紫連膏家兔皮膚重復(fù)給藥4周毒性研究

楊宏博，葉建州，梅晶，袁芳，劉明超，劉紅斌，李勇，師廷川，王京昆?

（1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室，云南 昆明 650111；3.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650111）

紫連膏（Zilian Cream）又名黃金萬紅膏，是云南省中醫(yī)醫(yī)院臨床應(yīng)用30 多年的經(jīng)驗方，由紫草、黃連、生地黃、當(dāng)歸、黃芩、虎杖、生地榆、冰片等中藥及基質(zhì)（白凡士林）組成，方中紫草清熱解毒、生肌斂瘡，入血分，可升可降；黃連清熱燥濕、瀉火解毒，質(zhì)堅味厚，降而微升；生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰生津，三者共為君藥。黃芩清熱燥濕、瀉火解毒；生地榆涼血止血，助君藥加強清熱解毒、斂瘡止痛之功，為臣藥。當(dāng)歸補血活血，虎杖活血散瘀、解毒消腫，為佐藥。冰片善通諸竅、散郁火、辟穢濁，清熱消毒止痛為使藥。全方共奏清熱解毒、涼血消斑、活血止痛、祛腐生肌、燥濕收斂之功效［1］。該藥作為云南省中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑已獲批準(zhǔn)［批準(zhǔn)文號：滇藥制字（Z）20082571A］，其膏呈紫紅色，均勻細膩，主要用于治療燙傷、燒傷、銀屑病、嬰兒尿布皮炎（嬰兒紅臀）等屬熱毒內(nèi)盛者［2-3］。

目前，關(guān)于紫連膏研究多集中在臨床療效和適應(yīng)證上，如耳廓濕疹［4］、糖尿病足皮膚?。?］、Ⅱ期壓瘡［1］、張力性水皰［6］等，而對其臨床使用是否具有毒性作用（副反應(yīng)）以及其嚴(yán)重程度的研究尚不深入，目前文獻中還未見其相關(guān)報道。在研究完成紫連膏經(jīng)皮膚單次給藥毒性的基礎(chǔ)上，本課題組在通過國家認證的GLP條件下，進一步對其經(jīng)完整皮膚重復(fù)給藥4 周的慢性毒性進行研究，通過研究了解受試物在家兔體內(nèi)可能產(chǎn)生的毒性作用特點及可逆性、延遲毒性等特征，分析判斷其可能的毒性靶器官/靶組織，從而為臨床用藥安全及不良反應(yīng)監(jiān)測提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

電子天平（美國雙杰兄弟集團有限公司常熟市雙杰測試儀器廠，型號：TC-30K）；血液分析儀（Siemens Healthcare Diagnoseics.Inc，型號：ADVIA 2120）；凝血分析儀（DIAGNOSTICA STAGO.Inc，型號：STA Compact）；全自動生化分析儀（Beckman Coulter.Inc，型號：Unicel DxC600）；十六道生理信號采集分析系統(tǒng)（美國BIOPAC 公司，型號：MP150）；生物顯微鏡（廣州市明美光電技術(shù)有限公司，型號：ML31）；病理切片掃描系統(tǒng)（寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司，型號：KFPRO-005）；動物麻醉機（上海任誼生物科技有限公司，型號：MSS-4S）。

1.2 藥物及試劑

紫連膏（云南省中醫(yī)醫(yī)院，批號：20200604，20 g/盒，含量：每1.0 g 相當(dāng)于飲片0.3 g，按滇ZJGF-396-2019 標(biāo)準(zhǔn)檢測，符合標(biāo)準(zhǔn)要求）；白凡士林（江西益普生藥業(yè)有限公司，批號：20200901）；異氟烷（天津普瑞生物藥業(yè)有限公司，批號：20191201）。

1.3 實驗動物

普通級新西蘭家兔40只，4～5月齡，雌雄各半，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，購于山東艾萊克生物科技有限公司，許可證號：SCXK（魯）20190006，質(zhì)量合格證編號：370839210100001742。全部家兔飼養(yǎng)于通過國家GLP認證的普通環(huán)境動物實驗室內(nèi)，采用50 cm×40 cm×40 cm（長×寬×高）不銹鋼干養(yǎng)式實驗籠單籠飼養(yǎng)，每日每只家兔投放80 g兔生長繁殖飼料，自由攝食飲水。溫度16～26 ℃（最大日溫差≤4 ℃），濕度40%～70%，換氣次數(shù)≥8 次/h，氣流速度≤0.2 m/s，氨濃度（動態(tài)）≤14 mg/m，光照12 h/12 h明暗交替，動物照度100～200 lx，工作照度≥200 lx，噪聲≤60 dB；直徑90 mm 平皿敞開放置0.5 h，置37 ℃溫箱培養(yǎng)48 h，≤30個/皿。

