羊奶凍干粉中恩諾沙星基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

劉天和, 武彩紅, 左偉勇, 杜汶伸, 曹習(xí)超, 魏寧

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院, 江蘇泰州, 225300）

0 引言

在獸藥殘留分析過(guò)程中由于受樣品本身差異性的影響, 純標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比, 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能夠更好的滿足獸藥殘留檢測(cè)的需要。近年來(lái), 世界各國(guó)頒布的有關(guān)于農(nóng)、獸藥殘留分析的指導(dǎo)性文件, 如歐盟決議2002/657/EC, 明確指出需要采用基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制, 所以基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在獸藥殘留檢測(cè)中具有十分重要的作用[1]。在獸藥殘留分析中, 樣品基體涉及到各種動(dòng)物組織及加工食品, 分析基體本身的差異性使得在分析過(guò)程中不能只簡(jiǎn)單地使用純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 而需要用基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)滿足進(jìn)一步的檢測(cè)需要[2,15]。

現(xiàn)如今, 隨著老百姓生活水平的提高, 奶制品在人們的飲食結(jié)構(gòu)中越來(lái)越重要, 除了牛奶以外羊奶在我國(guó)的需求量也逐年攀升, 相關(guān)數(shù)據(jù)顯示, 當(dāng)前我國(guó)的羊奶市場(chǎng)消費(fèi)規(guī)模已經(jīng)突破百億, 年均增速在25%以上。恩諾沙星是世界上第一個(gè)動(dòng)物專用的氟喹諾酮類藥物, 對(duì)于牛、羊、豬、禽由細(xì)菌引起的消化道感染、呼吸道感染和支原體病等都有很好的療效。其給藥方式多樣, 可混飲、可注射、可內(nèi)服。由于恩諾沙星具有抗菌譜廣、殺菌活性強(qiáng)、體內(nèi)分布廣泛的特點(diǎn), 所以獸醫(yī)臨床上大量使用, 同時(shí)也出現(xiàn)了恩諾沙星在動(dòng)物源性食品中超標(biāo)現(xiàn)象, 其中牛奶和羊奶中殘留超標(biāo)的事件也有報(bào)道。我國(guó)對(duì)牛羊奶中的恩諾沙星最高限量為100μg/kg[3]。就國(guó)內(nèi)而言, 我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制還是剛剛起步, 特別是獸藥基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 無(wú)論種類還是數(shù)量均十分的缺乏, 遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)實(shí)需求。羊奶凍干粉中恩諾沙星基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制力求為羊奶實(shí)際樣品中恩諾沙星殘留量的準(zhǔn)確檢測(cè)提供穩(wěn)定的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Waters ACQUITY Arc高效液相色譜儀（配PDA-2998二極管陣列檢測(cè)器）, 美國(guó)Waters公司；SECURA124-1CN精密電子天平, Sartorius公司；Milli-Q Direct 7純水儀, 美國(guó)Milipore公司；SevenExcellence S400 pH計(jì), 瑞士METTLER TOLEDO公司；R300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀, 瑞士BUCHI公司；20孔固相萃取裝置, 美國(guó)Waters公司；5804R高速冷凍離心機(jī), 德國(guó)Eppendorf公司；FreeZone（2.5L）真空冷凍干燥機(jī), 美國(guó)Labconco公司；N-EVAP-24氮吹儀, 美國(guó)Qrganomation Associates公司；HD-2500多管渦旋振蕩器, 杭州佑寧儀器有限公司；KQ-800ES超聲波清洗器, 昆山市超聲儀器有限公司；HYC-650醫(yī)用冷藏箱、DW-25L262醫(yī)用低溫保存箱, 青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司。

恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.7%）, 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；乙腈（色譜純）, Thermo Fisher Scientific公司；甲醇（色譜純）, Thermo Fisher Scientific公司；磷酸（分析純）、三乙胺（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、正丙醇（分析純）、正己烷（分析純）, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；C18固相萃取柱（6 cc/500 mg）, 美國(guó)Waters公司；2.5%恩諾沙星注射液（規(guī)格：10 mL∶0.25 g）, 新鄉(xiāng)市華畜商貿(mào)有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

