并除去附著于骨段的肉，待骨段晾干至恒重后稱量。將骨段與沸程為60～90 ℃的石油醚以1∶2（w/v）的比例混合，每2 h更換溶劑并去除油脂。油脂去除后，用去離子水洗滌骨段3次并在干燥器中晾至骨段表面無明顯水分殘留后，使用 0.5 mol/L鹽酸溶液以1∶10料液比對骨段進行脫鈣處理，每三天更換一次鹽酸，共更換三次。將脫脂、脫鈣后的骨段使用粉碎機粉碎，放入烘箱中，在37 ℃下烘干至恒重并稱量。驢骨粉避光保存于干燥器中。

1.3.2 驢骨蛋白酶解預(yù)處理

為了提高酶解效率，需要對蛋白質(zhì)作變性預(yù)處理，該研究采用熱處理法。烘干后的驢骨粉與蒸餾水以1∶20的比例進行混合，在沒有酶參與的條件下，于121 ℃的高壓滅菌鍋中，對其進行加熱預(yù)處理。分別處理0、10、20、30、40 min。隨后離心，取上清液使用 BCA法測蛋白濃度，以確定最佳熱處理時間。

1.3.3 驢骨酶解液的制備

取適量高溫蒸煮過的驢骨液于4 ℃，6 000 r/min下離心20 min，取上清液20 mL于50 mL離心管中，添加相應(yīng)量的蛋白酶，并調(diào)節(jié)溫度和pH值，酶解相應(yīng)時間后高溫滅酶，冷卻至室溫后，于4 ℃，4 000 r/min離心20 min得到上清液，用0.45 μm水系微孔濾膜過濾得到濾液，即驢骨酶解液。

1.3.4 驢骨膠原肽鐵螯合物的制備

取2 mL驢骨酶解液放入離心管中，空白組取2 mL同等條件下保溫的驢骨原液，調(diào)節(jié)pH至5.5，加入1 mL乙酸鈉緩沖溶液，為防止Fe2+被氧化，加入200 μL抗壞血酸溶液（20 mg/mL），然后加入 1 mL FeSO4·7H2O 溶液（100 μg/mL），于恒溫振蕩器中保持37 ℃螯合30 min。

1.3.5 螯合率的測定

參考曹叢叢[10]鄰菲羅琳比色法測亞鐵離子含量的方法并稍作改進。

1.3.5.1 標準曲線的繪制 配制 10 μg/mL FeSO4·7H2O 溶液，分別取 0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0 mL于10 mL離心管中，加水稀釋至6 mL，而后依次加入20 mg/mL抗壞血酸0.2 mL，乙酸鈉緩沖液1 mL，0.5%鄰菲羅啉0.4 mL，混勻，加水稀釋至10 mL。靜置反應(yīng)15 min，吸取200 μL至96孔板中，用酶標儀測定在510 nm波長下的吸光值。以吸光度值作為縱坐標，F(xiàn)e2+濃度作為橫坐標，繪制Fe2+濃度標準曲線，并計算線性回歸方程，得到回歸方程y=0.102 8x-0.006 3，R2=1。

1.3.5.2 樣品鐵螯合率的測定 取螯合完成的樣品，加入400 μL鄰菲羅琳溶液，用去離子水定容至10 mL，混合，靜置15 min，測定在510 nm波長下的吸光值。根據(jù)標準曲線與樣品吸光值計算樣品在體系中的濃度。

螯合率計算公式為：

式中：X為螯合率；C1為空白阿膠體系中的游離亞鐵離子濃度；C2為樣品體系中的游離亞鐵離子濃度。

1.3.6 最適蛋白酶篩選

取適量高溫蒸煮過的驢骨液于4 ℃，6 000 r/min下離心20 min，取上清液20 mL于50 mL離心管中，分別添加等酶活的復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶，在各自最佳酶解溫度和pH值下，酶解3 h后，制備驢骨膠原肽鐵螯合物并測定驢骨肽與亞鐵離子螯合率，以螯合率為主要指標，得到酶解效果最好的蛋白酶。各蛋白酶的最適溫度、pH見表1。

表1 各蛋白酶的最適溫度、pHTable 1 Optimum temperature and pH of each protease

1.3.7 最佳蛋白酶單因素酶解實驗

確定最佳蛋白酶后，選取酶底比、酶解pH、酶解溫度、酶解時間四個因素對進行考察。

1.3.7.1 酶底比對螯合率的影響 固定反應(yīng)條件酶解時間3 h、溫度50 ℃、pH=7.0，設(shè)定酶底比為750、1 000、1 250、1 500、1 750 U/mL，以亞鐵離子螯合率為主要考察指標，酶解制備驢骨膠原蛋白肽，與亞鐵離子進行螯合，探究酶底比對螯合率的影響。

