大視場結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)（特邀）

郜鵬，方翔，溫凱，雷云澤，熊子涵，李嬌月，劉星，鄭娟娟，安莎

（西安電子科技大學(xué) 物理學(xué)院，西安710071）

0 引言

光學(xué)顯微鏡具有結(jié)構(gòu)簡單、對樣品損傷?。蓪铙w樣品進行成像）、可對生物樣品中特定結(jié)構(gòu)（借助熒光標(biāo)記）進行選擇性成像等優(yōu)點，在了解物質(zhì)和生命過程中發(fā)揮著決定性作用。然而，光學(xué)顯微鏡的空間分辨率受衍射限制為λ/2（一般為200 nm）［1］。人們?yōu)榻鉀Q此問題，提出了超分辨率（Super Resolution，SR）顯微方法，如單分子定位顯微（Single-Molecule Localization Microscopy，SMLM）［2-4］、受激發(fā)射損耗顯微（Stimulated emission depletion，STED）［5-7］和結(jié)構(gòu)光照明顯微（Structured Illumination Microscopy，SIM）［8-14］，將光學(xué)顯微鏡的空間分辨率提高到幾十納米甚至幾納米。2014年，發(fā)明超分辨光學(xué)顯微技術(shù)的三位科學(xué)家因此被授予諾貝爾化學(xué)獎。在SR 技術(shù)中，SIM 技術(shù)因其成像速度快、對樣品損傷小，在活體樣品成像中脫穎而出。SIM 利用照明光斑和樣品之間的“莫爾效應(yīng)”，收集傳統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)無法探測到的樣品高頻信息，進而重構(gòu)出超分辨圖像。由于產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)光同樣會收到物鏡數(shù)值孔徑（Numerical Aperture，NA）的影響，線性SIM（激發(fā)的熒光與激發(fā)強度呈線性關(guān)系）的空間分辨率只能在衍射極限基礎(chǔ)上提高兩倍［15］。相比之下，非線性SIM 通過利用發(fā)射模式中的高次諧波，實現(xiàn)了超過兩倍的分辨率增強［1］。結(jié)構(gòu)光照明還可以和定量相位顯微相結(jié)合，實現(xiàn)對透明樣品的高分辨、高襯度相位成像［16］。

在傳統(tǒng)SIM 中，通常利用空間光調(diào)制器（Spatial Light Modulator，SLM）或數(shù)字微鏡器件（Digital Micromirror Device，DMD）快速生成和切換不同方向及相移量的條紋結(jié)構(gòu)光完成移相。然而，其成像通量受到SLM/DMD 本身像素個數(shù)的限制。例如，對于采用100×/1.4NA 物鏡和532 nm 激發(fā)光的SIM 顯微鏡，若要獲得兩倍的分辨率提升，SLM 或DMD 需產(chǎn)生周期為190 nm 的條紋/點陣結(jié)構(gòu)光。受投影器件像素個數(shù)（如1 920×1 080 像素）的限制，該結(jié)構(gòu)光場僅能覆蓋90 μm×50 μm 的視場，無法滿足組織或病理切片等生物樣品超分辨成像的需求。目前也存在幾種擴展SIM 成像視場的技術(shù)：首先，可以通過機械平移樣品來逐一拍攝樣品的不同部位，然后對再現(xiàn)的SIM 圖像進行拼接獲得大視場SR 圖像［17，18］。其次，還可以利用平面聚合物波導(dǎo)代替?zhèn)鹘y(tǒng)物鏡獲得較大的SR-SIM 圖像［19］。其中，前者較為耗時，后者對樣品的制備要求較高。此外，利用物理光柵在樣品上的投影也可在大視場中產(chǎn)生條紋圖案［20，21］。然而，該方法需要對光柵進行物理旋轉(zhuǎn)（改變條紋方向）和平移（實現(xiàn)相移），限制了SIM 的成像速度。

本文將介紹一種大視場條紋/點陣結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)。該技術(shù)利用物理光柵投影產(chǎn)生大通量條紋/點陣結(jié)構(gòu)光，同時利用SLM 快速實現(xiàn)結(jié)構(gòu)光相移和條紋方向選擇。與傳統(tǒng)SIM 技術(shù)相比，該技術(shù)可顯著提高成像通量；與條紋結(jié)構(gòu)光相比，點陣結(jié)構(gòu)光只需要記錄五幅原始熒光圖像，便可以獲得樣品的超分辨圖像，提高了成像速度。