選取健康且在泌乳期的奶山羊3只, 體重在60±3.5 kg左右（江蘇泰州西來(lái)原生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司）, 按照0.1 mL/kg量在奶山羊的頸部肌肉注射2.5%恩諾沙星注射液[4]。給藥前將奶山羊單獨(dú)飼養(yǎng), 給藥前3天每天按正常時(shí)間, 上、下午各采1次羊奶, 前4把羊奶棄掉, 3天的羊奶混裝?？瞻籽蚰绦枰M(jìn)行恩諾沙星含量檢測(cè)和乳房炎檢測(cè), 確定無(wú)恩諾沙星殘留和乳房炎癥狀后, 第4天開始給藥, 注射部位為頸部肌肉, 注射4 h后開始擠奶, 上午和下午采集的牛奶都需分裝, 采集好的牛奶在-20℃冷凍保存。測(cè)得羊奶樣品中恩諾沙星含量為122μg/kg, 然后使用空白羊奶將樣品濃度稀釋到100μg/kg左右。藥物含量檢測(cè)方法參考《GB 29692-2013牛奶中喹諾酮類藥物多殘留的測(cè)定高效液相色譜法》和已報(bào)道的檢測(cè)方法[5,16-17]。

1.3 凍干粉的混勻與分裝

隨后將稀釋好的羊奶樣品均勻分裝到西林瓶中, 每瓶11.2 g, 隨后將分裝好的樣品放置到真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干, 并采用橡膠塞和鋁殼進(jìn)行封裝, 放置到-20℃冰箱保存, 需要檢測(cè)時(shí)每瓶?jī)龈煞奂?0.00 mL純水進(jìn)行復(fù)溶[6]。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)

按照J(rèn)JG 1006-1994《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》對(duì)均勻性檢驗(yàn)的要求, 總體樣本數(shù)500份情況下, 查閱隨機(jī)數(shù)表隨機(jī)抽取15瓶, 對(duì)所取每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次[7]。按照單因素方差分析法對(duì)該套標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性評(píng)價(jià), 單因素方差分析方法是用來(lái)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均勻性的最常用方法, 是通過(guò)組間方差和組內(nèi)方差的比較來(lái)判斷各組測(cè)量值之間有無(wú)系統(tǒng)性差異, 如果兩者的比小于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的臨界值, 則認(rèn)為樣品是均勻的[18]。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗(yàn)

穩(wěn)定性檢驗(yàn)包括短期穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性的檢驗(yàn), 本研究在短期穩(wěn)定性的檢驗(yàn)過(guò)程中結(jié)合運(yùn)輸環(huán)境和極端貯存條件對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià), 將樣品通過(guò)快遞郵寄的方式寄到深圳、拉薩、蘭州這3個(gè)城市, 分別在25、-20, 4℃環(huán)境下貯存兩周時(shí)間。長(zhǎng)期穩(wěn)定性的檢驗(yàn)考察樣品在-20、-80℃兩個(gè)貯存溫度下樣品在12個(gè)月內(nèi)恩諾沙星含量的穩(wěn)定性情況, 監(jiān)測(cè)時(shí)間分別為0、1、4、8、12個(gè)月, 每次檢測(cè)隨機(jī)取3份樣品, 平行檢測(cè)3次, 取其平均值。JJF 1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》規(guī)定長(zhǎng)期穩(wěn)定性的評(píng)估通常取5或6個(gè)時(shí)間點(diǎn), 短期穩(wěn)定性通常取3～5個(gè)時(shí)間點(diǎn), 短期和長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)都遵循先密后疏的原則[8]。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值與不確定度評(píng)估

JJF 1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》規(guī)定[8], 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量的標(biāo)準(zhǔn)值一般代表當(dāng)前對(duì)其“真值”的最佳估計(jì)。樣品通過(guò)均勻性檢驗(yàn)后, 進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析處理即為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值。