1.3.7.2 酶解 pH對螯合率的影響 固定反應(yīng)條件酶解時間3 h、溫度50 ℃、酶底比為1 250 U/mL，設(shè)定酶解pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以亞鐵離子螯合率為主要考察指標，酶解制備驢骨膠原蛋白肽，與亞鐵離子進行螯合，探究酶底比對螯合率的影響。

1.3.7.3 酶解溫度對螯合率的影響 固定反應(yīng)條件酶解時間3 h、酶解pH 7.0、酶底比為1 250 U/mL，設(shè)定酶解溫度為 30、40、50、60、70 ℃，以亞鐵離子螯合率為主要考察指標，酶解制備驢骨膠原蛋白肽，與亞鐵離子進行螯合，探究酶底比對螯合率的影響。

1.3.7.4 酶解時間對螯合率的影響 固定反應(yīng)條件酶解溫度50 ℃、酶解pH 7.0、酶底比為1 250 U/mL，設(shè)定酶解時間為1、2、3、4、5 h，以亞鐵離子螯合率為主要考察指標，酶解制備驢骨膠原蛋白肽，與亞鐵離子進行螯合，探究酶底比對螯合率的影響。

1.3.8 正交法優(yōu)化酶解條件

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，考慮交互作用的影響，設(shè)計四因素三水平的正交實驗，選用 L27（313）正交表進行相應(yīng)的正交實驗，計算每次實驗驢骨膠原肽和亞鐵離子的螯合率，設(shè)計如表2。

表2 螯合正交因素水平表Table 2 Chelate orthogonal factor level table

1.3.9 螯合產(chǎn)物形態(tài)與微觀結(jié)構(gòu)表征

將最優(yōu)配方得到的螯合產(chǎn)物冷凍干燥后放置陰涼、密閉環(huán)境下儲存。拍照記錄產(chǎn)物形態(tài)；采用冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM）掃描，分別放大1 000倍、5 000倍觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理以及作圖，正交法優(yōu)化采用SPSS 26.0，數(shù)據(jù)為3次實驗的平均值。顯著性分析采用單因素方差分析，Duncan多重比較檢驗，以P＜0.05表示為差異顯著，用小寫字母a、b、c、d表示差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 驢骨蛋白酶解預(yù)處理時間的確定

高溫蒸煮可使驢骨中的蛋白溶出，這可能是由于骨蛋白受熱變性，內(nèi)部非極性基團暴露到分子表面，增強了骨蛋白的水溶性[14]。同時，熱預(yù)處理會導(dǎo)致分子間和分子內(nèi)的重排，暴露隱藏的裂解位點，增加水解部位，利于酶解[15]。

由圖1可知，隨著預(yù)處理時間的延長，酶解驢骨蛋白的蛋白濃度逐漸增高，在121 ℃下高溫加熱30 min時蛋白濃度達到最高。超過該時間，蛋白濃度逐漸下降，原因可能為高溫加熱時間過長使大多數(shù)蛋白質(zhì)發(fā)生變性，其分子內(nèi)部和分子間發(fā)生聚合，形成了不溶解的產(chǎn)物。張永秀等[16]以牛骨粉為原料，發(fā)現(xiàn)經(jīng)121 ℃，30 min的加熱預(yù)處理能顯著提高蛋白質(zhì)水解度和氮溶出率，與本實驗結(jié)果類似，說明蛋白質(zhì)在不同變性程度時對水解度影響很大，變性程度過高反而不利于水解。因此確定驢骨蛋白酶解預(yù)處理條件為在121 ℃下高溫加熱30 min。

圖1 不同預(yù)處理時間的蛋白液吸光度和蛋白濃度Fig.1 Absorbance and protein concentration of protein solution at different pretreatment times

2.2 最適蛋白酶篩選

酶解是制備降血壓肽、抗氧化肽、免疫肽等生物活性肽的有效方法。酶解可以改善食品的功能特性，而不影響其營養(yǎng)價值[17]。由于酶的不同切割特異性，選擇合適的蛋白水解酶至關(guān)重要，這會影響蛋白肽的釋放量[18]。由圖2可知，5種不同的食品級蛋白酶在各自最適反應(yīng)條件下反應(yīng)，保持酶活相同，對驢骨蛋白的水解能力不同，酶解后的產(chǎn)物多肽與鐵的螯合率也不同。酶解得到的驢骨膠原肽與鐵螯合能力為：木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞堿性蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶＞復(fù)合蛋白酶。木瓜蛋白酶為含疏基肽鏈內(nèi)切酶，能適當降解結(jié)締組織、膠原蛋白及彈性蛋白，其酶解 pH范圍為5～11，在酸性、中性、堿性環(huán)境下均能分解蛋白[19]，跨度較大，利于設(shè)變量梯度。結(jié)合酶解效果，選擇木瓜蛋白酶進行下一步實驗。