試驗動物使用過程均符合動物福利要求，并通過實驗動物管理和使用委員會（IACUC）的審查批準(zhǔn)，審查編號：動（倫）IACUC-2021-003-01。

2 方法

2.1 對照品的選擇

白凡士林作為紫連膏制劑唯一的基質(zhì)成分，因其具有良好的防水性，對任何類型的皮膚都沒有刺激性［7］，是一種非常好的保濕用品，同時作為藥用及化妝品輔料，廣泛用于制備藥膏、皮膚保護油膏、化妝品乳膏、香脂化妝油等［8］，故本研究僅以市售白凡士林作為輔料對照，不再單獨設(shè)陰性對照。

2.2 動物分組

參照國家食品藥品監(jiān)督管理總局制定的《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》和《藥物重復(fù)給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，選擇一般健康狀況及去毛處皮膚情況良好的成年新西蘭家兔40 只，用Excel 進行隨機區(qū)組設(shè)計法將家兔分為4 組，即輔料對照組和紫連膏低、中、高劑量組，各組動物體質(zhì)量差異均不超過單性別動物平均體質(zhì)量的20%，每組10 只，雌雄各半。

2.3 劑量設(shè)置及依據(jù)

依據(jù)紫連膏說明書的用法、用量，用于燒傷、燙傷和銀屑病，每天最大用量為0.1 g/cm2，每天2 次，間隔8 h。其中，治療燒傷、燙傷使用2 周，治療銀屑病使用3周。課題組以往已經(jīng)完成了家兔每次以50.0 mg/cm2劑量于10%體表面積的背部皮膚涂擦紫連膏，24 h內(nèi)涂擦3次，每次間隔（4.0±0.5）h的單次毒性試驗實驗，以及家兔每次以50.0 mg/cm2劑量于10%體表面積的背部皮膚涂擦紫連膏，24 h 內(nèi)涂擦2 次，每次間隔（4.0±0.5）h的重復(fù)給藥7 d毒性試驗。

兩個試驗研究結(jié)果表明，紫連膏對完整皮膚家兔均未表現(xiàn)出明顯的毒性反應(yīng)作用。因此，為充分暴露受試物的毒性，盡可能獲得受試物的最大劑量下的毒性信息，依據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局制定的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》，在本研究中紫連膏低、中、高3個劑量組均于動物最大可給予的10%體表面積［9］，每次分別以15.0、32.5、50.0 mg/cm2單位面積劑量涂擦紫連膏，24 h 內(nèi)給予2 次。輔料對照組給予與紫連膏高劑量組面積、容積及次數(shù)相同的白凡士林。給藥面積以5 cm2作為動物給藥的最小精度面積，給藥面積計算方法見公式（1）［10］。劑量設(shè)置情況具體見表1。

表1 各組劑量設(shè)置情況

其中，A為體表面積（m2），W為體質(zhì)量（kg），K為體型系數(shù)（家兔為0.101 4）。

2.4 動物去毛

使用電推剪緊貼皮膚直接去除動物背毛。動物分組前進行首次去毛，去毛面積較大于給藥面積，從而保證為覆蓋物預(yù)留足夠的固定面積。給藥期及恢復(fù)期每周去毛1～2 次，具體依據(jù)是否影響給藥及局部皮膚刺激性觀察而定。

2.5 動物給藥

于首次給藥前以及給藥后每個周期（7 d）的固定時間稱量動物體質(zhì)量，以此計算下一周期動物的給藥量，期間內(nèi)給藥劑量不變。每次給藥前準(zhǔn)確稱量藥物，均勻緩慢涂擦于相應(yīng)給藥面積的去毛背部皮膚上，隨后用空白膏藥貼覆蓋，固定給藥部位，并同時用脖圈固定動物頭部，保證樣品與皮膚充分接觸。各組動物每天給藥2 次，每次藥物停留時間（4.0 ± 0.5）h，結(jié)束后取下脖圈，使用醫(yī)用干棉球反復(fù)輕擦去除受試物，至擦除干凈為止。按以上操作，連續(xù)給藥4周［11］。

2.6 指標(biāo)檢測方法和頻率

2.6.1 一般臨床癥狀、體征以及給藥局部刺激性

給藥前，每天觀察動物一般癥狀、體征1 次。給藥期間，每次給藥后立即連續(xù)觀察動物反應(yīng)1 h，并在擦除受試物0.5 h 后至下一次給藥前，觀察給藥局部皮膚刺激反應(yīng)情況?；謴?fù)期間，每天觀察動物一般癥狀、體征以及給藥局部刺激性反應(yīng)情況2 次，連續(xù)4 周。觀察內(nèi)容包括家兔外觀、行為、分泌物、排泄物、給藥局部情況、死亡情況及中毒反應(yīng)癥狀及其起始時間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時間、是否可逆及恢復(fù)時間等。具體如下：

