橙黃硬皮馬勃菌種的分離純化及其菌根的人工合成

張珊珊，楊文忠

（云南省林業(yè)和草原科學(xué)院 a.國家林業(yè)和草原局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201）

菌根（Mycorrhiza）是真菌與植物根系形成的具有特殊結(jié)構(gòu)和功能的共生體[1-4]，形成菌根的真菌稱為菌根菌，其中具有食用價(jià)值的菌根菌統(tǒng)稱為菌根食用菌（edible mycorrhizal fungi,EMF）[5]。為實(shí)現(xiàn)EMF 的馴化栽培，人工促進(jìn)菌根合成的關(guān)鍵在于合成高質(zhì)量的菌根苗[6]。為了保證目的菌根的成功“合成”，菌種的分離純化和栽培基質(zhì)的篩選顯得尤為重要[7]。

橙黃硬皮馬勃Scleroderma citrinum，隸屬硬皮馬勃科Sclerodermataceae 硬皮馬勃屬Scleroderma[8-9]。該屬共25 種，為外生菌根擔(dān)子菌，常形成網(wǎng)狀到棘狀球狀孢子，被稱為“土球”。硬皮馬勃屬分布于世界各地的熱帶、溫帶和亞熱帶生態(tài)系統(tǒng)[10]，在亞洲[11-16]、歐洲[17-19]、北美洲[20]和南美洲[21]均有報(bào)道，其中在中國有11 個(gè)種。作為國內(nèi)廣泛分布的一種菌根食用菌，通常以腐生物的形式出現(xiàn)在土壤或帶有苔蘚的腐殖質(zhì)上，有時(shí)也出現(xiàn)在腐爛的木頭上，常見于針葉林和混交林內(nèi)，與云南松等多種喬木形成外生菌根，建立互惠共生關(guān)系。該菌常出現(xiàn)在云南的一些集貿(mào)市場上，深受人們的喜愛。研究發(fā)現(xiàn)，該菌具有微毒，孢粉有消炎和抗氧化作用[22]，子實(shí)體總浸膏提取物對3 齡黏蟲及家蠅成蟲具有較強(qiáng)觸殺活性，同時(shí)對細(xì)菌和病原真菌均有不同程度的抑制作用[23-24]。目前關(guān)于該菌的管理、保護(hù)以及仿生栽培方面的研究都少有涉及，尤其是菌種分離培養(yǎng)和菌根合成研究方面未見報(bào)道。

為實(shí)現(xiàn)橙黃硬皮馬勃的栽培與可持續(xù)利用，本研究從橙黃硬皮馬勃菌種的分離純化及其菌根的人工合成著手，以橙黃硬皮馬勃子實(shí)體作為組織分離純化對象，經(jīng)ITS 序列驗(yàn)證研究對象是否為橙黃硬皮馬勃；然后使用分離得到的菌種接種云南松無菌苗，檢測不同栽培基質(zhì)條件下的菌根合成情況，確定適宜云南松菌根合成的栽培基質(zhì)，為定向培育云南松的菌根化苗木提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

橙黃硬皮馬勃子實(shí)體于2020年8月購買自本地的農(nóng)貿(mào)市場，選擇完整、無蟲蛀腐爛的新鮮子實(shí)體，備用。云南松種子采自昆明樹木園內(nèi)的云南松一代種子園。

1.2 培養(yǎng)基

綜合PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B110 mg，瓊脂18 g，1 000 mL 去離子水，pH 值自然。

圖1 橙黃硬皮馬勃子實(shí)體Fig.1 Fruiting bodies of S.citrinum

1.3 菌種分離

采用食用菌菌種組織分離法[25]。輕拭子實(shí)體表面雜物，用75%酒精浸泡過的棉球?qū)ζ浔砻孢M(jìn)行擦拭消毒，然后在無菌操作臺上將子實(shí)體一分為二，用無菌解剖刀在無感染處切出5 mm×5 mm的組織塊，接種到綜合PDA 培養(yǎng)基上，于25℃人工培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，期間觀察菌絲生長情況，將純化的菌絲轉(zhuǎn)接到二級培養(yǎng)基再次培養(yǎng)。

1.4 無菌苗的培育

將種子用蒸餾水浸泡24 h，在無菌操作臺上用30%的H2O2浸泡30 min 表面消毒，再用無菌水沖洗5 次以去除表面殘留的H2O2，然后取出放入直徑12 cm 的墊有1 層濾紙的無菌培養(yǎng)皿上培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為溫度(25±1)℃，每天光照14 h，黑暗10 h。培養(yǎng)21 d 后，待其胚根長至1～2 cm 時(shí)，轉(zhuǎn)入不同栽培基質(zhì)組培（組培瓶和基質(zhì)于121℃下滅菌60 min），其中基質(zhì)配方設(shè)置為珍珠巖和泥炭土（質(zhì)量比1∶10）、蛭石和珍珠巖和泥炭土（質(zhì)量比10∶1∶5），及蛭石和泥炭土（質(zhì)量比10∶5）共3 種處理，培養(yǎng)3 個(gè)月左右，備用。