1 實驗裝置

提出的大視場（條紋/點陣）結(jié)構(gòu)光照明SIM［22］裝置如圖1（a）所示：激光器發(fā)出的光經(jīng)過偏振片P1和P2后，被擴束成平行光。該照明光經(jīng)過二維光柵（80 線對/mm）后分別在45°和-45°方位上產(chǎn)生±1 級衍射光，這四個光束經(jīng)過透鏡L3后聚焦在空間光調(diào)制器（SLM，1 920×1 200 像素，像素大小8 μm，HDSLM80R，UPOLabs Co.，Ltd.，China）上的四個象限內(nèi)。為了避免聚焦光束對SLM 的損傷，實驗中在SLM 和透鏡L3的焦平面之間保留了一距離d（例如d=5 mm）。通過在四個象限上同時加載不同的灰度值圖像和二進制光柵（對兩個正交方向上±1 級衍射光的頻譜進行調(diào)制）來實現(xiàn)結(jié)構(gòu)光的相移或方向選擇。被SLM 相位調(diào)制后的照明光頻譜由望遠鏡系統(tǒng)L4-L5進一步成像到一空間掩膜板（Mask）上。如圖1（a）中插圖所示，該掩膜板包含直徑為350 μm 和間距為5.5 mm 的四個圓孔，以阻擋除45°和-45°方位上的±1 級衍射光之外的結(jié)構(gòu)光頻譜。偏振方向分別為s 和p 偏振的兩個偏振片分別放置在45°和-45°方向的±1 級頻譜位置上，避免兩個正交方向上光束之間發(fā)生干涉。隨后，生成的結(jié)構(gòu)光條紋通過望遠鏡系統(tǒng)L5-L6和由鏡筒透鏡（Tube-lens，TL）和顯微物鏡（Microscopic Objective，MO）組成的望遠鏡系統(tǒng)TL-MO 中繼到樣品平面。通常，結(jié)構(gòu)光場的頻譜會充滿物鏡MO 的后瞳，以便在樣品平面上產(chǎn)生周期最小的正弦條紋圖案。

圖1 大視場SIM 的光路示意圖Fig.1 The schematic setup of large-field SIM

在成像光路中，結(jié)構(gòu)光照明激發(fā)所產(chǎn)生的熒光由望遠鏡系統(tǒng)MO-TL 成像到CMOS 相機（4 096×3 000像素，像素尺寸3.45 μm，Basler ace acA4112-20um，Basler 視覺技術(shù)（北京）有限公司，中國）上。在該成像光路中，二向色鏡DM（FF545/650-Di01-25×36，Semrock，USA）用來分離激發(fā)光和熒光。此外，在CMOS 相機前面放置了一個濾光片（FF01-562/40-25，Semrock，USA）阻擋來自背景的激發(fā)光束和雜散光。

傳統(tǒng)SIM 使用SLM/DMD 生成條紋/點陣圖案，其數(shù)量受SLM/DMD 像素數(shù)量限制為500 個左右（每個周期用四個像素進行移相操作）。此外，由于SLM/DMD 的離散化像素結(jié)構(gòu)產(chǎn)生多級衍射光，降低所產(chǎn)生的條紋質(zhì)量和光強利用率［23］。相比之下，所提出的方法將二維光柵和SLM 相結(jié)合，能夠生成1 760 個條紋/光點（22 mm×80 線對/mm），達到傳統(tǒng)SIM 通量的3 倍。同時，該方法采用SLM 來實現(xiàn)相移操作，具有速度快、操作簡便、重復(fù)性好的優(yōu)點。