JJF 1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》規(guī)定[8], 對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果, 其不確定度由三部分組成, 第一部分為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不均勻性引起的不確定度；第二部分為有效期內(nèi)的變動(dòng)引起的不確定度；第三部分為定值過(guò)程引起的不確定度。將定值不確定度與均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)引入的不確定度按照平方和開方的方法疊加就給出總不確定度, 記為uCRM。該合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以因子（該因子稱為包含因子, 記為k）得出的不確定度為擴(kuò)展不確定度或稱總不確定度, 記為U。在給出擴(kuò)展不確定度時(shí)應(yīng)指明包含因子的數(shù)值, 該值與要求的置信概率與自由度有關(guān)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

本研究通過(guò)肌肉注射的方式給藥對(duì)泌乳期的奶山羊給藥, 使恩諾沙星自然代謝到羊奶中。注射藥物為2.5%恩諾沙星注射液（規(guī)格：10 mL, 0.25 g）, 給藥量為0.1 mL/kg, 實(shí)際給藥濃度為2.5 mg/kg[4]。給藥4 h后開始擠奶, 獲得的樣品羊奶混合, 進(jìn)行恩諾沙星含量檢測(cè), 檢測(cè)值為122μg/kg, 隨后將使用空白羊奶將藥物濃度稀釋到目標(biāo)濃度100μg/kg左右。將羊奶樣品進(jìn)行分裝、凍干、密封保存、隨后進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、定值和不確定度評(píng)估。

乳品常用的干燥方法主要是噴霧干燥法和真空冷凍干燥法, 噴霧干燥法由于其設(shè)備熱效率低, 設(shè)備體積較大, 儀器價(jià)格昂貴, 不適用實(shí)驗(yàn)研究[14]。真空冷凍干燥法將溶液狀態(tài)的產(chǎn)品經(jīng)冷凍處理后, 先后經(jīng)過(guò)升華和解吸作用, 使產(chǎn)品中的溶劑減少到一定程度, 從而阻止微生物的生成或溶質(zhì)與溶劑間的化學(xué)反應(yīng), 真空冷凍干燥可以去除樣品中95%的水分, 最大限度的保證樣品的原有活性和品質(zhì)[9-11]。對(duì)于熱敏性較差的生物制品, 生化類制品, 血液制品, 基因工程類制品特性量值的均勻性、穩(wěn)定性有最佳保證, 對(duì)于不穩(wěn)定、易降解的藥物來(lái)說(shuō), 真空冷凍干燥是一種較實(shí)用的干燥技術(shù)[12]。冷凍干燥時(shí)的工藝流程主要包括3個(gè)步驟, 依次是預(yù)凍、升華干燥、解析干燥[25], 本研究羊奶樣品凍干條件為冷肼溫度-80℃, 真空度10～20 Pa, 凍干時(shí)間72 h。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)

樣品的均勻性評(píng)估采用單因素方差分析法進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì), 查閱隨機(jī)數(shù)表, 從500份樣品中抽取15份樣品進(jìn)行均勻性檢測(cè), 每一份樣品重復(fù)檢測(cè)3次[19]。按照方差分析法對(duì)該套標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性評(píng)價(jià), 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 羊奶凍干粉中恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)結(jié)果μg/kg

根據(jù)JJF 1343-2012標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理要求[8], 在置信區(qū)間為95%, F0.05（14,30）=2.04, 經(jīng)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得到的F值=1.92＜F0.05（14, 30）, 可認(rèn)為羊奶凍干粉中恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是均勻的。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗(yàn)

2.3.1 短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性評(píng)價(jià)主要是模擬在不同的運(yùn)輸、保存條件中外界環(huán)境對(duì)恩諾沙星含量的影響。本研究充分考慮到運(yùn)輸過(guò)程中的各種影響因素, 溫度、濕度、震蕩、溫度變化等, 將樣品用快遞分別寄到深圳、拉薩、蘭州, 這3個(gè)溫度環(huán)境和地理位置差異性比較大的城市, 并分別在25, -20, 4℃溫度下保存2周（從快遞到達(dá)目的地開始）, 這樣既考察了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在運(yùn)輸環(huán)境下的穩(wěn)定性又考慮在不同貯存條件下的穩(wěn)定性, 這也是本研究在考察短期穩(wěn)定性上的一個(gè)創(chuàng)新。由表2檢測(cè)結(jié)果可知, 在95%置信水平, 短期穩(wěn)定性結(jié)果良好, 在3種儲(chǔ)存環(huán)境下羊奶凍干粉中的恩諾沙星能保持穩(wěn)定。