①外觀、體征情況：口、眼、鼻分泌物（顏色），角弓反張、驚跳反射，皮膚、黏膜潮紅（部位），呃逆、流涎（顏色、質(zhì)地），紅斑、丘疹（部位），紫紺（部位），瘙癢、腫脹（部位），尿液和糞便的變化（顏色、性狀），豎毛、昏迷、休克，大、小便失禁，死亡等；

②行為、活動狀況：俯臥、運動失調(diào)、步態(tài)不穩(wěn)、活動減少、無法站立、抽搐、驚厥、角弓反張、震顫、麻痹、劇烈掙扎、反抗尖叫等；

③精神狀態(tài)：興奮、煩躁、困倦、萎靡等；

④呼吸情況：呼吸困難、呼吸暫停、呼吸急促、喘息、腹式呼吸等；

⑤給藥局部情況：給藥部位皮膚情況、有無刺激反應(yīng)等，主要包括局部皮膚有無紅斑、水腫、結(jié)痂等。具體參照皮膚刺激性試驗中“皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)”和“皮膚刺激強度評價標(biāo)準(zhǔn)”［12-13］對動物給藥局部反應(yīng)情況進行評價。

計算方法見公式（2），情況見表2、表3。

表2 皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)

表3 皮膚刺激強度評價標(biāo)準(zhǔn)

其中，M平為每組動物每次刺激反應(yīng)的平均積分；A為總積分，即組內(nèi)每只動物每次各皮膚刺激反應(yīng)評分之和；n為組內(nèi)動物只數(shù)。

2.6.2 攝食量

各組動物按A、B、C三級半定量法進行評價。A級：全部吃完或僅剩少量食物；B 級：剩余1/3～1/2 食物；C級：未吃或僅吃少量食物。試驗期間，每天上午喂飼前評價1次，并在每一個周期（7 d）進行1次總評價。

2.6.3 體質(zhì)量

給藥前、給藥期和恢復(fù)期間，每周固定時間稱重1次。

2.6.4 體溫

獸用體溫計測量動物肛溫，給藥前測量1 次，給藥期和恢復(fù)期的第2、4周各測量1次。

2.6.5 心電（ECGⅡ）

給藥前、給藥期第4 周和恢復(fù)期第4 周各檢測1 次。ECGⅡ指標(biāo)包括：P 波振幅（mV）、ST 偏移量（mV）、R波振幅（mV）、T波振幅（mV）、心率（HR，次/min）和RR間期（s）。

2.6.6 血常規(guī)及血清生化、電解質(zhì)

給藥前、給藥期第4周及恢復(fù)期第4周分別采集家兔耳中央動脈血液，每次采血動物需提前禁食不禁水12～15 h，待確定所有動物血樣滿足檢測要求后再進行喂飼。具體檢測內(nèi)容包括：

①血液學(xué)指標(biāo)：用EDTA-K2管采集血液樣本2.0 mL，分別測定血紅蛋白（HGB）、平均紅細胞血紅蛋白（MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）。

②凝血指標(biāo)：用檸檬酸鈉管采集血樣2.0 mL，分別測定凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）。

③血清生化及電解質(zhì)指標(biāo)：用全血管采集全血3.0～5.0 mL，分別測定γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、甘油三酯（TG）、血糖（GLU）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸磷酸激酶（CK）、肌酐（CREA）。

2.6.7 系統(tǒng)解剖和肉眼觀察

4 周給藥結(jié)束后，各組動物自第1 只開始，間隔選擇處死3 只，共12 只。4 周恢復(fù)期結(jié)束后，處死剩余全部動物。各動物在解剖前需禁食不禁水12～15 h，按解剖順序吸入異氟烷麻醉，待動物達到深度麻醉后，大腿雙側(cè)股動脈放血處死。解剖時，肉眼觀察家兔外觀、毛色、給藥局部皮膚、外生殖器等有無異常，臟器有無病變。再按由上至下，從外到內(nèi)的順序分別摘取動物各臟器和解剖前大體觀察時發(fā)現(xiàn)的異常組織、腫塊等。臟器摘取后，除眼（連帶哈氏腺）用改良Davidson's 液固定、睪丸及附睪用Bouin 液固定外，其余各臟器、組織置于10%中性緩沖福爾馬林液中固定，以備后續(xù)切片、HE染色和組織病理學(xué)檢查。

