阿克替苷通過激活血紅素加氧酶-1抑制H2O2誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞氧化損傷

李曉勇 孟凡穎 白赫南

青光眼是一種以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)和視神經(jīng)進(jìn)行性變性為特征的眼部神經(jīng)退行性疾病[1]。如果得不到有效控制，最終會(huì)因?yàn)镽GCs的死亡而導(dǎo)致失明。青光眼視網(wǎng)膜的主要病理特征為RGCs的慢性進(jìn)行性退變和視野的損害。最近研究顯示，氧化應(yīng)激參與青光眼RGCs的損傷機(jī)制[2-3]。因此，尋找合適的藥物預(yù)防、阻斷、逆轉(zhuǎn)RGCs氧化應(yīng)激損傷是治療疾病的關(guān)鍵，也是目前研究的熱點(diǎn)之一。阿克替苷(acteoside)是一種糖苷類化合物[4]，在神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默病[5]和帕金森病[6]中具有神經(jīng)保護(hù)作用。但是阿克替苷在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的RGCs損傷中是否具有神經(jīng)保護(hù)作用尚未完全清楚。因此，本研究以H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞為模型，研究阿克替苷是否抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷，以及血紅素加氧酶-1(HO-1)上調(diào)在阿克替苷抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷中的作用。 以期明確阿克替苷抑制氧化應(yīng)激引起的RGCs的具體機(jī)制，為阿克替苷作為青光眼神經(jīng)保護(hù)劑的研發(fā)工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料阿克替苷(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司);小鼠RGC-5 細(xì)胞株、DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司);兔抗小鼠Bcl-2、Bcl-2/Bax、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin) 抗體(美國 Cell signaling公司);HO-1抗體 (#SPA895,加拿大Stressgen公司)；辣根過氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG二抗、羅丹明123(Rh123) 、噻唑藍(lán)(MTT)(美國Sigma公司)；HO-1抑制劑鋅原卟啉(ZnPP)(美國Santa Cruz公司)；活性氧(ROS)熒光探針H2DCF-DA(美國Invitrogen公司) 。

1.2 方法

1.2.1 RGC-5細(xì)胞的培養(yǎng)RGC-5細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100 ×103IU·L-1，鏈霉素100 IU·mL-1)加入體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清培養(yǎng)。于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng),選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組在初始篩選阿克替苷神經(jīng)保護(hù)濃度時(shí)，將RGC-5細(xì)胞分為對(duì)照組、H2O2組(H2O2處理細(xì)胞24 h)、阿克替苷+H2O2組(1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、30 μmol·L-1阿克替苷分別預(yù)處理細(xì)胞2 h后，200 μmol·L-1H2O2處理細(xì)胞24 h)，MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞活性。后續(xù)實(shí)驗(yàn)阿克替苷+H2O2組選擇30 μmol·L-1阿克替苷作為治療濃度，熒光探針H2DCF-DA檢測(cè)活性氧(ROS)產(chǎn)生和Rh123檢測(cè)線粒體膜電位，Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)；機(jī)制研究中首先用不同濃度阿克替苷單獨(dú)處理RGC-5細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)HO-1蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步ZnPP預(yù)處理RGC-5細(xì)胞1 h，而后30 μmol·L-1阿克替苷單獨(dú)預(yù)處理后與200 μmol·L-1H2O2共孵育24 h(阿克替苷+H2O2+ZnPP組)，通過MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。

1.2.3 細(xì)胞活力檢測(cè)RGC-5細(xì)胞以每孔1×104個(gè)接種于96孔板中，每孔100 μL。于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。12 h后，吸棄上清液，每孔加入5 g·L-1MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，并加入150 μL DMSO，振蕩8 min，待紫色結(jié)晶充分溶解后,置酶標(biāo)儀上測(cè)各孔光密度(D)。然后以D求細(xì)胞存活率。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定用熒光探針H2DCF-DA染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS。H2DCF-DA溶于DMSO中，-20 ℃避光保存。染色前用培養(yǎng)基稀釋為工作濃度。即處理好的細(xì)胞加載熒光探針H2DCF-DA，37 ℃孵育15 min。PBS洗3次，用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度。

1.2.5 線粒體膜電位測(cè)定Rh123用無血清的DMEM配制，加入到96孔板中。37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，棄DMEM培養(yǎng)液，0.01 mol·L-1PBS洗3次，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，求其平均熒光強(qiáng)度。

