不同品種番石榴多酚的體外抗氧化與降血糖作用研究

徐金瑞，王 艷，侯方麗，胡 勇，黃建蓉，談偉君

（廣東藥科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，廣東 中山 528458）

生物體內(nèi)自由基過量堆積引發(fā)的氧化損傷，是導(dǎo)致生物衰老及誘發(fā)Ⅱ型糖尿病等相關(guān)代謝性疾病的重要原因[1]。有研究表明，具有抗氧化活性的物質(zhì)可有效清除體內(nèi)多余自由基，減少由活性物質(zhì)引起的細(xì)胞氧化損傷，防止多種疾病的發(fā)生[2]。α-葡萄糖苷酶可促進(jìn)腸道食物中碳水化合物（如淀粉、蔗糖、麥芽糖等）分解成單糖，從而引起餐后血糖升高，抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可使葡萄糖的生成及吸收減緩，降低餐后血糖峰值，臨床上常通過對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的檢測(cè)，用來初步判斷藥物有無降糖活性，并將降血糖藥物和具有降血糖功效的食品作為預(yù)防、改善糖尿病及延緩并發(fā)癥發(fā)生的重要措施之一[3]。

番石榴（Psidium guajava L.）屬于桃金娘科，在我國(guó)主要栽培于廣東、廣西、海南、福建等地。番石榴中維生素、果糖、葡萄糖、谷氨酸、膳食纖維及鈣、磷、鐵等人體所需的微量元素含量豐富，是各種果蔬之冠，常吃番石榴具有抗衰老、調(diào)節(jié)生理機(jī)能、治療糖尿病、抗病毒、抗輻射等功效[4]。盡管目前對(duì)番石榴資源在藥理活性試驗(yàn)及臨床應(yīng)用等方面開展了大量的研究工作，但是多限于對(duì)番石榴葉功能特性的評(píng)價(jià)，而有關(guān)番石榴果實(shí)的功效評(píng)價(jià)還較少，且多集中在化學(xué)成分的研究方面[5-7]。臨床研究雖已有關(guān)番石榴降血糖的報(bào)道，但對(duì)其作用機(jī)制目前尚不清楚。

對(duì)比華南地區(qū)5個(gè)品種番石榴的多酚含量、總抗氧化能力、清除自由基（DPPH·）能力及抑制α-葡萄糖苷酶活性的差異，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析番石榴多酚含量與其總抗氧化能力、清除自由基（DPPH·）能力和抑制α-葡萄糖苷酶活性的關(guān)系，探討番石榴多酚抗氧化與降血糖作用的關(guān)系，以期為闡明番石榴降血糖的機(jī)理提供一定研究思路，并為番石榴的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料：番石榴洗凈、切片，于50℃下烘干，粉碎至40目備用。5個(gè)品種分別是“新世紀(jì)”和“四季”（福建產(chǎn)）、“胭脂紅”和“珍珠”（廣州產(chǎn)）、“早熟白”（海南產(chǎn)）。

主要試劑：三吡啶三吖嗪（2,4,6-tripyridyls-triazine，TPTZ），F(xiàn)luka公司提供；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼），Sigma公司提供；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG，純度≥98%）、α-葡萄糖苷酶（1KU）、阿卡波糖（純度≥95%），北京索萊寶科技有限公司提供。

1.2 儀器設(shè)備

DFY-500型高速中藥粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品；YM-650CT型超聲波提取器，上海豫明儀器有限公司產(chǎn)品；pHS-3C型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；V-1200型紫外-可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；RE-2000型旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；FD-1E-80型冷凍干燥機(jī)，上海楚定分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多酚含量的測(cè)定-酒石酸亞鐵比色法[8]

吸取待測(cè)樣液1 mL于25 mL比色管中，加入蒸餾水4 mL和酒石酸亞鐵溶液5 mL，混合后，用pH值的7.5磷酸鹽緩沖液定容，混勻；同時(shí)，以蒸餾水代替樣品提取液作空白，于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度。另以0～50 μg/mL的焦性沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=2.669X-0.008 9，R2=0.999 5。