1.5 菌根合成

將之前培養(yǎng)好的菌塊打孔（直徑為5 mm），每盆3 塊接種到生長3 個(gè)月的云南松無菌苗的根系周圍。接種時(shí)用無菌鑷子在基質(zhì)內(nèi)挖洞，輕輕地將菌塊放入根系周圍，最后加入20 mL 綜合PDA 液體培養(yǎng)基，置于室溫為25℃左右的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，每天光照16 h，黑暗8 h，對照不接種菌絲塊，每個(gè)處理10 個(gè)重復(fù)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期限為6 個(gè)月，每隔15 d 澆1 次滅菌的綜合PDA 液體培養(yǎng)基。

1.6 分子鑒定

1.6.1 總DNA 的提取

采用CTAB 法提取總DNA[26]。

1.6.2 ITS 擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

ITS 擴(kuò)增引物為真菌通用引物ITS4（5′-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTA AAAGTCGTAACAAGG-3′）（上海生物工程有限公司合成）。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：2×PCR Taq MasterMix with Dye 12.5 μL，引物ITS 4 為1 μL，引物ITS 5 為1 μL，模板DNA 為1.0 μL，ddH2O 為9.5 μL。

PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性300 s，94℃變性40 s，50℃退火40 s，72℃延伸60 s，共35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸420 s。所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.6.3 ITS 序列分析與鑒定

子實(shí)體、分離菌株的菌絲及合成的菌根均進(jìn)行DNA 鑒定：首先通過BioEdit Sequence Alignment Editor 軟件去除兩端不可靠峰、鈍化現(xiàn)象等引起的雜峰，得到序列的可信區(qū)；接著通過CExpress軟件進(jìn)行序列拼接和編輯，將結(jié)果進(jìn)行GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.ov/），運(yùn)用BLAST 在DNA 序列數(shù)據(jù)庫中尋找同源DNA 序列進(jìn)行比較分析，根據(jù)搜索結(jié)果，判斷菌株物種或近緣物種，序列相似系數(shù)99%以上菌株在分類上被確定為同一種。所測菌株與DNA 序列數(shù)據(jù)庫中登錄序列比較得到所測菌株序列的具體各部分序列組成；最后，使用MEGA 7.0 中的Neighbor-joining 建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 測定項(xiàng)目與方法

1.7.1 菌根外部形態(tài)觀察

取出形成外生菌根的云南松幼苗細(xì)根，仔細(xì)洗去根表泥土，在Leica 體式顯微鏡下觀察外生菌根的外部形態(tài)，拍照記錄。

1.7.2 菌根侵染率統(tǒng)計(jì)

采用劃線交叉法統(tǒng)計(jì)[27]。對于抽取的每株幼苗，從其第一側(cè)根處剪下根系，用流水緩慢沖洗干凈后，隨機(jī)剪取50 條新鮮須根，于帶方格的培養(yǎng)皿內(nèi)均勻鋪開，置于光學(xué)顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)其ECMF 侵染情況，計(jì)算菌根侵染率。根據(jù)測定的生物量計(jì)算云南松幼苗在每種基質(zhì)的菌根依賴性和菌根貢獻(xiàn)率。涉及到的計(jì)算公式如下[28]：

菌根侵染率=(菌根侵染的根段數(shù)/檢測的根段總數(shù))×100%；

菌根依賴性=(接種植株平均干質(zhì)量/對照植株平均干質(zhì)量)×100%；

菌根貢獻(xiàn)率=(接種植株平均干質(zhì)量-不接種植株平均干質(zhì)量)/接種植株平均干質(zhì)量×100%。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)采用多因素方差分析方法比較不同基質(zhì)和是否接種及其交互作用對云南松幼苗生長指標(biāo)的影響。方差分析時(shí)，不滿足方差齊性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)通過[arcsin]或[log(x+1)]轉(zhuǎn)換以滿足方差分析的要求。通常采用Post-hoc Tukey 方法檢驗(yàn)變量的顯著性，如果數(shù)據(jù)不滿足參數(shù)檢驗(yàn)的條件，采用Kruskall-Wallis 方法檢驗(yàn)。5%為顯著水平，1%為極顯著水平。

不同栽培基質(zhì)中的云南松幼苗菌根侵染率、菌根依賴性和菌根貢獻(xiàn)率用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 橙黃硬皮馬勃菌種的分離純化