1.2.6 Western blot檢測(cè)分組處理后的 RGC-5細(xì)胞，PBS洗3次，裂解液收集細(xì)胞，冰上放置30 min，12 000 r·min-1離心20 min,收集上清，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。2×上樣緩沖液混合蛋白，開水煮沸蛋白5 min。100 g·L-1SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜，封閉，孵育兔抗小鼠Bcl-2/Bax、Caspase-3和HO-1或鼠抗 β-actin 抗體。 ECL熒光顯影液加膜上反應(yīng)，暗室內(nèi)膜正面朝下蓋于X線膠片上，分別曝光，膠片顯影，定影。凝膠圖像分析儀掃描圖像并分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。資料采用GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 阿克替苷抑制H2O2誘導(dǎo)的 RGC-5細(xì)胞損傷阿克替苷(1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、30 μmol·L-1)預(yù)處理2 h后，200 μmol·L-1H2O2處理細(xì)胞24 h。與對(duì)照組相比，H2O2組中細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01)(圖1)。與H2O2組相比，阿克替苷+H2O2組中10 μmol·L-1、30 μmol·L-1阿克替苷預(yù)處理均可顯著提高細(xì)胞活力(P<0.05、P<0.01)，表明阿克替苷可以抑制 H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷。

圖1 各組RGC-5細(xì)胞活力 A組：對(duì)照組；B組：H2O2組；C組：阿克替苷(1 μmol·L-1)+H2O2組；D組：阿克替苷(10 μmol·L-1)+H2O2組；E組：阿克替苷(30 μmol·L-1)+H2O2組。*P<0.05，**P<0.01。

2.2 阿克替苷抑制H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞ROS生成增加與對(duì)照組相比，H2O2組RGC-5細(xì)胞ROS的生成明顯增加(P<0.05)；與H2O2組相比，阿克替苷+H2O2組RGC-5細(xì)胞ROS的生成減少(P<0.05)(圖2)。結(jié)果表明，阿克替苷可以抑制H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞ROS的生成。

圖2 各組RGC-5細(xì)胞ROS生成 *P<0.05。

2.3 阿克替苷抑制H2O2誘導(dǎo)的 RGC-5細(xì)胞線粒體膜電位降低與對(duì)照組相比，H2O2組RGC-5細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，阿克替苷+H2O2組RGC-5細(xì)胞線粒體膜電位的降低得到恢復(fù)(P<0.05)(圖3)。結(jié)果表明，阿克替苷可以抑制H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞線粒體膜電位降低。

圖3 各組RGC-5細(xì)胞線粒體膜電位降低 *P<0.05。

2.4 阿克替苷抑制H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞凋亡與對(duì)照組相比，H2O2組RGC-5細(xì)胞Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)；與H2O2組相比，阿克替苷+H2O2組Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)(圖4A)。與對(duì)照組相比，H2O2組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量增加(P<0.05)；與H2O2組相比，阿克替苷+H2O2組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)(圖4B)。表明阿克替苷可以抑制H2O2引起的RGC-5 細(xì)胞凋亡發(fā)生。

圖4 阿克替苷對(duì)H2O2處理的RGC-5細(xì)胞Bcl-2/Bax比值和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 A:Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。B:Western blot檢測(cè)Caspase-3蛋白表達(dá)。*P<0.01；#P<0.05。

2.5 阿克替苷通過上調(diào)HO-1通路抑制H2O2誘導(dǎo)的 RGC-5細(xì)胞損傷阿克替苷單獨(dú)處理RGC-5 細(xì)胞，Western blot檢測(cè)HO-1蛋白的表達(dá)，與阿克替苷未處理(0 μmol·L-1阿克替苷)組相比，阿克替苷劑量依賴性誘導(dǎo)HO-1蛋白的表達(dá)(圖5A)。與對(duì)照組相比，H2O2組細(xì)胞活力降低(P<0.05)，阿克替苷+H2O2組細(xì)胞活力較H2O2組升高(P<0.05)；與阿克替苷+H2O2組相比，加入ZnPP后細(xì)胞活力降低(P<0.01)(圖5B)。說明HO-1活性抑制劑ZnPP預(yù)處理能夠逆轉(zhuǎn)阿克替苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5 細(xì)胞損傷的抑制作用，表明阿克替苷通過上調(diào)HO-1表達(dá)抑制H2O2阿克替苷/μmol·L-1誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷。

圖5 阿克替苷誘導(dǎo)的HO-1保護(hù)RGC-5細(xì)胞免受H2O2介導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷 A:不同濃度的阿克替苷孵育RGC-5細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)HO-1蛋白的表達(dá)；B:MTT法測(cè)定各組細(xì)胞活力。*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