2 大視場SIM 的雙模式成像

基于圖1 所示的實驗光路，分別開展基于條紋結(jié)構(gòu)光照明的SIM 成像和基于點陣結(jié)構(gòu)光照明的SIM成像。

2.1 基于條紋結(jié)構(gòu)光的大視場SIM

首先，驗證將SLM 和針孔濾波相結(jié)合產(chǎn)生一維結(jié)構(gòu)光條紋的可行性。將SLM 第三象限的灰度值固定為0，第一象限依次設(shè)置為0、2π/3 和4π/3 相移量時所需灰度值圖像。同時，在第二象限和第四象限加載0-π 二進制相位光柵（如圖1（b）所示），通過衍射和針孔濾波來抑制該象限上±1 級衍射光束的光強，如圖2（a）所示。圖2（b）和（a）顯示了在SLM 上加載二進制光柵前后結(jié)構(gòu)光的頻譜分布。定量分析表明：在第二和第四象限加載0-π 二進制相位光柵后，經(jīng)過針孔的光強僅為原來的4.5%，可以忽略不計。最終產(chǎn)生45°方向條紋結(jié)構(gòu)光，如圖2（c）所示。采用類似操作即可獲得-45°方向的一維條紋結(jié)構(gòu)光。當(dāng)SLM 第一象限分別加載0、79 和158 灰度值時，可以獲得0、2π/3 和4π/3 相移的條紋結(jié)構(gòu)光，如圖2（e）所示。其沿同一虛線的強度分布如圖2（g）所示，對其正弦擬合結(jié)果表明，其相移分別為［0，1.84，4.67］rad，接近理論值［0，2π/3，4π/3］rad，因此該方法可提供準(zhǔn)確相移。

圖2 基于光柵投影和SLM 相移的大視場條紋和點陣結(jié)構(gòu)光Fig.2 Large-field fringe and lattice structured illumination based on grating projection and SLM phase shifting

其次，通過對直徑為240 nm、熒光發(fā)射峰值波長為580 nm（λem）的熒光小球（RF240C，激發(fā)波長532 nm，輝質(zhì)生物，上海，中國）進行成像，來證明條紋結(jié)構(gòu)光照明大視場SIM 的超分辨成像能力。在本實驗中，使用有效成像視場為690 μm×517 μm 的低倍物鏡（20×/NA0.75）（見圖3（a）），其橫向分辨率的理論值為δplan=0.61λem/NA=472 nm。實驗中，條紋結(jié)構(gòu)光在樣品平面上的周期PSIM為0.69 μm。此時，SIM 空間分辨率增強倍率：［（2×NA/λem）+1/PSIM］/（2×NA/λem）=1.6［24］倍，故而空間分辨率理論值可達247 nm。

實驗中，利用SLM 實現(xiàn)相移和選擇條紋方向，同時利用CMOS 記錄樣品在結(jié)構(gòu)光照明下的熒光圖像。最后，通過SIM 重建算法［25，26］即可獲得樣品的超分辨SIM 圖像，如圖3（a）所示。選取圖3（a）中不同位置的5 個感興趣區(qū)域?qū)?yīng)的寬場圖像和SIM 圖像進行放大比較。通過對虛線處兩個相鄰小球的強度曲線分析（如圖3（b）所示），可以發(fā)現(xiàn)SIM 成像模式相比寬場成像模具有更高的空間分辨能力。為了定量評估橫向分辨率，從圖3（a）中隨機選擇了20 個熒光小球，統(tǒng)計結(jié)果如圖3（c）所示，寬場圖像的小球的半高全寬（Full Width at Half Maximum，F(xiàn)WHM）為543±20 nm，SIM 對應(yīng)的FWHM 為302±13 nm，即SIM 成像模式將空間分辨率提升了1.8 倍。需要指出的是，由于成像系統(tǒng)中存在像差，因此兩種成像模式的空間分辨率均低于理論分辨率，并且由于SIM 重建中使用的去卷積操作有助于空間分辨率提升，進而實驗測得的分辨率增強倍率（1.8 倍）高于理論分辨率增強倍率（1.6 倍）。

圖3 直徑240 nm 熒光小球的寬場和SIM 成像比較Fig.3 Wide-field and SIM imaging on 240 nm-diameter fluorescent beads

除了分辨率增強外，空間帶寬積（Spatial Bandwidth Product，SBP）也是光學(xué)成像系統(tǒng)的一個重要參量。SBP 越大，通過光學(xué)系統(tǒng)所獲得的信息越多。SBP 可以通過視場除以最小可分辨的有效區(qū)域來估計，對于該系統(tǒng)，SBP 可計算為：（4 000×3.45 μm/20）×（3 000×3.45 μm/20）/（π×0.3022μm2）=125 萬；對于傳統(tǒng)SIM，其有效視場受限于SLM/DMD 的像素數(shù)，考慮到每個周期用3 個像素采樣，生成與該系統(tǒng)相同的條紋（周期0.69 μm）時，一個1 920×1 080 像素的SLM/DMD 只能覆蓋442 μm×248 μm 的視場（每個條紋周期由4 個像素所采樣），對應(yīng)有效SBP 為：442×248 μm2/（π×0.3022μm2）=38 萬?？傻迷撓到y(tǒng)相比傳統(tǒng)SIM具有3 倍的SBP 增強［9］。