2.6.8 臟器重量、系數(shù)及臟腦比

解剖后，分別稱取腦、心、肝、脾、肺臟、左腎、右腎、腎上腺（雙側(cè)）、胸腺、左睪丸、右睪丸、附睪（雙側(cè)）、子宮、卵巢及輸卵管的重量，并計算腎臟（左腎+右腎）、睪丸（左睪丸+右睪丸）的重量和臟器系數(shù)，若臟器系數(shù)組間比較有顯著性差異或有明顯改變，則需進一步計算臟器與腦重比值。

2.6.9 骨髓象檢查

摘取家兔胸骨，制作骨髓標(biāo)本，對骨髓細胞指標(biāo)進行計數(shù)檢查。具體檢查指標(biāo)如下：

①粒細胞系統(tǒng)：原始粒、早幼粒、中性粒（中幼、晚幼、桿狀、分葉核）、嗜酸性粒（中幼、晚幼、桿狀、分葉）和嗜堿性粒（中幼、晚幼、桿狀、分葉）；

②紅細胞系統(tǒng)：原始紅、早幼紅、中幼紅和晚幼紅；③其他：淋巴細胞、單核細胞、漿細胞、巨核細胞、增生程度、粒細胞系統(tǒng)/有核紅以及細胞形態(tài)。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)組間比較時，正態(tài)分布、方差齊性檢驗結(jié)果顯著（P＞0.05）的數(shù)據(jù)，采用LSD檢驗，非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)以及加權(quán)后的半定量指標(biāo)均采用非參數(shù)檢驗（即Nonparametric Test 中的K-independent samples 進行Kruskal～Wallis H檢驗），以P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義?；謴?fù)期各組動物樣本數(shù)量較少（♀/♂：2/2），故在統(tǒng)計時僅計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，不進行顯著性差異分析。

3 結(jié)果

3.1 各組家兔一般癥狀、體征情況

在給藥及恢復(fù)期間觀察可見，輔料對照組及紫連膏低、中、高劑量組各動物皮毛光澤、行為活動、精神狀態(tài)、呼吸情況等均無異常，一般狀況良好，由此表明紫連膏對家兔一般癥狀、體征無明顯影響。

3.2 各組家兔給藥局部皮膚刺激性癥狀比較

給藥期間，輔料對照組各動物給藥部位皮膚一般狀況良好，無紅斑、水腫等局部皮膚刺激性反應(yīng)癥狀。紫連膏高劑量組個別動物在給藥第4 周出現(xiàn)輕度水腫皮膚刺激反應(yīng)癥狀。從觀察到紅斑或/和水腫刺激反應(yīng)癥狀的動物數(shù)量和嚴(yán)重程度上看，紫連膏的皮膚刺激性具有隨著劑量增加和給藥時間持續(xù)而隨之增加的趨勢。停藥恢復(fù)期，出現(xiàn)紅斑或/和水腫刺激反應(yīng)的動物癥狀逐漸減輕，恢復(fù)正常。同時，從皮膚刺激反應(yīng)評分統(tǒng)計結(jié)果可見，紫連膏高劑量組最高平均積分為0.90，處于輕度刺激性（0.5～2.99）的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。由此可見，紫連膏高劑量對家兔完整皮膚表現(xiàn)出輕度刺激性。因恢復(fù)期剩余動物局部皮膚刺激性反應(yīng)癥狀評價的平均積分，不能代表各組動物皮膚刺激性反應(yīng)的整體情況，故以總積分表示。見表4。

表4 各組家兔給藥局部皮膚刺激性反應(yīng)癥狀積分比較

3.3 各組家兔攝食量評價

給藥前、給藥期及恢復(fù)期間，各組動物攝食正常，可見紫連膏對家兔的攝食量無明顯影響。

3.4 各組家兔體質(zhì)量及增長幅度比較

給藥前飼養(yǎng)期，紫連膏低、中、高劑量組動物平均體質(zhì)量均有明顯增加，表明動物處于正常生長狀態(tài)。給藥期間，紫連膏各劑量組動物平均體質(zhì)量呈現(xiàn)先降后升的狀態(tài)，其增長幅度均以給藥后第1 周下降最為明顯，至給藥第4 周結(jié)束，各組動物平均體質(zhì)量及增長幅度均明顯增加。恢復(fù)期，各動物體質(zhì)量生長正常。與輔料對照組比較，給藥第4 周時紫連膏低、中劑量組增長幅度明顯更高（P＜0.01），其原因主要是由于動物對給藥方式的應(yīng)激反應(yīng)所致，之后隨著給藥時間的不斷增加，動物逐漸適應(yīng)，應(yīng)激反應(yīng)逐漸消失。因此可以認為紫連膏對家兔體質(zhì)量無明顯影響。見圖1。

