基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的天南星炮制特征成分初步研究*

趙重博 王晶 祁春艷 武旭 張麗娟

(1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；2.潼關縣人民醫(yī)院，陜西 渭南 714300)

南星為天南星科植物天南星Arisaemaerubescens(Wall.) Schott、異葉天南星ArisaemaheterophyllumBL.或東北天南星ArisaemaammrenseMaxim.的干燥塊莖，因其有毒，臨床用前常與生姜和白礬共同加工為制天南星，與生天南星相比除毒性降低，功效在消腫散結的基礎上還可內服燥濕化痰，祛風止痙[1]，這與制天南星炮制過程中化學成分的變化有關。目前關于天南星炮制報道主要集中在刺激性成分草酸鈣針晶類及凝集素蛋白的含量降低，2020年版《中國藥典》規(guī)定天南星的含量檢測為黃酮類，此外，文獻報道[2-5]天南星還有生物堿類、核苷類、氨基酸類含氮化合物，多糖，針晶，凝集素等。本研究采用UPLC-UV法建立了天南星、制天南星提取物的紫外特征圖譜，根據主要特征峰紫外信息，進一步采用UPLC-Q-TOF-MS/MS研究制天南星的化學成分，以期為天南星炮制及質量控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 6540超高解析度四級桿-飛行時間質譜(安捷倫公司，美國)；Waters ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀(沃特斯公司，美國)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 生天南星從安國藥材市場購買，經陜西中醫(yī)藥大學吳建華副教授鑒定為天南星科植物天南星Arisaemaerubescens(Wall.) Schott干燥塊莖。制天南星為生天南星按2020年版《中國藥典》規(guī)定方法，加白礬、生姜炮制而成。標本存放于陜西中醫(yī)藥大學藥學院中藥炮制技術傳承基地中藥飲片標本室。使用的甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸、提取用甲醇、乙醇均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1樣品制備

2.1.1醇提液的制備 分別取生天南星和制天南星粉末各約3 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇30 mL，密塞，稱定重量，超聲處理45 min，放冷，再稱定重量，用60%乙醇補足減失重量，搖勻，離心，精密量取上清液18 mL，減壓濃縮至干，加60%乙醇使之溶解，轉移至5 mL量瓶中并定容，濾過，即得。生天南星醇提物和制天南星醇提物分別記做生醇和制醇。

2.1.2水提液的制備 分別取生天南星和制天南星粉末各約3 g，按“2.1.1醇提液制備”方法，將提取溶劑換為超純水，即制備得水提液。生天南星水提物和制天南星水提物分別記做生水和制水。

2.2天南星炮制前后的UPLC特征圖譜研究

2.2.1核苷、氨基酸等含氮類成分的UPLC特征圖譜 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3，2.1×100 mm，1.8 μm；流動相為乙腈(A)： 0.1%甲酸水(B)；梯度洗脫(0～3.5 min，1%A；3.5～10 min，5%A；10～15 min，8%A；15～28 min，8%A；28～33 min，90%A；33～36 min，90%A；36～37 min，1%A；37～42 min，1%A)；進樣量：3 μL；流速：0.2 mL·min-1；柱溫度：35℃；檢測波長：二極管陣列檢測器記錄190～600 nm紫外光譜。

對生天南星與制天南星不同溶劑提取物核苷、氨基酸等含氮類成分進行分析(圖1)，首先以生天南星水提物4個特征峰為研究對象，研究了生天南星類成分的紫外吸收特征，發(fā)現其紫外最大吸收波長有2個，分別為195.2～211.7 nm，248.4～261.4 nm(圖2)。因此選擇254 nm對生天南星與制天南星不同溶劑提取物核苷、氨基酸等含氮類成分的UPLC特征圖譜進行研究。結果發(fā)現，以水作為提取溶劑提取生天南星與制天南星中的核苷、氨基酸等含氮類成分提取效率比以60%的乙醇更高，同時也發(fā)現，生天南星與其炮制品制天南星的特征圖譜有所差異，因此后續(xù)在研究天南星炮制前后核苷、氨基酸等含氮類成分時，以水提物作為研究對象。

