黃芩苷鎂對(duì)脂多糖聯(lián)合D-氨基半乳糖致急性肝損傷大鼠炎癥因子的影響

白冰，郭亞春，石凱行

（1.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，河北 承德 067000）

肝臟是人體內(nèi)物質(zhì)代謝和起生物轉(zhuǎn)化作用的重要器官，急性肝損傷（acute hepatic injury，AHI）是指由于酒精、病毒、化學(xué)藥物等一種或多種因素導(dǎo)致的短時(shí)間內(nèi)肝功能急劇損傷，損傷嚴(yán)重還可能導(dǎo)致肝功能衰竭伴有很多并發(fā)癥，具有很高的致死率[1]。對(duì)于治療肝損傷，目前國(guó)內(nèi)外并沒(méi)有合適的藥物，因此尋找在臨床上能夠有效治療肝損傷的藥物成為研究熱點(diǎn)。中藥黃芩性苦寒，具有清熱瀉火、燥濕解毒之效，可以治療黃疸[2]。黃芩主要成分為黃芩苷，具有抗炎、抗氧化等藥理作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃芩苷對(duì)非酒精性脂肪性肝炎具有一定的治療作用[3]，還對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠具有保護(hù)作用[4]。由于水溶性差的特點(diǎn)，致使黃芩苷臨床應(yīng)用受到限制，而水溶性及穩(wěn)定性極好的黃芩苷鎂解決了這一問(wèn)題[5]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）聯(lián)合D-氨基半乳糖（D-Galactosamine，D-GalN）制備急性肝損傷模型是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的經(jīng)典方法[6]，其誘導(dǎo)的急性肝損傷病理變化與臨床乙肝病理變化類(lèi)似[7]，主要是由炎癥介導(dǎo)的免疫性肝損傷。當(dāng)中毒、感染等內(nèi)外因素刺激下，免疫調(diào)節(jié)作用失控，二者比例失衡，活化的免疫細(xì)胞分泌大量炎癥因子，就可能會(huì)引起免疫功能紊亂，進(jìn)而造成肝細(xì)胞損傷[8]。有報(bào)道D-GalN 致急性肝衰竭大鼠模型中存在Th 細(xì)胞分泌的炎癥因子失衡[9]，在肝損傷的過(guò)程中IL-6、IFN-γ、TNF-α 等Th1 類(lèi)細(xì)胞因子發(fā)揮主要作用[8]。因此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)炎癥因子水平來(lái)探究黃芩苷鎂尾靜脈給藥對(duì)LPS/D-GalN 誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 54 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠購(gòu)于維通利華，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006，5 周齡，重（170±10）g，本研究已通過(guò)我校倫理委員會(huì)審批，批準(zhǔn)文號(hào)：CDMULAC-20181219-006。大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境。試劑及儀器：LPS、D-GalN（Sigma-Aldrich），異甘草酸鎂（正大天晴藥業(yè)），黃芩苷鎂（純度為85%，由承德醫(yī)學(xué)院劉翠哲教授課題組提供），紅帽負(fù)壓液體采集管（不抗凝）國(guó)產(chǎn)（Bebolabs），大鼠IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α 試劑盒（聯(lián)科生物），SIM-F124 制冰機(jī)（日本SANYO 公司），PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）（TaKaRa），DEPC處理水（DNase、RNase free）（Beyotime），普通RIPA（組織/細(xì)胞）裂解液（附PMSF 1.5 ml）（Solarbio），引物（TaKaRa），PCR 儀（BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、正常組、黃芩苷鎂（BAMg）高、中、低劑量組（100、50、25 mg/kg），異甘草酸鎂組（MgIG）（18 mg/kg），每組9 只。給藥組尾靜脈注射相應(yīng)濃度的藥物連續(xù)7 d，1 次/d，模型及正常組以相同方法給予等量生理鹽水。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定造模條件為20 μg/kg LPS 聯(lián)合400 mg/kg D-GalN，于12 h 后取材[8]。

1.2.2 ELISA 法檢測(cè)血清炎癥因子 取材，大鼠血液離心后得到血清置于冰上備用；在標(biāo)準(zhǔn)品孔中，分別加入呈比例稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品100 μl 作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，加100 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液于空白孔內(nèi)作為空白對(duì)照，在樣本孔中，加入樣本溶液20 μl、1×檢測(cè)緩沖液80 μl；然后所有孔加入稀釋好的檢測(cè)抗體溶液50 μl；37 ℃孵育1.5 h；沖洗6 次；加辣根酶標(biāo)記的鏈霉親和素100 μl/孔；37 ℃孵育30 min；沖洗6 次；避光加入顯色底物100 μl/孔，避光室溫孵育30 min；加終止液100 μl/孔；30 min 內(nèi)，上機(jī)檢測(cè)450 nm 條件下的OD 值；處理數(shù)據(jù)，檢測(cè)血清樣本中IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用（±s）表示，使用單因素方差分析LSD 或Games-Howell 進(jìn)行檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，行χ2檢驗(yàn)；設(shè)置檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型組血清IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 水平高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；黃芩苷鎂高、中劑量組、異甘草酸鎂組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；黃芩苷鎂低劑量組血清IFN-γ 水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；黃芩苷鎂低劑量組血清IL-6、IL-1β、TNF-α 水平與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；黃芩苷鎂中、低劑量組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ 水平高于異甘草酸鎂組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；黃芩苷鎂高劑量組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ 水平與異甘草酸鎂組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；黃芩苷鎂高、中、低劑量組血清TNF-α水平與異甘草酸鎂組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組血清IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 水平比較（±s，pg/ml）