3.5 各組家兔體溫情況比較

紫連膏各劑量組給藥前、給藥期以及恢復(fù)期間，每只家兔的體溫實測值及其平均值均在正常體溫范圍（38.0～39.8 ℃）［14-15］內(nèi)波動，其中給藥第2周時，以輔料對照料組和紫連膏高劑量組下降較為明顯，近于正常體溫下限38.0 ℃。與輔料對照組比較，紫連膏低、中劑量組體溫明顯更高（P＜0.01）。出現(xiàn)該波動變化的原因推測為與給藥容量相關(guān)，隨著給藥容量的增加，動物的應(yīng)激反應(yīng)隨之增加，使體溫出現(xiàn)明顯下降，隨著給藥時間的持續(xù)，動物逐漸產(chǎn)生適應(yīng)性，自身對體溫調(diào)節(jié)作用增強，因此在給藥期結(jié)束時，家兔體溫接近給藥前，恢復(fù)期結(jié)束時與給藥前持平。在給藥期結(jié)束時，各組平均體溫均有所升高，恢復(fù)期間與給藥前基本一致，因此可以認為紫連膏對家兔體溫?zé)o明顯影響。見圖2。

3.6 各組家兔心電（ECG Ⅱ）指標(biāo)比較

給藥4周和恢復(fù)4周結(jié)束，紫連膏低、中、高劑量組ECG Ⅱ以振幅相關(guān)指標(biāo)及RR 間期、心率（HR）指標(biāo)波動較為明顯，但從統(tǒng)計結(jié)果上看，各指標(biāo)均無明顯劑量-反應(yīng)的規(guī)律性變化趨勢。與輔料對照組比較，紫連膏低、中劑量組ST 偏移量明顯偏低（P ＜0.05，P ＜0.01），但未見明顯的異常ST 段正向或負向偏移和特征性形態(tài)學(xué)變化，因此認為產(chǎn)生以上明顯波動變化的指標(biāo)應(yīng)與動物自身的生理波動直接相關(guān)，而與藥物無明顯相關(guān)性。由此可見紫連膏對家兔ECG Ⅱ各指標(biāo)無明顯影響。見表5。

表5 各組家兔心電指標(biāo)比較（±s）

表5 各組家兔心電指標(biāo)比較（±s）

注：與輔料對照組比較，★P ＜0.05，★★P ＜0.01。

組別輔料對照組紫連膏低劑量組紫連膏中劑量組紫連膏高劑量組心率（HR）（次/min）201.9±50.2 260.8±35.7 199.7±34.5 220.1±31.1 255.5±40.8 216.5±23.5 249.2±47.0 274.6±26.4 289.8±6.5 244.6±42.7 261.6±40.0 264.9±20.0時間給藥前給藥期第4周恢復(fù)期第4周給藥前給藥期第4周恢復(fù)期第4周給藥前給藥期第4周恢復(fù)期第4周給藥前給藥期第4周恢復(fù)期第4周例數(shù)10 10 4 10 10 4 10 10 4 10 10 4 P波振幅（mV）0.061±0.026 0.102±0.046 0.075±0.039 0.085±0.034 0.090±0.021 0.089±0.027 0.088±0.033 0.086±0.041 0.188±0.054 0.086±0.035 0.133±0.050 0.133±0.038 R波振幅（mV）0.234±0.130 0.363±0.214 0.291±0.196 0.287±0.151 0.339±0.149 0.321±0.149 0.348±0.134 0.369±0.188 0.298±0.126 0.302±0.198 0.305±0.085 0.261±0.055 T波振幅（mV）0.126±0.027 0.185±0.068 0.187±0.080 0.157±0.061 0.177±0.040 0.185±0.051 0.193±0.070 0.164±0.096 0.278±0.039 0.188±0.104 0.203±0.060 0.222±0.040 ST偏移量（mV）0.040±0.020 0.068±0.029 0.056±0.039 0.038±0.017 0.045±0.019★0.064±0.018 0.055±0.028 0.038±0.025★★0.077±0.010 0.053±0.035 0.061±0.023 0.088±0.039 RR間期（s）0.315±0.076 0.235±0.040 0.308±0.055 0.278±0.046 0.240±0.038 0.280±0.031 0.249±0.050 0.220±0.020 0.207±0.004 0.256±0.062 0.236±0.048 0.228±0.018

