沙棗種子總黃酮提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化性分析

凱迪日耶·玉蘇普，蔣海明

（1.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844006；2.新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什 844006）

尖果沙棗（Elaeagnus oxycarpa Schlechtend）屬胡頹子科胡頹子屬，沙棗樹適應(yīng)性強(qiáng)，能在高鹽高堿等極端環(huán)境中生長發(fā)育[1-2]。沙棗及其果實(shí)可用于食品、醫(yī)藥、香料和木材等領(lǐng)域[3]。尖果沙棗果實(shí)營養(yǎng)成分高，其含有大量的生物揮發(fā)油、不飽和脂肪酸、黃酮類化合物、維生素和其他生物活性化學(xué)物質(zhì)[4]。黃酮類化合物是一類普遍存在于光合作用細(xì)胞中的天然化合物。截至目前，已分離鑒定出1萬多種黃酮類化合物[5]。黃酮類化合物（通常指維P）是僅存在于植物中的具有苯并-γ-吡喃酮結(jié)構(gòu)，可以分為不同類型，黃酮醇類、黃烷醇類、異黃酮類和黃烷-3-醇類[6]。黃酮類化合物有廣泛的生物學(xué)功能，如抗氧化、降血脂、緩解疲勞、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等，研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物比維C和維E具有更強(qiáng)的抗氧化潛力，因此對(duì)黃酮類化合物的研究越來越受到重視[7-8]。

有關(guān)沙棗種子中總黃酮提取工藝及體外抗氧化性相關(guān)的研究均未見國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。新疆沙棗的分布面積廣泛、生產(chǎn)量高、價(jià)格低。研究應(yīng)用超聲波提取沙棗種子的總黃酮，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳提取條件，并采用DPPH自由基清除能力指數(shù)評(píng)價(jià)總黃酮的體外抗氧化活性，為充分利用沙棗資源、進(jìn)一步開發(fā)黃酮類化合物提供了有益參考。

1 材料

1.1 材料

沙棗，采自新疆喀什地區(qū)岳普湖縣沙棗林。沙棗果實(shí)取種子，自來水洗干凈，烘干，并用粉碎機(jī)將沙棗種子粉碎，過40目篩，取篩出粉末，放4℃冰箱中備用。

1.2 試劑

甲醇（CH3OH）、亞硝酸鈉（NaNO2）、硝酸鋁（Al(NO3)3）、氫氧化鈉（NaOH）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、乙醇（CH3CH2OH）和1,1-二 苯 基-2-三 硝 基 苯 肼（DPPH試劑），以上試劑均為分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司提供。

1.3 儀器與設(shè)備

MS-01h型磁力攪拌器，廣州立珠生物科技有限公司產(chǎn)品；E204e/02型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品中；T6型新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；SHB-III型循環(huán)水式真空泵，武漢華科達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；CQ-300B型超聲波清洗機(jī)，上海量壹科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；ZF-06a型脂肪測(cè)定儀，上海瑞正儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；UP-II-20t型優(yōu)普超純水器，四川優(yōu)普超純科技有限公司產(chǎn)品；Re-52aa型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

參考林文珍等人[9]、蔣麗施等人[10]方法并略做修改。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，于105℃下干燥至恒質(zhì)量，加入甲醇溶液45 mL。待蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解后，甲醇溶液定容至50 mL，得到質(zhì)量濃度0.19 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。用可調(diào)節(jié)微量移液器將0，1，2，3，4，5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到6支干燥的棕色容量瓶中，取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaNO2水溶液1 mL，依次加入到以上6支容量瓶中，混勻靜置6 min，再取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)3水溶液1 mL依次加入到棕色容量瓶中，搖勻后靜置6 min，最后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液10 mL，加水至25 mL刻度線進(jìn)行定容。搖勻后，靜置15 min進(jìn)行顯色。將相應(yīng)的溶劑作為空白對(duì)照試驗(yàn)，于波長510 nm處測(cè)量吸光度A，重復(fù)3次，并進(jìn)行線性相關(guān)性考查。

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，于波長510 nm處的吸光度A為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為Y=11.267X+0.002 4，R2=0.998。結(jié)果表明，線性回歸方程具有良好的相關(guān)性，以0.007 6～0.038 0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍以內(nèi)，線性關(guān)系良好。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 供試品溶液的制備

用電子天平稱取1 g沙棗種子粉末，用濾紙包好，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液浸泡2 h。然后于60℃條件用下回流提取1 h，提取液定容至50 mL，得供試品溶液，放4℃冰箱備用。按照2.1中的方法，測(cè)定吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程得出提取液中黃酮的質(zhì)量濃度，根據(jù)黃酮質(zhì)量濃度計(jì)算公式計(jì)算黃酮含量。黃酮含量計(jì)算公式如下：