圖2 不同蛋白酶酶解效果比較Fig.2 Comparison of enzymatic hydrolysis effects of different proteases

2.3 木瓜蛋白酶酶解條件優(yōu)化

2.3.1 酶底比對螯合率的影響

不同酶底比對鐵螯合率的影響如圖3所示。由圖可知，酶底比在750～1 000 U/mL的范圍內(nèi)，螯合率隨著酶添加量的增多幾乎不變，無顯著差異（P＞0.05），在1 250 U/mL時螯合率出現(xiàn)最大值，顯著高于其他組螯合率水平（P＜0.05），而后螯合率不斷下降。這可能是由于酶底比小于1 000 U/mL時，酶與底物接觸點較少，水解出的多肽含量低，螯合位點少[20]。隨著加酶量不斷增加，多肽含量增加，螯合位點增加，但是當加酶量達到飽和之后, 酶會繼續(xù)水解小分子蛋白質(zhì)及多肽，蛋白質(zhì)水解會更加徹底，從而導(dǎo)致多肽含量的降低，螯合位點減少[21]，故最適酶底比為1 250 U/mL。

圖3 不同酶底比對螯合率的影響Fig.3 Effect of different enzyme substrate ratios on chelation rate

2.3.2 酶解時間對螯合率的影響

不同酶解時間對螯合率的影響如圖4所示。在酶解時間為1～3 h的范圍內(nèi)，鐵螯合率基本不變，無顯著差異（P＞0.05），在4 h時鐵螯合率最大，顯著高于其他組（P＜0.05），4 h后鐵螯合率逐漸降低。其原因可能在于反應(yīng)初期，底物質(zhì)量濃度較高，蛋白酶與底物蛋白有充足的位點相互結(jié)合，暴露出較多的酶切位點，有利于蛋白酶進行酶切，從而產(chǎn)生多肽，提供了大量的螯合位點[22]。此外酶切位點的暴露需要時間，但是當酶解時間過長時，多肽進一步被水解成氨基酸，多肽產(chǎn)率降低，螯合位點減少。同時，隨著酶解時間的增加，底物特異性位點基本被完全反應(yīng)，繼續(xù)反應(yīng)不會導(dǎo)致額外的活性基團暴露。因此，最適酶解時間選擇4 h。

圖4 不同酶解時間對螯合率的影響Fig.4 Effect of different enzymolysis time on chelation rate

2.3.3 酶解溫度對螯合率的影響

不同酶解溫度對鐵螯合率的影響如圖 5所示。溫度在30～40 ℃范圍內(nèi)，鐵螯合率隨溫度升高而顯著提高（P＜0.05），在40 ℃達到最大值后下降。這是因為在相對較低的溫度下，酶的活性較小，分子的動能較小，酶與底物之間的碰撞也較少，反應(yīng)效率低[23]。隨著溫度的升高，分子中的非共價鍵和二硫鍵逐漸斷裂，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的解聚和去折疊，有利于暴露更多酶切位點，從而產(chǎn)生更多具有免疫活性的肽段[15]。而當超過其最適溫度后，酶活性降低，導(dǎo)致酶解作用減弱。此時，過高的溫度開始引起底物逐漸變性（熱聚集），暴露出的酶切位點減少，具有鐵螯合能力的肽段減少，螯合能力下降。因此，最適酶解溫度選取40 ℃。

圖5 酶解溫度對螯合率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on chelation rate

2.3.4 酶解pH對螯合率的影響

作為生物催化劑，pH對蛋白酶的催化活性影響很大。研究表明，pH主要通過影響底物的解離狀態(tài)、酶的空間結(jié)構(gòu)、活性中心及與底物結(jié)合程度等影響酶解反應(yīng)。YU等[24]認為，蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)改變會引起更多的活性位點暴露；在一定的pH范圍內(nèi)，底物蛋白中的肽鍵被破壞會產(chǎn)生一些抗氧化水解物，可以增加DPPH自由基清除活性。