1.3.2 番石榴多酚的制備

不同品種番石榴粉稱取適量，按料液比1∶60（g∶mL）加入70%的乙醇，置于超聲波提取器中50℃下提取20 min，過濾，將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，冷凍干燥成粉，備用（使用前以蒸餾水配成所需濃度用于1.3.3和1.3.4試驗(yàn)）。

1.3.3 抗氧化試驗(yàn)

（1）總抗氧化能力（TAC）測(cè)定[9]。實(shí)際加樣量擴(kuò)大20倍，即樣品0.2 mL+水0.6 mL+37℃的FRAP工作液6 mL（10 mmol/L TPTZ、20 mmol/L FeCl3、0.3 mmol/L醋酸鈉緩沖液以1∶1∶10的質(zhì)量比混合），搖勻后放置4 min，于波長(zhǎng)593 nm處測(cè)定吸光度。另以0.1～1.0 mmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=0.311 7X-0.006，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。樣品的總抗氧化能力以mmol FeSO4/g提取物表示，單位mmol/g。

（2）清除DPPH·的能力[10]。用無水乙醇作參比空白液，于0.2 mmol/L DPPH·溶液2 mL中加入樣品2 mL，搖勻于室溫下放置30 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定其吸光度A1，同時(shí)測(cè)樣品2 mL與無水乙醇2 mL反應(yīng)后的吸光度A2，再測(cè)定0.2 mmol/L DPPH·溶液2 mL與無水乙醇2 mL反應(yīng)后的吸光度A3；再根據(jù)以下公式計(jì)算樣品對(duì)DPPH·的抑制率：

式中：A1——DPPH溶液與樣品溶液反應(yīng)后的吸光度；

A2——樣品溶液與空白溶劑反應(yīng)后的吸光度；

A3——DPPH溶液與空白溶劑反應(yīng)后的吸光度。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)[11]

以0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH值6.8）為溶劑，分別配制1.0 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液和1.0 mmol/L底物PNPG溶液。將1.0 U/mL α-葡萄糖苷酶600 μL、pH值6.8磷酸鈉緩沖液200 μL，以及0～20 mg/mL不同濃度番石榴多酚溶液200 μL，混勻后于37℃下保持10 min，加入1.0 mmol/L PNPG溶液200 μL，混勻后于37℃下保溫30 min，再加入0.5 mol/L Na2CO3溶液2 mL終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)400 nm處測(cè)定濃度梯度番石榴多酚作用下的吸光度。

式中：A1——加番石榴多酚抑制劑和α-葡萄糖苷酶反應(yīng)后的吸光度；

A2——只加番石榴多酚抑制劑不加α-葡萄糖苷酶的吸光度；

A3——不加番石榴多酚抑制劑只加α-葡萄糖苷酶反應(yīng)后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種番石榴多酚的含量

不同品種番石榴多酚的含量對(duì)比見圖1。

由圖1可知，番石榴中多酚類物質(zhì)因品種不同含量也存在差異，其中胭脂紅與早熟白品種亦達(dá)到顯著水平（p＜0.05）。5個(gè)品種番石榴多酚含量由高到低依次為胭脂紅＞新世紀(jì)＞四季＞珍珠＞早熟白。該結(jié)果可能與不同品種栽培的地域條件有關(guān)。

圖1 不同品種番石榴多酚的含量對(duì)比

2.2 不同品種番石榴多酚的總抗氧化能力

不同品種番石榴多酚的總抗氧化能力對(duì)比見圖2。

圖2 不同品種番石榴多酚的總抗氧化能力對(duì)比

由圖2可知，不同品種番石榴多酚均有一定的抗氧化能力，但品種之間仍存在一定差異。5個(gè)品種番石榴多酚的總抗氧化能力以胭脂紅品種最強(qiáng)，新世紀(jì)品種次之，早熟白品種最差，其中胭脂紅與早熟白品種達(dá)到顯著水平（p＜0.05）?？偪寡趸芰傮w表現(xiàn)為胭脂紅＞新世紀(jì)＞四季＞珍珠＞早熟白。這與2.2中不同品種番石榴多酚含量分布的結(jié)果一致，說明番石榴多酚的抗氧化能力與其所含多酚含量多少有一定關(guān)系。

