食管鱗癌組織微小RNA-138、微小RNA-145表達水平與1型/2型輔助性T細胞漂移和預后的關系

原野 劉濤 劉華

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，我國2015年食管癌發(fā)病24.6萬例，死亡18.8萬例[1]。食管癌中以鱗癌最為常見，占90%以上[2]。診斷及治療技術的發(fā)展改善了食管鱗癌病人的預后，但其治療后仍容易產(chǎn)生復發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥等[3]。微小RNA(micro RNA，miR)長度為20到24個核苷酸，可以結合靶基因?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達[4-5]。miR能夠影響1型輔助性T細胞(T-helper 1，Th1)和2型輔助性T細胞(T-helper 2，Th2)的細胞因子分泌功能，引起機體Th1/Th2免疫平衡狀態(tài)失調(diào)，即發(fā)生Th1/Th2漂移，導致自身免疫疾病及腫瘤疾病的發(fā)生[6-7]。miR-138的編碼基因位于3p21.32。研究顯示，miR-138在膠質(zhì)瘤[8]、肺癌[9]等惡性癌癥中表達下調(diào)，導致下游促癌因子如SIRT1表達升高，抑制腫瘤細胞的自噬，促進腫瘤細胞的惡性增殖。miR-145的編碼基因位于5p32。研究表明，miR-145在人類前列腺癌[10]、結直腸癌[11]等腫瘤中表達降低，誘導干性細胞標志過度表達，促進腫瘤的惡性增殖。本研究檢測miR-138、miR-145在食管鱗癌中的表達，分析兩者表達與Th1/Th2漂移和病人預后的關系。

對象與方法

一、對象

2015年5月～2018年5月期間我院收治的112例食管鱗癌病人為食管鱗癌組。納入標準：(1)手術切除標本經(jīng)術后病理確診為食管鱗癌；(2)術前未接受放化療；(3)具備手術指征，均完成食管癌根治術；(4)無嚴重的術后并發(fā)癥，預計生存時間>3個月。排除標準：合并其它腫瘤；術前合并嚴重的心肺功能衰竭；伴自身免疫性疾病。食管鱗癌組，男性73例，女性39例；年齡33～76歲，平均年齡(54.51±5.73)歲；分化程度：高中分化70例，低分化42例；腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期86例，Ⅲ期26例；腫瘤位置：上中胸段78例，下胸段34例；腫瘤直徑≤5 cm 49例，>5 cm 63例。同期70例健康體檢人群作為對照組，男性45例，女性25例；年齡34～77歲，平均年齡(52.32±5.86)歲。兩組性別、年齡等比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。研究對象對研究知情同意并簽署同意書。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過。

二、方法

1.實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測：將手術切除的食管鱗癌組織和癌旁組織(距離腫瘤組織邊緣>3 cm)超聲破碎研磨，離心去除細胞碎片，以Trizol提取組織RNA。以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。進行qRT-PCR檢測?？傮w系20 μl，包括FastFire qPCR PreMix 10 μl，引物2 μl，模板2 μl，純水6 μl。引物序列見表1。反應條件為：94 ℃預變性10分鐘，94 ℃變性15秒，55 ℃退火30秒，70 ℃延伸30秒，共40個循環(huán)。結果以2ΔΔCt值表示，共進行3次平行試驗，取平均值。

表1 引物序列

2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測：取食管鱗癌組入院時及對照組體檢當日靜脈血5ml，4 ℃ 4 000 r/min離心5分鐘，留取上層血清，-80 ℃保存待測。ELISA檢測血清中Th1型細胞因子γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素(IL)-2與Th2型細胞因子IL-4、IL-10的水平。向酶標板每孔添加100 μl樣品及標準品，37 ℃孵育90分鐘，加入200 μl生物素標記抗體，37 ℃孵育60分鐘，TBS洗滌3次，加入100 μl ABC液，37 ℃孵育30分鐘，TBS洗滌3次，加入TMB液后37 ℃避光孵育30分鐘，加終止液后上酶標儀讀OD450值。以標準品的濃度為橫坐標，以各標準品的OD值為縱坐標，繪制標準曲線。