本研究探討阿克替苷是否對(duì)氧化應(yīng)激引起的RGCs損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。以H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞為模型，通過MTT、細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定、線粒體膜電位檢測(cè)、Western blot檢測(cè)等方法，從形態(tài)學(xué)水平和蛋白水平研究阿克替苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC細(xì)胞系RGC-5細(xì)胞毒性損傷的保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，阿克替苷能夠通過抗氧化、抗凋亡和誘導(dǎo)HO-1蛋白表達(dá)的作用來抑制H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷。

目前有許多假說來解釋青光眼RGCs死亡的相關(guān)機(jī)制，這些機(jī)制包括RGCs軸突的缺血性損害[7]、神經(jīng)營養(yǎng)因子的喪失[8]、RGCs軸突的機(jī)械性損傷[9]以及視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能失調(diào)[10]。目前也有研究顯示，RGCs死亡的原因與興奮性氨基酸[11]和凋亡[12]有關(guān)。近年來氧化應(yīng)激和ROS在青光眼中的發(fā)病作用引起廣泛關(guān)注[13-14]。ROS在青光眼的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。ROS作為信號(hào)分子激活許多對(duì)應(yīng)激敏感的通路，引起細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。研究顯示，在青光眼動(dòng)物模型和患者中視網(wǎng)膜、視神經(jīng)內(nèi)氧化應(yīng)激的水平升高[15-16]。而流行病學(xué)研究顯示，許多青光眼患者血液和房水內(nèi)氧化能力降低，同時(shí)伴有抗氧化酶水平的相應(yīng)增高[17]，這表明氧化應(yīng)激損傷是青光眼的重要發(fā)病機(jī)制。因此，針對(duì)抗氧化損傷抑制ROS產(chǎn)生，成為了預(yù)防青光眼的重要治療靶標(biāo)，針對(duì)抗氧化損傷抑制RGCs死亡發(fā)生的研究成為了目前國際的研究熱點(diǎn)，許多抗氧化劑可抑制氧化應(yīng)激引起的RGCs死亡的發(fā)生[18]。因此，越來越多學(xué)者研究天然化合物在抑制氧化應(yīng)激引起的RGCs死亡中的神經(jīng)保護(hù)作用。

阿克替苷是一種廣泛存在于植物中的糖苷類化合物，具有許多藥理學(xué)活性。最近研究顯示，阿克替苷具有廣泛神經(jīng)保護(hù)活性，在神經(jīng)退行性疾病和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中廣泛被研究[19-23]。但是阿克替苷是否會(huì)抑制RGC-5的氧化應(yīng)激損傷目前尚不清楚。本研究以H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞為模型，明確了阿克替苷能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞活力降低、ROS產(chǎn)生和線粒體膜電位的降低，同時(shí)抑制H2O2誘導(dǎo)的Bcl-2/Bax比值降低以及Caspase-3蛋白的活化。這一抗凋亡特性與其他研究結(jié)果相符[5,24]。HO-1就是細(xì)胞抗氧化和細(xì)胞保護(hù)防御體系的一個(gè)重要組成部分，其主要功能為催化血紅素產(chǎn)生一氧化碳、膽綠素(快速地轉(zhuǎn)化為膽紅素)和游離鐵。近年研究顯示，HO-1表達(dá)上調(diào)能夠抑制氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而在神經(jīng)退行性疾病等多種疾病中具有抑制氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用[25]。通過藥物上調(diào)HO-1可抑制多種眼科疾病導(dǎo)致的RGC-5氧化應(yīng)激損傷[26-29]，因此，我們接下來檢測(cè)阿克替苷是否在RGC-5細(xì)胞中上調(diào)HO-1以及這種上調(diào)在阿克替苷抑制H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞氧化損傷中的作用。阿克替苷能夠劑量依賴性上調(diào)RGC-5細(xì)胞HO-1的表達(dá)，這與其他研究相符[30]。而HO-1抑制劑ZnPP減弱阿克替苷抑制H2O2誘導(dǎo)的RGC-5損傷作用，表明HO-1表達(dá)上調(diào)參與阿克替苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。

總之，本研究結(jié)果表明，阿克替苷能夠通過抗氧化、抗凋亡和誘導(dǎo)HO-1表達(dá)抑制H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷。為阿克替苷作為青光眼等眼科疾病的研發(fā)工作提供科學(xué)依據(jù)。