采用食用菌組織分離法培養(yǎng)15 d 左右可以看見菌絲，獲得的菌絲在綜合PDA 培養(yǎng)基上生長致密，初期呈白色，后期呈黃褐色，放射狀平鋪，菌絲間有交叉，氣生菌絲發(fā)達(dá)。由圖2可知，菌株ZhangSC18 的生長速度較快，菌絲致密，生長均勻，因此選用此菌株進(jìn)行菌種培養(yǎng)，為后面的菌根合成做準(zhǔn)備。

圖2 組織分離純化獲得的菌株及菌絲（A.ZhangSC10；B.ZhangSC18；C.菌絲）Fig.2 Strains and hyphae of S.citrinum obtained by tissue isolation and purification(A.Strain ZhangSC10; B.Strain ZhangSC18; C.hyphae)

2.2 ITS 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

子實(shí)體（SCZISHITI）、菌株（ZhangSC10 和ZhangSC18）及菌根（ZhangSC20）的ITS 序列總長度平均值為635 bp。利用Blast 軟件與NCBI 上的物種基因序列進(jìn)行ITS 區(qū)域比對，序列相似性99%以上的均為Sclerodema citrinum，即橙黃硬皮馬勃。

將試驗(yàn)獲得的拼接ITS 序列與NCBI 的GeneBank 進(jìn)行Blast 比對后，得到相似度較高菌株的ITS 序列，下載并最終篩選了16 個(gè)菌株的序列，經(jīng)ITS 序列進(jìn)行序列比對后，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。從NJ 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出，硬皮馬勃屬的種間、種內(nèi)距離在寬度和重疊排列上有所不同，橙黃硬皮馬勃聚為一支，具有99%高置信度聚類，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，橙黃硬皮馬勃子實(shí)體（SCZISHITI）與分離獲得的2 個(gè)菌株（ZhangSC20 和ZhangSC10），及1 個(gè)菌根（ZhangSC20）均為橙黃硬皮馬勃S.citrinum[29]。

圖3 基于橙黃硬皮馬勃子實(shí)體、菌絲與菌根的ITS 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of S.citrinum fruiting bodies,mycelium and mycorrhizae based on ITS sequence

2.3 菌根合成

人工接種橙黃硬皮馬勃后，云南松幼苗的根系多形成棒狀的外生菌根，菌根顏色為淺黃色（圖4）。從圖5可以看出，接種橙黃硬皮馬勃6個(gè)月的云南松幼苗根量顯著增多，葉色較深，植株的形態(tài)特別是根構(gòu)型有明顯差異。

圖4 云南松幼苗的菌根Fig.4 Mycorrhizae of P.yunnanensis seedlings

圖5 云南松非菌根苗和菌根苗Fig.5 Non-mycorrhizal and mycorrhizal seedlings of P.yunnanensis

由表1可知，不同基質(zhì)處理對云南松幼苗的根分支和干質(zhì)量產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.05）。接種處理對云南松幼苗4 個(gè)生長指標(biāo)的影響均極顯著（P＜0.01），但是其交互作用僅對根分支的影響是顯著的（P＜0.05）。無論何種基質(zhì)，在未接種處理?xiàng)l件下，云南松幼苗生長指標(biāo)在3 種不同基質(zhì)處理間的差異不顯著（P＞0.05，表2），但是接種處理后的云南松幼苗在不同基質(zhì)處理間差異顯著（P＜0.05），其中在蛭石和珍珠巖和泥炭土（質(zhì)量比10∶1∶5）的混合基質(zhì)中均表現(xiàn)最優(yōu)（圖6）。

圖6 不同基質(zhì)條件下接種處理對云南松幼苗生長的影響Fig.6 Effects of inoculation treatment on the growth of Pinus yunnanensis seedlings under different substrate conditions

表1 測量指標(biāo)的方差分析?Table 1 Significant levels of effects of factors and factor interactions on variables based on two-way ANOVA

表2 不同栽培基質(zhì)條件下的接種處理對云南松幼苗生長指標(biāo)的影響?Table 2 Effects of inoculation treatment on the growth indexes of Pinus yunnanensis seedlings with different cultivation substrates

橙黃硬皮馬勃在不同基質(zhì)間的接種效應(yīng)差異也是顯著的（P＜0.05，表3）。其中，蛭石和珍珠巖和泥炭土（質(zhì)量比10∶1∶5）混合基質(zhì)中的云南松幼苗菌根侵染率、菌根依賴性和菌根貢獻(xiàn)率均最高，分別為92.66%、292.86% 和65.85%，顯著高于其他兩種基質(zhì)處理，這與其在不同基質(zhì)處理間的生長情況是一致的。這有可能是接種的橙黃硬皮馬勃更適宜生長在該基質(zhì)，對菌根合成的貢獻(xiàn)較高，從而間接促進(jìn)了云南松幼苗的生長。