A.生水;B.制水;C.生醇;D.制醇

圖2 生天南星水提物峰1～4紫外最大吸收圖

2.2.2黃酮類成分的UPLC特征圖譜 色譜柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3，2.1×100 mm，1.8 μm；流動相為乙腈(A)： 0.1%甲酸水(B)；梯度洗脫(0～3.5 min，5%A；3.5～4 min，11.2%A；4～26 min，11.2%A；26～27 min，18%A；27～32 min，18%A；32～33 min，90%A；33～35 min，90%A；35～36 min，5%A；36～42 min，5%A)；進樣量：3 μL；流速：0.3 mL·min-1；柱溫度：35 ℃；檢測波長：二極管陣列檢測器記錄190～600 nm紫外光譜。

對生天南星與制天南星不同溶劑提取物黃酮類成分進行分析(圖3)，首先以生天南星水提物10個特征峰為研究對象，研究了生天南星黃酮類成分的紫外吸收特征，發(fā)現峰1～10共有的紫外最大吸收波長有2個，分別為268.5～270.9 nm，334.2～349.2 nm(圖4)。選擇335 nm對生天南星與制天南星不同溶劑提取物黃酮類成分的UPLC特征圖譜進行研究。結果發(fā)現，生天南星與制天南星的紫外色譜行為基本一致，但水提物樣品顯示更多的信息峰，因此后續(xù)在研究天南星中黃酮類成分時，以生天南星水提物作為研究對象(圖4)。

A.生水;B.制水;C.生醇;D.制醇

圖4 天南星水提物峰1～10紫外最大吸收圖

2.3天南星炮制前后的UPLC-Q-TOF-MS特征圖譜研究 帶鞘流氣的電噴霧離子源(AJS-ESI)，電離模式(ESI+、ESI-)，掃描方式采用target msms，霧化氣溫度325℃，氣體流量8 L·min-1，噴霧壓力40 psi，鞘流氣溫度350℃，鞘流氣流量11 L·min-1，毛細管電壓4000 V。二級質譜分析條件：碰撞能量為：0～50 V；全掃描質譜范圍：100～1200 m/z。

2.3.1生天南星水提物含氮類成分UPLC-Q-TOF-MS分析 運用正離子分析模式對生天南星水提物進行UPLC-Q-TOF-MS檢測(總離子流圖見圖5)，從一級質譜中共檢索到8個化合物，并根據其分子質量及分子式推測了其對應的化合物，具體結果見表1。

表1 生天南星水提物含氮類成分MS分析檢索結果

2.3.2制天南星水提物含氮類成分UPLC-Q-TOF-MS分析 運用正離子分析模式對制天南星水提物進行UPLC-Q-TOF-MS檢測(總離子流圖見圖6)，從一級質譜中共檢索到4個化合物，并根據其分子質量及分子式推測了其對應的化合物，具體結果見表2。

圖5 生天南星水提物含氮類成分總離子流圖

圖6 制天南星水提物含氮類成分總離子流圖

表2 制天南星水提物含氮類成分MS分析檢索結果

峰1：保留時間8.456 min，一級質譜m/z268.1057 [M+H]+，二級質譜圖分給出產物離子峰m/z136.0631，119.0353，一級質譜信息和二級質譜信息與腺苷基本一致，并且符合腺苷的裂解規(guī)律[6]。推斷峰1為腺苷。

峰2：保留時間9.252 min，一級質譜m/z284.0992 [M+H]+，二級質譜圖分給出產物離子峰m/z152.0575，一級質譜信息和二級質譜信息與鳥苷基本一致，并且符合鳥苷的裂解規(guī)律[7]。推斷峰2為鳥苷。

峰3：保留時間9.970 min，一級質譜m/z166.0865 [M+H]+，二級質譜圖分給出產物離子峰m/z120.0815，一級質譜信息和二級質譜信息與苯丙氨酸基本一致，并且符合苯丙氨酸的裂解規(guī)律[8]。推斷峰3為苯丙氨酸。