式中：C——代入線性回歸方程測(cè)定總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；

D——稀釋倍數(shù)；

V——供試液的體積，mL；

m——種子粉末的質(zhì)量，g；

2.3 方法學(xué)考查

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液3 mL及供試品提取溶液3 mL。參照2.1中的方法，分別在5，10，20，40，50，60 min，于波長510 nm處測(cè)定對(duì)照品和供試品提取溶液的吸光度A，觀察亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法對(duì)黃酮顯色效果的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，對(duì)照品吸光值RSD=2.003%（n=6），供試品吸光度RSD=4.106%（n=6），說明對(duì)照品、供試品提取溶液1 h以內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 精密度試驗(yàn)

精密量取5份同一來源的對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和5份同一來源的供試品提取溶液，每份用可調(diào)節(jié)微量移液器吸取3 mL溶液。參照2.1中的方法，測(cè)定其吸光值并計(jì)算RSD值，以便考查試驗(yàn)方法的精密度。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液吸光度RSD=1.203%（n=5），供試品提取溶液吸光度RSD=4.706%（n=5）。結(jié)果表明該方法精密度良好。

精密度試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取5份沙棗種子粉末，每份為1.0 g，根據(jù)2.2供試品提取溶液的制備方法，制備5份供試品提取溶液。參照2.1中的方法，測(cè)定其吸光度，計(jì)算RSD值，考查試驗(yàn)的重復(fù)性。結(jié)果表明，供試品吸光值RSD=3.24%（n=5），說明該試驗(yàn)方法重復(fù)性較好。

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取3份沙棗種子粉末，每份為1.0 g，按照2.2供試品溶液的制備方法和工藝來制作供試品提取溶液。得到供試品溶液后，各取3 mL在25 mL棕色容量瓶中備用，依次加入0.19，0.38，0.54 mg的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，參考2.1的方法，于波長510 nm處測(cè)定溶液的吸光度，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算回收率RSD，考查加樣回收率。結(jié)果表明，3次回收率測(cè)定的平均值為104.61%，RSD=4.65%（n=3），說明用該方法測(cè)定黃酮含量的準(zhǔn)確度高，方法可靠。

回收率試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 超聲提取與回流取方法比較

2.4.1 乙醇超聲提取法

稱取1 g沙棗種子粉末，將沙棗種子粉末在體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液50 mL中浸泡2 h，設(shè)置超聲功率300 W，提取時(shí)間0.5h。用水浴循環(huán)真空泵過濾，濾渣中再加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液50 mL，設(shè)置超聲功率300 W，提取時(shí)間0.5 h。用水浴循環(huán)真空泵過濾，合并2次濾液得到提取液定容至100 mL棕色容量瓶中。將上述提取液稀釋5倍，精密量取3 mL溶液放置在25 mL棕色容量瓶中。參照2.1中的方法，測(cè)定其吸光度，并按照公式計(jì)算總黃酮含量。

2.4.2 乙醇回流提取法

稱取1 g沙棗種子粉末，將沙棗種子粉末在體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液50 mL中浸泡2 h，索氏提取法60℃下回流提取1 h，提取2次。合并2次的乙醇提液，定容至100 mL。將上述提取液稀釋5倍，精密量取3 mL溶液放置在25 mL容量瓶中備用。參照2.1中的方法，測(cè)定其吸光度，并按照公式計(jì)算總黃酮含量。由表6可知，與回流提取法相比，超聲提取法提取的黃酮得率要比回流提取法提取出的黃酮得率高。

不同提取方法提取效果比較見表5。

表5 不同提取方法提取效果比較

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

精確稱9分沙棗種子粉末，每份為1.0 g。按照L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表（見表6）中確定的加入乙醇用量、加入乙醇的體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)共4個(gè)因素條件，超聲波提取法提取總黃酮。參照2.1中的方法，測(cè)定其吸光值，按照公式計(jì)算總黃酮含量。通過正交設(shè)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，4個(gè)因素對(duì)于總黃酮提取的影響大小分別為提取次數(shù)（D）＞料液比（A）＞提取時(shí)間（C）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）。對(duì)K1、K2、K3值的比較，各因子水平的基本影響為A3＞A2＞A1，B2＞B1＞B3，C3＞C1＞C2，D2＞D3＞D1。經(jīng) 過 四因素三水平的綜合考查，沙棗種子中總黃酮的提取最優(yōu)條件是A3B2C1D3，即乙醇加量30倍，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間0.5 h，提取次數(shù)3次，所得的黃酮含量最高為5.077 mg/g。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表6，正交試驗(yàn)表及結(jié)果見表7。