表3 橙黃硬皮馬勃的接種效應(yīng)Table 3 Inoculation effects of Sclerodema citrinum

3 結(jié)論與討論

由于菌根食用菌與宿主植物的共生關(guān)系，菌絲的質(zhì)量是影響菌根生長和食用菌出菇的重要因素[30]。菌種的分離純化可以保證菌根合成的單一性，提高其競爭力，增加對宿主根系的侵染率。橙黃硬皮馬勃和大多數(shù)食用菌根菌一樣不能進(jìn)行人工栽培，也無法通過子實(shí)體的形態(tài)學(xué)鑒定方法對分離的菌株進(jìn)行鑒定[31]，這時(shí)候分子鑒定就顯得尤為重要[32]。Landeweer 等[33]學(xué)者表示可通過比較ITS 序列來推斷待測物種與已知物種之間的關(guān)系，即相似度高于99%，兩者同種；相似度在95%～99%之間，兩者同屬；相似度低于95%，同科。目前對菌根真菌的分類鑒定廣泛應(yīng)用的基因序列是中度保守的ITS 片段，ITS 常用于屬內(nèi)及種間的系統(tǒng)發(fā)育研究，是核糖體DNA 中的非編碼內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列，被廣泛應(yīng)用于不同物種的系統(tǒng)發(fā)育、進(jìn)化和分類研究及菌種鑒定等方面[34-35]，在外生菌根真菌分離物的鑒定中也得到廣泛運(yùn)用。本研究通過Blast 軟件與NCBI 上的物種基因序列進(jìn)行ITS 區(qū)域比對，發(fā)現(xiàn)序列相似度達(dá)到99%以上的均為橙黃硬皮馬勃。熊濤等和李海波等利用ITS 序列鑒定了食用菌組織分離菌株的真?zhèn)蝃36-37]。本研究同樣利用核糖體核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列對子實(shí)體、分離菌株和菌根進(jìn)行比對驗(yàn)證后，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步證實(shí)市場上購買的子實(shí)體、分離獲得的菌株及人工合成的菌根菌確實(shí)為橙黃硬皮馬勃。

菌根的合成決定了接種后的菌根食用菌是否有能力與土壤中的其他菌根真菌競爭，并適應(yīng)環(huán)境形成人工菌根，最后形成子實(shí)體[38-39]。菌根合成基質(zhì)的篩選可以保證目的菌種的正常繁殖，促進(jìn)菌絲對宿主植物根系的侵染。另外，實(shí)驗(yàn)室條件下的外生菌根合成必須保證無菌條件[40]。本研究通過將分離獲得的橙黃硬皮馬勃優(yōu)良菌株接種不同栽培基質(zhì)條件下的云南松無菌苗，均可形成外生菌根，尤其是在蛭石和珍珠巖和泥炭土（質(zhì)量比10∶1∶5）基質(zhì)上，菌根侵染率、菌根依賴性和菌根貢獻(xiàn)率均最高，并顯著促進(jìn)了云南松幼苗的生長。這是首次在實(shí)驗(yàn)室里通過人工接種的方式實(shí)現(xiàn)橙黃硬皮馬勃對云南松幼苗的侵染，有一定的科研價(jià)值。下一步我們會試驗(yàn)更多的菌根合成方法，例如篩選宿主苗齡、接種方式、接種菌劑劑型、活力、培育溫度、濕度、pH 值和光照等，并適時(shí)將菌根苗移栽至野外，模擬其生長的自然環(huán)境，為橙黃硬皮馬勃的人工栽培提供科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，外生菌根菌的分離純化是保證菌根合成的必要條件，而菌根的成功合成是定向培育菌根化苗木的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)表明，橙黃硬皮馬勃可以通過組織分離獲得純菌，綜合PDA 培養(yǎng)基可以用來成功分離其菌種，最適宜云南松無菌苗菌根合成的栽培基質(zhì)是為蛭石和珍珠巖和泥炭土（質(zhì)量比10∶1∶5）。研究結(jié)果可為云南松菌根化苗木的培育及菌根技術(shù)的開發(fā)和利用提供技術(shù)支撐。本研究僅開展了橙黃硬皮馬勃的菌種分離純化研究，但自然界的環(huán)境較為復(fù)雜，摸清該菌的生理學(xué)特性對菌根的研究具有至關(guān)重要的作用。因此，綜合考慮溫度、pH、碳氮源和生長調(diào)節(jié)劑等對其菌絲生長的影響是下一步要做的工作，進(jìn)而突破外界環(huán)境因素的限制，實(shí)現(xiàn)外生菌根真菌的純培養(yǎng)，為菌根真菌的其他研究奠定基礎(chǔ)。