表2 羊奶凍干粉中恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果μg/kg

2.3.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

長(zhǎng)期穩(wěn)定性的考察, 在實(shí)驗(yàn)中選定了-20、-80℃2個(gè)貯存溫度作為考察對(duì)象, 2個(gè)溫度下的樣品放置12個(gè)月, 測(cè)定樣品中藥物的含量, 監(jiān)測(cè)時(shí)間分別為0、1、4、8、12個(gè)月（時(shí)間段為2021年1月～2022年1月）, 每次檢測(cè)隨機(jī)取3份樣品, 平行檢測(cè)3次, 取其平均值[20]。選用線性模型對(duì)其進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)價(jià), 表3檢測(cè)結(jié)果表明羊奶凍干粉中恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量在12個(gè)月內(nèi)沒(méi)有明顯的的變化, 變化范圍均在特性量值及不確定度范圍內(nèi)[24]。因此可得到結(jié)論, 將含恩諾沙星的羊乳制成凍干粉后, 藥物比較穩(wěn)定, 在12個(gè)月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的降解。

表3 羊奶凍干粉中恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果 μg/kg

（續(xù)表3）

2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

羊奶凍干粉中恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值由8家具有相關(guān)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室協(xié)同定值[13]。各實(shí)驗(yàn)室均使用同一批次的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 8家實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包裝單元進(jìn)行高效液相色譜法恩諾沙星含量檢測(cè), 每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次[21-23], 對(duì)測(cè)得的8組數(shù)據(jù)先利用柯克倫(Cochran)準(zhǔn)則判斷這8組數(shù)據(jù)中哪一組為可疑數(shù)據(jù), 然后利用狄克遜法(Dixon)對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)是否存在離群值, 如果存在, 可進(jìn)行剔除, 數(shù)據(jù)經(jīng)處理后余下的正常數(shù)據(jù)求其平均值[8]。定值結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 羊奶凍干粉中恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值數(shù)據(jù)

2.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度評(píng)估

羊奶凍干粉中恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度主要由三部分組成。第一部分是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性造成的不確定度；第二部分是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的有效期內(nèi)變動(dòng)造成的不確定度；第三部分是定值過(guò)程中造成的不確定度。

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性引起的不確定度

均勻性引起的相對(duì)不確定度：

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性引起的不確定度

短期穩(wěn)定性引起的不確定度：

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值引起的不確定度

定值引起的相對(duì)不確定度：

2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成不確定度

羊奶凍干粉中恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總不確定度uCRM由公式計(jì)算：

3 結(jié)論

在殘留檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中, 一些藥物與基質(zhì)的實(shí)際結(jié)合方式并非簡(jiǎn)單的添加, 人為添加的方式始終是模擬藥物與基質(zhì)的天然結(jié)合, 在添加的過(guò)程中往往會(huì)受到一些因素干擾。本研究采用給藥代謝的方式獲得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的候選物, 最大限度的保證了藥物與基質(zhì)本身的天然結(jié)合, 使得在進(jìn)行藥物殘留檢測(cè)時(shí)能夠排除其他干擾因素, 獲得的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性、穩(wěn)定性良好, 通過(guò)8家有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值并對(duì)其不確定度進(jìn)行評(píng)估, 最終得到其特征值為101.08±2.7μg/kg（k=2）。羊奶凍干粉中恩諾沙星基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制, 為恩諾沙星的檢測(cè)提供了實(shí)物基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 滿足了恩諾沙星殘留檢測(cè)中質(zhì)量控制和方法學(xué)驗(yàn)證的需求, 為檢測(cè)結(jié)果的溯源性、可靠性和可比性提供了保障。