3.7 各組家兔血液學(xué)及凝血指標(biāo)比較

給藥第4周，紫連膏低、中、高劑量組的PT和APTT指標(biāo)表現(xiàn)出相對明顯的升高/下降趨勢變化，且具有明顯的劑量-反應(yīng)趨勢。與輔料對照組比較，紫連膏高劑量組PT明顯升高（P＜0.01）；紫連膏中劑量組MCHC明顯下降（P＜0.01），但無明顯劑量-反應(yīng)的規(guī)律性變化趨勢，且在其相關(guān)的HGB、MCH指標(biāo)中也未見相應(yīng)的變化趨勢，因此推測MCHC指標(biāo)在紫連膏中劑量組中產(chǎn)生的顯著性差異存在一定的偶然性，雖有統(tǒng)計學(xué)意義，但可認為無明顯的生理學(xué)意義?；謴?fù)期間，紫連膏各劑量組指標(biāo)也未見明顯異常變化。綜合上述結(jié)果認為，紫連膏對家兔PT和APTT凝血指標(biāo)可能存在一定的影響，且具有一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。見表6。

表6 各組家兔血液學(xué)及凝血指標(biāo)比較（±s）

表6 各組家兔血液學(xué)及凝血指標(biāo)比較（±s）

注：與輔料對照組比較，★P ＜0.05，★★P ＜0.01。

APTT（s）57.44±23.45 52.49±10.74 54.53±12.02 57.16±14.08 47.42±7.65 69.40±11.66 65.36±13.14 45.28±9.28 56.68±10.00 61.12±28.70 40.15±10.76★60.98±8.18組別輔料對照組紫連膏低劑量組紫連膏中劑量組紫連膏高劑量組時間給藥前給藥期第4周恢復(fù)期第4周給藥前給藥期第4周恢復(fù)期第4周給藥前給藥期第4周恢復(fù)期第4周給藥前給藥期第4周恢復(fù)期第4周例數(shù)10 10 4 10 10 4 10 10 4 10 10 4 HGB（g/L）126.0±12.0 118.3±18.4 127.5±5.5 126.9±10.9 126.6±9.8 125.8±9.1 135.2±13.4 117.8±9.1 124.5±3.7 131.5±14.8 120.6±12.2 121.8±14.1 MCH（pg）19.93±0.98 19.40±1.07 21.43±1.27 19.97±1.47 19.54±1.60 20.10±1.62 19.80±1.39 19.29±1.37 21.75±0.64 20.72±0.87 20.36±0.83 20.50±1.29 MCHC（g/L）306.0±14.4 315.8±8.4 330.0±8.0 309.7±14.2 316.7±5.4 327.0±12.4 311.5±11.4 306.4±8.7★★322.3±6.7 316.6±10.8 316.3±7.1 319.8±9.0 PT（s）7.58±0.37 7.23±0.43 7.58±0.13 7.66±0.22 7.27±0.36 7.38±0.13 7.59±0.28 7.54±0.42 7.38±0.13 7.96±0.67 7.79±0.28★★7.45±0.25

3.8 各組家兔血清生化及電解質(zhì)指標(biāo)比較

給藥第4 周，紫連膏低、中、高劑量組的GGT、CK和LDH指標(biāo)明顯下降，TG、CREA、GLU指標(biāo)明顯升高。與輔料對照組比較，紫連膏高劑量組的GLU 明顯升高，LDH 明顯下降（P＜0.05），且具有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，因此認為紫連膏對GLU 和LDH 指標(biāo)可能有一定影響，且以高劑量組較為明顯。見表8。

3.9 各組家兔骨髓象情況

給藥和恢復(fù)期結(jié)束后，紫連膏低、中、高劑量組動物有核細胞增生活躍，粒細胞系統(tǒng)、紅細胞系統(tǒng)以及其他細胞形態(tài)及計數(shù)均無明顯異常，表明紫連膏對家兔骨髓細胞增生及分化無明顯影響。

3.10 各組家兔系統(tǒng)解剖觀察情況

給藥及恢復(fù)期結(jié)束后解剖，除肉眼可見部分動物胸腺及睪丸、附睪外形體積偏小外，各動物臟器無其他明顯異常。從出現(xiàn)臟器異常的數(shù)量和性別差異上看，各劑量組間無明顯的劑量-反應(yīng)趨勢和性別-反應(yīng)趨勢，且與輔料對照組亦無明顯差異，結(jié)合組織病理學(xué)檢查結(jié)果，綜合分析認為上述異常臟器應(yīng)為動物本身自發(fā)病變或生理改變所致，非藥物對動物產(chǎn)生的影響。