表1 各組血清IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 水平比較（±s，pg/ml）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與異甘草酸鎂組比較，cP＜0.05

3 討論

黃芩苷鎂是黃芩苷與鎂離子耦合形成的水溶性化合物，它是黃芩苷在植物中的主要存在形式[10]。有文獻(xiàn)報(bào)告黃芩苷在腎損傷、心肌損傷、脊髓損傷、肺損傷等方面均有一定的治療作用[11-14]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)BA-Mg 可改善CCl4誘發(fā)的大鼠急性肝損傷[15]，其可能通過(guò)Nrf2/ARE 信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用[16]。有研究報(bào)道了黃芩苷鎂對(duì)急性肺損傷小鼠就有一定保護(hù)作用[17]。因此本研究通過(guò)BA-Mg 預(yù)處理大鼠1 周后，進(jìn)行LPS/D-GalN 誘導(dǎo)急性肝損傷[7]，研究BA-Mg 對(duì)LPS/D-GalN 誘導(dǎo)急性肝損傷是否有保護(hù)作用。

免疫應(yīng)答是機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除“非己”物質(zhì)的整個(gè)過(guò)程，需要T、B 細(xì)胞及多種固有免疫細(xì)胞相互協(xié)調(diào)、共同作用完成[18]。T 細(xì)胞來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞，在胸腺發(fā)育成熟后定居在外周淋巴器官中的胸腺依賴(lài)區(qū)，當(dāng)受到某些特定的抗原刺激后就會(huì)被激活、增殖，并分化為發(fā)揮效應(yīng)的T 細(xì)胞和具有記憶作用的T 細(xì)胞，通過(guò)淋巴細(xì)胞再循環(huán)周游全身發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞免疫功能[19]。依據(jù)T 細(xì)胞在免疫應(yīng)答中的功能，將其分為輔助性T 細(xì)胞（Th 細(xì)胞）、細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（Tc 細(xì)胞）和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg 細(xì)胞）。Th 細(xì)胞主要分為T(mén)h1、Th2 細(xì)胞，其中Th1 細(xì)胞活化分泌IL-1、IL-2、IFN-γ、TNF-α 等因子，Th2 細(xì)胞活化分泌IL-4、IL-6、IL-10 等因子。正常生理狀態(tài)下，Th1/Th2 細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)機(jī)體正常免疫應(yīng)答，在肝損傷狀態(tài)下導(dǎo)致二者比例失衡，促炎因子大量分泌，進(jìn)而可能會(huì)引起免疫功能紊亂[8]。由此，實(shí)驗(yàn)研究檢測(cè)了大鼠血清中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 含量。

本研究發(fā)現(xiàn)，AHI 大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 水平高于正常組（P＜0.05），與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[20,21]，提示LPS/D-GalN 誘導(dǎo)的AHI 過(guò)程中，可能使Th1 細(xì)胞過(guò)度活化，大量分泌IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 等因子，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。黃芩苷鎂高、中、低劑量組可以降低LPS 聯(lián)合D-GalN 致急性肝損傷大鼠血清中IL-6、IL-1β、IFN-γ的水平，其中以黃芩苷鎂高、中劑量組較為突出（P＜0.05）。黃芩苷鎂高、中、低劑量組血清中TNF-α 水平有下降的趨勢(shì)，與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示TNF-α 可能并不是BA-Mg 影響的主要因子。因此，BA-Mg 可能通過(guò)抑制Th1 細(xì)胞的過(guò)度活化，進(jìn)而抑制分泌促炎因子，發(fā)揮抗炎作用。黃芩苷鎂高劑量組血清炎癥因子IL-6、IL-1β、IFN-γ 水平與異甘草酸鎂組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），黃芩苷鎂中、低劑量組血清炎癥因子IL-6、IL-1β、IFN-γ水平較異甘草酸鎂組高（P＜0.05），提示高濃度BA-Mg 可能與MgIG的抗炎效果一致。

綜上所述，LPS 聯(lián)合D-氨基半乳糖可造成急性肝損傷，釋放大量炎癥因子?；谇捌贏HI 模型建立的條件，黃芩苷鎂可以通過(guò)抑制炎癥因子產(chǎn)生來(lái)發(fā)揮保肝作用，但黃芩苷鎂是否通過(guò)影響Th1、Th2細(xì)胞增殖來(lái)抑制炎癥因子產(chǎn)生，有待進(jìn)一步研究。