峰5：保留時間16.016 min，一級質譜m/z205.0971 [M+H]+，二級質譜圖分給出產物離子峰m/z188.0723、146.0606、118.0658，一級質譜信息和二級質譜信息與色氨酸基本一致，并且符合色氨酸的裂解規(guī)律[9]。推斷峰5為色氨酸。

峰8：保留時間24.873 min，一級質譜m/z302.2080 [M+H]+，二級質譜圖分別給出產物離子峰m/z171.1138，143.1189，72.0813。推斷峰8為L-Leucine,L-alanyl-L-valyl-(CAS：93414-38-1)。

2.3.3制天南星水提物黃酮類成分UPLC-Q-TOF-MS分析 運用負離子分析模式對制天南星水提物進行UPLC-Q-TOF-MS檢測(總離子流圖見圖7)，從一級質譜中共檢索到12個化合物，具體結果見表3。

圖7 制天南星水提物黃酮類成分總離子流圖

表3 制天南星水提物黃酮類成分MS分析檢索結果

黃酮類化合物的共同特征：在負離子模式下，各種黃酮類化合物的MS2數據顯示一系列的m/z503 [M-H-60]-、473 [M-H-90]-、443 [M-H-120]-碎片離子，這些離子為黃酮碳苷類化合物的特征碎片離子，且該類化合物應為雙糖取代的黃酮碳苷，分子量為564的化合物可能為芹菜素-6-C-戊糖-8-C-葡萄糖苷或者芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C戊糖苷，分子量為594的化合物可能為芹菜素-6,8-二葡萄糖苷或者芹菜素-6,8-二半乳糖苷。杜樹山等[10]從天南星中發(fā)現了以芹菜素為母核，分子量為564的黃酮碳苷類化合物5個：夏佛托苷、異夏佛托苷、芹菜素-6-半乳糖-8-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-阿拉伯糖-8-半乳糖苷、維采寧-3(芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷)；以芹菜素為母核，分子量為594的黃酮碳苷類化合物2個：維采寧-2(芹菜素6,8-C-二吡喃葡萄糖苷)、芹菜素6,8-C-二吡喃半乳糖苷。結合本研究一級、二級質譜信息，推測天南星黃酮類化合物的特征圖譜中可能含有以上化合物。本實驗以夏佛托苷、異夏佛托苷和維采寧-2、維采寧-3為對照品，通過保留時間比對，發(fā)現峰1、4分別與維采寧-2、夏佛托苷保留時間一致，異夏佛托苷、維采寧-3保留時間相同，與峰12一致。

1號峰：保留時間12.200 min，一級質譜m/z為581.1490 [M+H]+，二級質譜顯示特征碎片離子519.0987 [M-H-60]-、489 [M-H-90]-、459.0856 [M-H-120]-、441.0728[M-H-120-18]、399.0662 [M-H-120-60]-、369.0568 [M-H-120-90]-、327.0436 [M-H-120-90-42]-，特征碎片離子與木犀草素-6-C-葡萄糖-8-C-木糖極度相似[11]。另外，根據文獻報道，489 [M-H-90]-由化合物中木糖0-2鍵斷裂(0,2[XP]-)，相對豐度為27.41%，459.0856 [M-H-120]-由化合物中葡萄糖0-2鍵的斷裂(0,2[XG]-)，相對豐度為75.08%。根據文獻報道，C-6的糖基更容易碎裂，因此證明了化合物6位連接葡萄糖，而8位連接木糖的結構。綜上所述，1號峰推測為木犀草素-6-C-葡萄糖-8-C-木糖。