2.3 不同品種番石榴多酚清除DPPH·的能力

不同品種番石榴多酚清除DPPH·的能力對(duì)比見圖3。

圖3 不同品種番石榴多酚清除DPPH·的能力對(duì)比

自由基清除能力通常以IC50值表示，IC50代表清除率50%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度，IC50值越小，說明其清除自由基的能力越強(qiáng)。由圖3可知，不同品種番石榴多酚均有一定的清除自由基作用，但差異較大，其中新世紀(jì)品種和早熟白品種之間達(dá)到顯著水平（p＜0.05）。清除DPPH·的能力表現(xiàn)為新世紀(jì)＞胭脂紅＞珍珠＞四季＞早熟白。除了新世紀(jì)和胭脂紅，這與2.2中不同品種番石榴多酚含量分布的結(jié)果基本一致，說明番石榴多酚清除DPPH·的能力與其所含多酚含量多少有一定關(guān)系。

2.4 番石榴多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

不同品種番石榴多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用見圖4。

圖4 不同品種番石榴多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

對(duì)酶活性的抑制效應(yīng)通常以IC50值表示，IC50代表抑制率50%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度，IC50值越小，表明其抑制作用越強(qiáng)。由圖4可知，不同品種番石榴多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性均有一定的抑制作用，但品種之間存在一定差異。5個(gè)品種番石榴多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用以胭脂紅品種最強(qiáng)，新世紀(jì)品種次之，早熟白品種最差，其中胭脂紅與早熟白品種達(dá)到顯著水平（p＜0.05），這與2.2中不同品種番石榴多酚含量分布的結(jié)果基本一致，說明番石榴多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用與其所含多酚含量多少有一定關(guān)系。但與阿卡波糖相比，5個(gè)品種番石榴多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用均與阿卡波糖存在極顯著差異（p＜0.01），這與多酚樣品純度低有很大關(guān)系，對(duì)番石榴多酚的純化研究還有待于進(jìn)一步研究。

2.5 番石榴抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性作用與多酚含量的相關(guān)性

為了探明番石榴中多酚含量與總抗氧化能力、抑制DPPH·能力及抑制α-葡萄糖苷酶活性之間的關(guān)系，對(duì)三者之間Pearson相關(guān)性進(jìn)行了分析（說明：因IC50值與自由基清除能力或酶活抑制率呈反比，因此進(jìn)行相關(guān)性分析時(shí)，需要以清除率或抑制率進(jìn)行分析）。

番石榴多酚含量與抗氧化作用和抑制α-葡萄糖苷酶活性的相關(guān)性分析見表1。

由表1可知，番石榴多酚含量分別與總抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制率呈顯著正相關(guān)性（p＜0.05），總抗氧化能力分別與DPPH·抑制率和α-葡萄糖苷酶抑制率呈顯著正相關(guān)性（p＜0.05），結(jié)合2.1、2.2、2.3、2.4的研究結(jié)果，推測(cè)番石榴多酚通過抗氧化作用發(fā)揮其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，具體作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。以上研究結(jié)果表明，番石榴多酚可能就是其抗氧化與降血糖作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，可將番石榴多酚作為降血糖的功效成分之一加以開發(fā)利用。

表1 番石榴多酚含量與抗氧化作用和抑制α-葡萄糖苷酶活性的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，5個(gè)品種番石榴均具有較好的抗氧化能力和抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，且在多酚含量、總抗氧化能力、抑制α-葡萄糖苷酶活性方面差異明顯，表現(xiàn)為胭脂紅＞新世紀(jì)＞四季＞珍珠＞早熟白，而清除自由基能力最強(qiáng)的是新世紀(jì)，胭脂紅次之，早熟白最差。番石榴的總抗氧化能力和抑制α-葡萄糖苷酶活性作用與多酚含量之間具有顯著的線性相關(guān)性（p＜0.05），因此可以推測(cè)番石榴多酚可能就是其抗氧化與降血糖作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。