3.11 各組家兔臟器重量和臟器系數(shù)情況

給藥結(jié)束后，紫連膏各劑量組動物胸腺、子宮、附睪（總）、左睪丸、右睪丸和睪丸（總）臟器重量及系數(shù)均表現(xiàn)出相對較大的波動變化，但無明顯的規(guī)律性。結(jié)合組織病理學(xué)檢查結(jié)果，綜合判斷認為該臟器重量及系數(shù)的波動變化應(yīng)屬于動物自身原因所致，與藥物影響無明顯相關(guān)性。因此認為紫連膏對家兔各臟器重量和系數(shù)無明顯影響。

3.12 各組家兔組織病理學(xué)檢查

給藥及恢復(fù)期結(jié)束后，紫連膏各劑量組有個別動物出現(xiàn)腎小管壞死、間質(zhì)炎細胞浸潤，肝細胞空泡變性、肝細胞小灶狀壞死，睪丸生精小管上皮空泡變性、生精細胞層次不全，附睪內(nèi)未見成熟精子，以及給藥部位棘細胞層增厚和真皮層炎細胞浸潤組織病理改變，且在給藥結(jié)束后，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)個別動物出現(xiàn)胸腺萎縮和給藥部位皮下肉芽組織形成的病理改變。上述鏡檢結(jié)果與解剖時肉眼觀察的異常臟器結(jié)果具有完全對應(yīng)關(guān)系。分析以上病變產(chǎn)生的原因，主要與動物自發(fā)性病變（腎臟、肝臟、睪丸和附睪）、年齡/健康狀態(tài)（胸腺）和反復(fù)涂擦操作物理刺激（棘細胞層增厚和皮層炎細胞浸潤）直接相關(guān)。病變檢查結(jié)果見圖3。從各劑量觀察到的病變程度和發(fā)生比例結(jié)果可見，組間無明顯的劑量-反應(yīng)趨勢，與輔料對照組比較，紫連膏各劑量組給藥后病變結(jié)果差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），可見紫連膏對家兔的各組織器官無明顯影響。

表7 各組家兔血清生化及電解質(zhì)指標(biāo)比較（±s）

表7 各組家兔血清生化及電解質(zhì)指標(biāo)比較（±s）

注：與輔料對照組比較，★P ＜0.05。

組別輔料對照組紫連膏低劑量組紫連膏中劑量組紫連膏高劑量組LDH（IU/L）226.0±135.8 219.5±124.9 91.5±44.3 189.2±124.9 180.6±72.4 105.3±40.3 213.7±176.9 150.7±96.2 86.8±46.9 191.6±135.5 103.4±57.6★94.5±46.3時間給藥前給藥期第4周恢復(fù)期第4周給藥前給藥期第4周恢復(fù)期第4周給藥前給藥期第4周恢復(fù)期第4周給藥前給藥期第4周恢復(fù)期第4周例數(shù)10 10 4 10 10 4 10 10 4 10 10 4 GGT（IU/L）7.8±3.2 12.7±8.2 8.8±3.5 6.9±1.4 8.2±4.7 6.8±1.3 7.0±2.3 8.6±2.5 8.0±2.9 6.1±1.9 7.7±2.1 8.0±2.9 TG（mmol/L）1.104±0.839 0.580±0.293 0.553±0.288 0.769±0.409 0.760±0.361 0.770±0.144 0.814±0.486 0.837±0.398 0.703±0.528 0.970±0.665 0.658±0.317 0.970±0.679 CREA（μmol/L）106.38±11.26 66.96±15.97 80.15±13.36 103.87±15.96 82.15±22.54 82.93±10.56 103.44±10.28 69.45±15.76 79.50±16.60 101.71±19.92 69.52±8.80 75.95±7.36 GLU（mmol/L）6.634±1.120 5.920±1.068 6.373±0.284 6.379±0.749 5.336±0.588 6.183±0.135 6.428±0.964 6.362±1.387 7.835±1.111 6.096±0.623 6.689±0.762★6.265±0.785 CK（IU/L）1 826.5±1 511.7 2 923.1±2 601.1 998.0±1 119.4 1 700.4±1 646.8 2 493.4±2 336.5 1 209.5±573.8 1 163.4±869.2 1 753.4±1 672.7 1 189.8±1 242.8 1 685.3±1 625.7 1 808.6±3 557.6 926.0±472.7

4 討論

紫連膏組方科學(xué)精妙，制劑工藝簡單可靠，用于治療燒傷、燙傷和銀屑病等皮膚性疾病，療效顯著。本研究依據(jù)《藥物重復(fù)給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》進行試驗設(shè)計，給藥采用與臨床擬用途徑一致的外用涂擦方式，實驗系統(tǒng)選擇體型小、性情溫和、易于馴化捉取、皮膚較薄且敏感、背景資料豐富、來源充足的家兔作為研究對象［16-17］，并以臨床上治愈燒傷、燙傷的擬用周期2周為依據(jù)，設(shè)置重復(fù)給藥周期4周。