4號、12號峰：保留時間分別為19.634、28.544 min，一級質譜m/z分別為565.1541 [M+H]+、565.1538 [M+H]+，4號峰根據保留時間初步判斷為夏佛托苷(芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷)，二級特征碎片離子457 [M+H-90-18)]+、427 [M+H-120-18)]+，其中[M+H-90-18)]+來源于化合物失去一分子水后，C-8阿拉伯糖0-2鍵的斷裂(0,2[XP]-)；[M+H-120-18)]+來源于化合物失去一分子水后，C-6葡萄糖0-2鍵的斷裂(0,2[XG]-)。MS2顯示[M+H-120-18)]+豐度遠高于[M+H-90-18)]+，文獻報道，C-6的糖基更容易碎裂[12]，因此MS2特征碎片證實了4號峰為異夏佛托苷。而在12號峰中，[M+H-120-18)]+豐度遠低于[M+H-90-18)]+，說明該化合物C-6位為阿拉伯糖，是一個戊糖，而維采寧-3的C-6位應為一個己糖，因此證明12號峰為異夏佛托苷而不是維采寧-3。

表4 制天南星水提物黃酮類成分MS2分析結果

7號、11號峰：保留時間分別為19.634、28.544 min，正離子模式下一級質譜m/z分別為595.1638[M+H]+、595.1642 [M+H]+，負離子模式下進行MS2分析，母離子分別為593.1436 [M-H]-、593.1420 [M-H]-，說明2個化合物的分子量均為594，符合芹菜素(270)+葡萄糖基(162)或半乳糖基(162)+葡萄糖基(162)或半乳糖基(162)的分子量。說明7、11號峰可能為芹菜素-6,8-二葡萄糖苷或者芹菜素-6,8-二半乳糖苷。7號峰的特征碎片離子575[M-H-18]-、473.1018[M-H-120]-、383.0734[M-H-210]-(芹菜素[M:270]+糖殘基[M:113])、354.0695[M-H-239](芹菜素[M:270]+糖殘基[M:84])與文獻報道中的芹菜素-6,8-二葡萄糖苷特征碎片一致[13].，而11號峰的特征碎片為503.1107、473.0968、383.073，未出現575[M-H-18]-、354[M-H-239]特征碎片，因此推測7號峰為芹菜素-6,8-二葡萄糖苷、11號峰為芹菜素-6,8-二半乳糖苷。

2、3、5、6、8、9、10號峰：保留時間分別為16.404、19.221、20.226、22.177、23.175、24.045 min，正離子模式下一級質譜分子量為565.1539、565.1541、565.1541、595.1638、565.1545負離子模式下進行MS2分析，母離子分別為563.1320 [M-H]-、563.1329 [M-H]-、563.1324 [M-H]-、563.0300 [M-H]-、563.1341 [M-H]-、563.1333 [M-H]-。說明3、5、6、8、9、10號峰的分子量均為564。符合芹菜素(270)+戊糖基(162)+己糖基(132)的分子量。根據前期文獻研究，推測6個峰對應的化合物結構為芹菜素-6-己糖-8-戊糖或者芹菜素-6-戊糖-8-己糖苷，戊糖為木糖、阿拉伯糖可能性更高，己糖為半乳糖、葡萄糖的可能性更高。MS2分析時，發(fā)現6個峰共有5個特征碎片離子，503 [M-H-60]-、473 [M-H-90]-、443 [M-H-120]-、383 [M-H-90-90]-、353 [M-H-120-90]-，503、473均為戊糖基碎裂的結果[12,14]，文獻報道C-6位糖基更容易碎裂，峰5、8、9、10的特征碎片503 [M-H-60]-相對豐度均小于10%，相反的，峰2、3、6的特征碎片503 [M-H-60]-均大于10%，因此推測峰5、8、9、10可能為芹菜素-6-葡萄糖(半乳糖)-8-阿拉伯糖(木糖)苷，而峰2、3、6可能為芹菜素-6-阿拉伯糖(木糖)-8-葡萄糖(半乳糖)苷。