表6 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表7 正交試驗(yàn)表及結(jié)果

2.6 最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)選出來的最優(yōu)工藝參數(shù)A3B2C1D3，按照30倍乙醇用量，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時(shí)間0.5 h和提取次數(shù)3次進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)驗(yàn)證見表8。

表8 正交試驗(yàn)驗(yàn)證

試驗(yàn)結(jié)果表明，通過驗(yàn)證試驗(yàn)得到的平均總黃酮含量平均為5.102 mg/g，RSD＜1%。通過驗(yàn)證試驗(yàn)所得的黃酮含量與最佳工藝所得結(jié)果基本一致，說明該方法穩(wěn)定可靠，驗(yàn)證了提取工藝的可行性。

2.7 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

準(zhǔn)備5支25 mL棕色容量瓶，依次向容量瓶加入已知濃度的供試品溶液。然后向每個(gè)容量瓶中加入0.01 mg/mL DPPH溶液4 mL，加水定容至刻度，搖勻。于波長517 nm處測(cè)定吸光試，記作A0；室溫避光靜置30 min，記錄波長517 nm處吸光度，記作Aj；對(duì)照組試驗(yàn)為只加DPPH的水溶液，吸光度記作Ap按照以下公式計(jì)算出自由基清除率W。

沙棗種子黃酮提取液對(duì)DPPH自由基清除效果見圖2。

由圖2可知，沙棗種子的乙醇提取物對(duì)于DPPH自由基具有一定的清除作用，并且隨著濃度的增加，對(duì)于氧自由基的清除率也在增強(qiáng)，但是清除率較低。

圖2 沙棗種子黃酮提取液對(duì)DPPH自由基清除效果

3 結(jié)論

沙棗果、花、葉、枝均含有多種有益的營養(yǎng)成分，具有較高的應(yīng)用開發(fā)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[11]。沙棗中含有黃酮、多糖、芳香油等重要的生物活性成分，沙棗葉、花、果實(shí)、種子中富含黃酮類化合物，黃酮類化合物的物學(xué)功能廣泛，具備多種藥理學(xué)作用，研究發(fā)現(xiàn)沙棗中黃酮類化合物的含量約為0.68%～1.16%[12-13]。由此可見，沙棗是一種環(huán)境效益與經(jīng)濟(jì)效益相結(jié)合的鹽生植物，是一種具有開發(fā)市場(chǎng)前景的重要資源。作為重要的植物資源，沙棗的重要性被大家忽視，資源開發(fā)不夠充分?，F(xiàn)階段，只有一小部分大棗用于民間藥用，采摘或基本生產(chǎn)加工，食用或初步加工，利用率極低，更談不上綜合開發(fā)利用，導(dǎo)致如此寶貴的資源被大量浪費(fèi)。

黃酮類化合物是植物獨(dú)特的次生代謝產(chǎn)物。對(duì)于植物本身而言，黃酮類化合物在植物生理和生態(tài)等方面中發(fā)揮著多種作用，包括保護(hù)植物免受紫外線和病原菌的傷害、吸引昆蟲授粉、調(diào)節(jié)植物的雄性生育力、調(diào)控細(xì)胞周期，并參與植物激素的運(yùn)輸?shù)萚14]。從其經(jīng)濟(jì)開發(fā)和應(yīng)用來看，黃酮類化合物有重要的藥用價(jià)值，對(duì)許多人類疾病具有治療效果。黃酮類化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎、降低血管脆性等多種功能。因此，對(duì)黃酮類等化合物的研究和應(yīng)用逐漸成為熱點(diǎn)[15]。

研究采用超聲法提取技術(shù)對(duì)尖果沙棗中總黃酮的提取條件及體外抗氧化活性進(jìn)行初步研究，確定最佳提取工藝參數(shù)為乙醇用量30倍，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間0.5 h，提取次數(shù)3次，在以上工藝優(yōu)選條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，平均提取含量5.102 mg/g。研究結(jié)果表明，沙棗種子黃酮類化合物具有DPPH自由基清除作用，并具有一定的體外抗氧化活性。研究旨在提高尖果沙棗資源的合理利用率，為進(jìn)一步開發(fā)尖果沙棗黃酮類在天然藥物領(lǐng)域應(yīng)用、開發(fā)研究等方面提供了有益參考依據(jù)。