不同酶解pH對鐵螯合率的影響如圖6所示。蛋白酶作為生物活性物質(zhì)，具有發(fā)揮作用的最適pH范圍，過酸和過堿都會使得酶活力下降，致使多肽產(chǎn)率降低，螯合位點減少。在 pH高于實驗酶的最適 pH條件下，驢骨液中較多的 OH-可能會抑制水解反應(yīng)的發(fā)生，影響酶對蛋白質(zhì)的水解效果[25]。pH為 8時，水解效果最好，螯合率最高，因此最適酶解pH選擇8。

圖6 酶解pH對螯合率的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis pH on chelation rate

2.4 正交實驗

根據(jù)正交表安排實驗，同時留取3列空白，作為誤差估計。按正交表實施實驗，共27個組合，考察各組合的鐵螯合率。對正交實驗結(jié)果進行了極差和方差分析，見表3和表4。

表3 正交實驗極差分析表Table 3 Range analysis table of orthogonal test

表4 正交實驗結(jié)果方差分析表Table 4 Analysis of variance of orthogonal test results

本實驗指標為螯合率，要求越大越好。分析可得，因素A、AC具有顯著性（P＜0.05），其他因素對指標的影響不顯著，可忽略不計，并記入誤差。因素影響主次順序為A＞AC＞B＞D＞AB＞BC＞C，對于高度顯著的因素A，直接由K值判斷取A1為優(yōu)水平。其中AC交互項的影響因素比C要大，所以通過二元表獲得C的優(yōu)先水平，如表5所示。

表5 A、C交互作用二元表Table 5 A and C interaction binary table

A1C3螯合率最大，且與A因素選擇一致，所以C因素選取C3，根據(jù)K值，并結(jié)合生產(chǎn)實際，確定優(yōu)水平組合為A1B1C3D1，由于此組合在正交實驗中并沒有出現(xiàn)，進行模擬。比較發(fā)現(xiàn)螯合率為38.40%，高于表4中各組螯合率，這一表現(xiàn)也優(yōu)于同為產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)品的椰子球蛋白多肽（30.67%）[26]、滸苔多糖（19.6%）[27]等，具有一定的開發(fā)利用價值。因此得到最優(yōu)水平為A1B1C3D1，即酶底比1 000 U/mL，時間為3 h，溫度為50 ℃，pH 7.0。

2.5 螯合產(chǎn)物形態(tài)與微觀結(jié)構(gòu)表征

對螯合產(chǎn)物拍照觀察。如圖7所示，該產(chǎn)物表面疏松干燥，顆粒均勻，呈現(xiàn)棕褐色粉末狀結(jié)構(gòu)。

圖7 螯合產(chǎn)物外觀圖Fig.7 Appearance diagram of chelating product

使用冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡對螯合產(chǎn)物進行掃描，分別放大1 000倍和5 000倍，觀察其微觀形態(tài)，如圖8?？梢园l(fā)現(xiàn)，該產(chǎn)物的微觀結(jié)構(gòu)為疏松多孔的片狀結(jié)構(gòu)，孔洞大小較為均勻，但片狀大小不一，可能是在冷凍干燥過程中產(chǎn)生了斷裂。

圖8 螯合產(chǎn)物的電鏡掃描圖（1 000倍、5 000倍）Fig.8 Scanning electron micrographs of chelated products(1 000 times, 5 000 times)

3 結(jié)論

本研究建立了一種酶解制備驢骨膠原肽的方法，通過單因素和正交優(yōu)化實驗，優(yōu)化了酶解條件，并考察了驢骨膠原肽與亞鐵離子的螯合能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱處理可以提高驢骨蛋白肽的產(chǎn)率，121 ℃蒸煮處理30 min，可以得到溶出蛋白含量最高的驢骨蛋白溶液。使用木瓜蛋白酶，在酶底比1 000 U/mL、酶解pH 7.0、酶解溫度50 ℃時酶解 3 h，得到與亞鐵離子螯合能力最強的驢骨膠原肽，螯合率達到38.40%。對螯合產(chǎn)物進行冷凍干燥，此時產(chǎn)物為疏松的棕褐色粉末狀，其微觀形態(tài)呈現(xiàn)疏松多孔的片狀結(jié)構(gòu)。對驢骨膠原肽酶解條件的優(yōu)化有利于提高酶解效率，使其表現(xiàn)出更高的鐵螯合能力和促鐵吸收潛力。這為后續(xù)研究驢骨膠原肽與亞鐵離子的螯合機制以及產(chǎn)物功效評價奠定了基礎(chǔ)。