3 討論

本研究發(fā)現，天南星中的主要化學成分以核苷、氨基酸等含氮類和黃酮類為主，這與文獻報道基本一致[2,15]，其中苯丙氨酸、色氨酸等氨基酸和腺苷、鳥苷等腺苷類成分及黃酮類成分易溶于熱水，因此制備樣品的提取方法選擇為水提法。與天南星生品相比，制天南星其特征圖譜顯示化學成分在種類及含量上均不如生品豐富；黃酮類成分種類與生品幾乎一致，但相應成分的含量比生品更少。《中國藥典》2020年版規(guī)定：制天南星在炮制加工過程中需加水和白礬反復浸泡，待浸泡至口嘗微有麻舌感時，再加生姜、白礬與天南星共同煮沸至無干心。結合本研究關于生天南星和制天南星的水提物以及醇提物的UPLC特征圖譜研究結果，可以推測長時間的水處理導致天南星中的水溶性化學成分在炮制過后發(fā)生了損失，至于是否轉化生成了新成分還需進一步研究。

本研究在對天南星中的黃酮類成分進行MS和MS2分析時，發(fā)現天南星中的黃酮類成分均有明顯的特征，其母核以芹菜素為主，大部分黃酮類成分均為以芹菜素為母核的二糖苷，取代位置可能以C-6位和C-8位為主。取代糖的種類以戊糖和己糖為主，并且其裂解規(guī)律符合文獻報道[16]，在正離子模式下，其裂解時易脫水，因此碎片[M+H-H2O]-、[M+H-2H2O]-、[M+H-3H2O]-為該類化合物在正離子模式下的共同特征峰。另外根據文獻報道，負離子模式下，黃酮碳苷MS2模式下以糖基的碎裂為主，本研究黃酮碳苷化合物的碎裂符合其特征[12]，其特征碎片以[M-H-60]-m/z503、[M-H-90]-m/z473、[M-H-120]-m/z443為主，[M-H-60]-來源于分子中五碳糖的碎裂，[M-H-120]-來源于分子中六碳糖的碎裂，[M-H-90]-為五碳糖或六碳糖碎裂的結果。由于二糖取代的黃酮碳苷其C-6的糖基比C-8位的糖基更容易碎裂，因此，當C-6位為六碳糖取代時，[M-H-60]-m/z503的相對豐度應該比當C-6位為五碳糖取代時的相對豐度低。本研究發(fā)現天南星中存在大量的同分異構體，僅分子式為C26H28O14，未知結構的同分異構體就有7個，雖然該類化合物在MS2分析時有豐度差異，可以判斷C-6位連接五碳糖還是六碳糖，但無法進一步確定糖的種類，因此后續(xù)可能需要借助核磁共振等波譜解析手段對該類化合物進行結構鑒定。

其次在天南星藥材中檢測到了仲丁威和環(huán)草定，其中仲丁威是一種氨基甲酸酯類殺蟲劑，環(huán)草定是一種選擇性尿嘧啶取代的除草劑，這兩種成分應為天南星種植時，為減少病蟲草害等造成的損失，人為使用農藥后的殘留。《中國藥典》2020年版在0212通則中收錄了藥材及飲片(植物類)33種禁用農藥，規(guī)定不得檢出(不得超過定量限)。雖然這兩種農藥不在規(guī)定的范圍內，但仍提醒我們應重視中藥材種植時農藥的使用合理性問題。

中藥炮制的核心目的是減毒增效，其中圍繞毒性藥的目的主要體現在降低毒性的前提下盡可能保留藥效。天南星為典型的毒性中藥，也是衛(wèi)生部規(guī)定的28種毒性中藥之一，其毒性成分較為統(tǒng)一認識為草酸鈣針晶及其附著的毒蛋白和多糖形成的“毒針晶”，但此類成分不溶于水，白礬溶液的處理就可以大量破壞此類成分[17]，而2020年版《中國藥典》規(guī)定的有效成分黃酮類及文獻報道的核苷、氨基酸等含氮類和多糖類在炮制過程中長時間浸泡和煎煮會造成此類成分的流失[18-19]，因此有必要通過研究其炮制過程成分變化規(guī)范炮制工藝，提高飲片質量。