3.隨訪：出院后每3個月進行1次隨訪，以電話或門診復查的方式隨訪，隨訪3年，隨訪截止日期2021年6月30日，隨訪截止至病人死亡或隨訪結束。

三、統(tǒng)計學分析

結果

1.食管鱗癌組織及癌旁組織中miR-138、miR-145表達水平：食管鱗癌組織中miR-138、miR-145的表達水平分別為(1.155±0.232)、(1.110±0.217)，癌旁組織中分別為(4.155±0.732)、(3.910±0.617)，食管鱗癌組織中miR-138、miR-145的表達水平明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.食管鱗癌組織中miR-138、miR-145表達水平的相關性：采用Pearson線性相關分析食管鱗癌組織中miR-138與miR-145表達水平的相關性，結果發(fā)現(xiàn)，兩者表達水平呈正相關(r=0.596，P<0.05)。見圖1。

圖1 食管鱗癌組織中miR-138、miR-145表達水平的相關性

3.食管鱗癌組織中miR-138、miR-145表達與臨床病理參數(shù)的關系：食管鱗癌組織中miR-138、miR-145的表達與腫瘤分期有關，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而miR-138、miR-145的表達與病人性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度及腫瘤位置無關，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 食管鱗癌組織中miR-138、miR-145表達與臨床病理參數(shù)的關系

4.兩組血清Th1和Th2類細胞因子的表達比較：食管鱗癌組病人血清Th1型細胞因子IFN-γ、IL-2水平明顯低于對照組，而Th2型細胞因子IL-4、IL-10水平明顯高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 食管鱗癌組、對照組血清Th1和Th2類細胞因子的表達比較(ng/L)

5.食管鱗癌病人miR-138、miR-145表達與Th1/Th2漂移的關系見表4。。結果表明，miR-138、miR-145表達與Th1型細胞因子呈正相關，而與Th2型細胞因子呈負相關(P<0.05)。

表4 食管鱗癌病人miR-138、miR-145表達與血清Th1和Th2類細胞因子的關系

6.不同miR-138、miR-145表達情況食管鱗癌病人生存情況：隨訪3年，失訪1例。隨訪期間死亡70例，3年總體生存率(overall survival，OS)為36.94%(41/111)。根據(jù)miR-138表達的平均值1.155將病人分為miR-138高表達組和低表達組，miR-138高表達、低表達病人的3年OS分別為58.49%(31/53)、17.24%(10/58)，miR-138低表達病人3年OS明顯較低(Log-rankχ2=4.151，P<0.05)；根據(jù)miR-145表達的平均值1.110將病人分為miR-145高表達組和低表達組，miR-145高表達、低表達病人的3年OS分別為52.73%(29/55)、21.43%(12/56)，miR-145低表達病人的3年OS明顯較低(Log-rankχ2=3.863，P<0.05)。見圖2。

圖2 不同miR-138、miR-145表達情況食管鱗癌病人的生存曲線

討論

食管癌病人通常預后較差[12]。食管鱗癌是食管癌主要的組織病理學亞型。目前，食管癌的治療以手術及放化療為主，病人生存預后不理想[13]。分子靶向及免疫治療是近年來腫瘤治療新的發(fā)展方向。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤的免疫逃逸關系密切。目前研發(fā)出針對免疫檢查點進行治療的藥物，如納武單抗等，能夠顯著改善腫瘤病人的臨床療效，延長生存時間[14-15]。