在劑量設(shè)計上，重復(fù)給藥毒性試驗原則上至少應(yīng)設(shè)低、中、高3 個劑量組，以及1 個溶媒（或輔料）對照組；原則上要求高劑量使動物產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)，低劑量等于或高于動物藥效劑量或臨床使用劑量的等效劑量，中劑量應(yīng)結(jié)合毒性作用機制和特點在高劑量和低劑量之間設(shè)立，以考察毒性的劑量-反應(yīng)關(guān)系［18］。結(jié)合開展完成的以50.0 mg/cm2最大單位面積劑量的皮膚單次毒性和重復(fù)給藥7 d 毒性試驗無明顯毒性反應(yīng)的研究結(jié)果，綜合考慮本重復(fù)皮膚給藥毒性試驗設(shè)置，以50.0 mg/cm2作為每次皮膚涂擦給藥的高劑量，以臨床擬使用的15.0 mg/cm2劑量作為低劑量，并選擇處于低、高劑量之間的32.5 mg/cm2作為中劑量。

在研究過程中，通過觀察一般癥狀、體征，評價攝食量，測量體質(zhì)量、體溫、ECGⅡ、臟器重量，計算臟器系數(shù)，檢查血常規(guī)、血清生化及電解質(zhì)、骨髓象，以及解剖后的組織病理學(xué)等方法手段，考察紫連膏對完整皮膚家兔可能產(chǎn)生的毒性反應(yīng)情況，并將局部毒性安全性評價中的藥物刺激性試驗整合其中［19-21］，一并進行考察。結(jié)果表明，與輔料對照組比較，可見PT 和GLU（紫連膏中、高劑量組）明顯升高，APTT 和LDH 明顯下降，且表現(xiàn)出一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。其中，紫連膏高劑量組的GLU 和LDH 比較，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），PT具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

關(guān)于家兔給藥部位的刺激性，從局部皮膚刺激反應(yīng)觀察結(jié)果可見，紫連膏各給藥組家兔皮膚均觀察到紅斑，紫連膏高劑量組甚至有水腫出現(xiàn)，利用“皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)”和“皮膚刺激強度評價標(biāo)準(zhǔn)”對動物給藥局部刺激反應(yīng)情況進行評價，認為紫連膏高劑量組涂擦部位皮膚達到輕度刺激性的標(biāo)準(zhǔn)。通過組織病理學(xué)檢查結(jié)果可見，各劑量組給藥部位皮膚不同幾率地出現(xiàn)真皮層炎細胞浸潤和棘細胞層增厚的病理改變，病變程度及發(fā)生比例無明顯規(guī)律，其發(fā)生率、病變程度經(jīng)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），故認為紫連膏對家兔給藥部位皮膚無組織病理學(xué)意義上的皮膚刺激性。通過分析，雖肉眼觀察評價及組織病理學(xué)檢查均表明部分動物給藥部位皮膚均存在一定的刺激癥狀反應(yīng)，但由于皮膚產(chǎn)生的刺激反應(yīng)較輕，僅在肉眼評價上表現(xiàn)出輕度刺激性，還尚未達到排除操作產(chǎn)生的刺激因素外的組織病理學(xué)刺激性病變因素的組間差異程度，故兩種方法獲得的評價結(jié)果具有一定的差異。因此，從皮膚刺激的評價標(biāo)準(zhǔn)判斷，認為紫連膏高劑量可能對家兔涂擦部位皮膚產(chǎn)生輕度刺激性。

綜上所述，在本試驗條件下，紫連膏以終劑量50.0 mg/cm2（劑量為8.33 g/kg，相當(dāng)于人臨床最大擬用劑量的3.1 倍）給藥4 周，可對涂擦部位皮膚產(chǎn)生輕度刺激。在臨床應(yīng)用中，完整皮膚經(jīng)長期重復(fù)涂擦給藥后，應(yīng)重點監(jiān)測凝血指標(biāo)和LDH、GLU 指標(biāo)的變化，以及涂擦部位皮膚刺激反應(yīng)情況。另外，通過上述紫連膏的功能主治，且無破損皮膚的使用禁忌，故推測其在破損性皮膚疾病中也可使用，因此本團隊關(guān)于紫連膏對破損皮膚重復(fù)給藥毒性安全性也進行了研究，安全性評價結(jié)果將在另外一篇文章中進行報道。