miR是細胞內(nèi)無蛋白編碼功能的核苷酸分子。miR通過參與構成RNA誘導的沉默復合物，抑制基因的表達，影響細胞的增殖分化等過程。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中存在大量miR表達失衡的現(xiàn)象，形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，在腫瘤細胞的增殖、遷移過程中發(fā)揮重要的生物學作用[16]。miR-138、miR-145分別位于人類3號和5號染色體。生理狀態(tài)下，miR-138、miR-145參與胚胎干細胞的分化調(diào)節(jié)，還參與免疫細胞如調(diào)節(jié)性T細胞的分化成熟過程，進而影響機體1型和2型輔助性T細胞的平衡。此外，miR-138、miR-145在人類多種疾病，如支氣管哮喘、成骨細胞分化障礙等疾病中均存在異常表達的現(xiàn)象，影響疾病的發(fā)生發(fā)展[17-18]。本研究表明，食管鱗癌中miR-138、miR-145表達水平明顯降低。食管鱗癌中miR-138表達下調(diào)的原因與轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常有關。Tang 等[19]研究表明，HOXA4能直接結合miR-138啟動子區(qū)域，調(diào)控miR-138的表達，腫瘤發(fā)生時HOXA4表達下調(diào)，導致miR-138表達水平降低。miR-145的表達受到甲基化調(diào)控的影響，Gao 等[20]報道，鼻咽部鱗癌中miR-145表達下調(diào)與啟動子區(qū)域的高甲基化有關，抑制腫瘤細胞中miR-145的甲基化后，miR-145表達上調(diào)，并通過激活癌基因肌成束同源蛋白1的表達，促進腫瘤進展。食管鱗癌中miR-145的表達下調(diào)亦可能與甲基化修飾有關。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，miR-138、miR-145的低表達與較高的腫瘤分期、淋巴結轉(zhuǎn)移有關，表明miR-138、miR-145的低表達可促進食管鱗癌的惡性進展。miR-138、miR-145在腫瘤中均發(fā)揮抑癌基因的功能，Wang 等[21]報道，miR-138能夠靶向抑制致癌基因人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)的表達，在結直腸癌中miR-138表達下調(diào)，hTERT顯著激活，導致腫瘤的惡性進展；此外，miR-145也具有抑制癌基因表達的功能，Li 等[22]報道，miR-145能夠抑制原癌基因的表達，進而抑制下游谷氨酰胺的合成，發(fā)揮抑制腫瘤代謝的功能，因而miR-145的低表達促進腫瘤代謝，導致腫瘤進展。本研究結果表明，miR-138、miR-145低表達病人生存預后較差，證實miR-138、miR-145在食管鱗癌中具備重要的腫瘤抑制功能，檢測miR-138、miR-145的表達水平有利于評估食管鱗癌病人的生存預后。

正常機體免疫的平衡涉及 Th1 和 Th2活性之間的穩(wěn)態(tài)。Th1細胞驅(qū)動1型通路(細胞免疫)來對抗病毒和其他細胞內(nèi)病原體，消除癌細胞，并刺激遲發(fā)型超敏反應。Th2細胞驅(qū)動2型通路(體液免疫)并上調(diào)抗體產(chǎn)生以對抗細胞外生物，提高對異種移植物的耐受性。任何一種模式的過度激活都會導致疾病。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，食管鱗癌病人Th1型細胞因子水平顯著降低，而Th2型細胞因子水平顯著升高，提示食管鱗癌病人存在Th1/Th2漂移的現(xiàn)象。相關性分析證實，miR-138、miR-145的表達與Th1/Th2漂移密切相關，表明食管鱗癌中miR-138、miR-145可能是通過促進Th1/Th2漂移，進而導致食管鱗癌的惡性進展。Qiu 等[17]研究表明，miR-138,miR-544,miR-145等能夠通過結合并抑制轉(zhuǎn)錄因子Runx3的表達，促進Th1/Th2漂移，進而導致疾病進展，而在過表達Runx3后，則能夠重新恢復Th1/Th2的平衡。因此，以miR-138、miR-145為靶點進行治療可能通過恢復Th1/Th2平衡，阻止食管鱗癌的進展。本研究通過相關性分析發(fā)現(xiàn)miR-138與miR-145的表達水平呈正相關。兩者之間相互作用關系尚不清楚，但兩者在食管鱗癌中均發(fā)揮抑癌基因的功能，并且具有相同的下游作用靶點，如Runx3，進而影響Th1/Th2漂移狀態(tài)。因此，兩者在食管鱗癌中可能通過相互協(xié)同發(fā)揮生物學功能，同時針對兩個靶點的治療可能提高腫瘤的治療療效。

綜上所述，食管鱗癌組織中miR-138、miR-145表達下調(diào)，并且兩者的表達呈正相關，miR-138、miR-145的低表達與較高的腫瘤分期有關，miR-138、miR-145的低表達可能通過促進Th1/Th2漂移，參與食管鱗癌的進展。