2.2 基于點陣結(jié)構(gòu)光的大視場SIM

基于圖1 所示實驗光路，還可以用于產(chǎn)生二維點陣結(jié)構(gòu)光，以更快的速度實現(xiàn)快速超分辨成像。相比條紋結(jié)構(gòu)光照明，在產(chǎn)生點陣結(jié)構(gòu)光時無需在SLM 上加載0-π 二進制相位光柵。為了實現(xiàn)二維點陣的相移操作，僅需在SLM 四個象限加載不同灰度值圖像。具體地，將SLM 第三和第四象限的相位固定為0，將第一和第二象限的相位進行成對變化（如圖1（c）所示），可以實現(xiàn)對兩組相互垂直的條紋結(jié)構(gòu)光的相移操作。方便起見，用φr，i和φs，j表示第一和第二象限的相位，下標(biāo)i和j分別表示在第一和第二象限上執(zhí)行的相移次數(shù)。具體地，依次在SLM［第一象限，第二象限］上加載［0，0］、［0，2π/3］、［0，4π/3］、［2π/3，0］和［4π/3，2π/3］的相位組合，來獲得5 組點陣結(jié)構(gòu)光。圖2（d）為相移量組合［0，0］時的結(jié)構(gòu)光圖案，圖2（f）和（h）分別為對應(yīng)相移量組合［0，0］、［0，2π/3］、［0，4π/3］的相移點陣結(jié)構(gòu)光圖案和強度分布。通過對強度曲線正弦擬合可以得出，此例中點陣結(jié)構(gòu)光的相移誤差為0.26 rad，說明該方法具有較高的相移精度。通過依次記錄樣品在以上5 組點陣結(jié)構(gòu)光照明下的低分辨熒光圖像，結(jié)合再現(xiàn)方法，便可得到空間分辨率超越衍射極限的SIM 圖像。

簡要介紹點陣結(jié)構(gòu)光的再現(xiàn)方法。在點陣SIM 中，點陣圖案是由兩組垂直的條紋結(jié)構(gòu)光非相干疊加生成的，因此其強度分布可以表示為

式中，r表示二維空間位置矢量；I0（r）表示點陣光的直流分量；ms、mt是沿45o和-45o方向條紋結(jié)構(gòu)光的調(diào)制深度；κs和κt是分別沿45°和-45°方向兩組正交條紋的空間頻率。

在點陣結(jié)構(gòu)光Ii，j(r)的照明下，被熒光標(biāo)記的樣品S（r）由顯微成像單元MO-TL 成像到CMOS 相機。此時，樣品的熒光圖像強度分布為S·Ii，j(r)與系統(tǒng)的強度點擴散函數(shù)hD（r）的卷積，即

式中，Di，j(r)表示相機記錄的強度分布。對式（2）進行傅里葉變換，可得

式中，k為頻率域的坐標(biāo)矢量和分別為Di，j（r）、hD（r）、S（r）和Ii，j(r)的頻譜。將式（1）代入式（3）可得

式中，

點陣SIM 比條紋結(jié)構(gòu)光照明SIM 具有更快的成像速度。SLM 的幀速率（Frames Per Second，F(xiàn)PS）為60 幀/s，CMOS 相機在全幀曝光模式下的最大幀速率為23 幀/s。條紋結(jié)構(gòu)光SIM 需要拍攝6 幅原始圖像重建單幅超分辨圖像，因此其超分辨率成像速度最快為23/6 幀/s。相比之下，點陣結(jié)構(gòu)光SIM 需要記錄5 幅原始圖像來重構(gòu)一幅超分辨圖像，因此點陣結(jié)構(gòu)光SIM 超分辨率成像速度為23/5 幀/s。

同樣利用直徑為240 nm 的熒光小球驗證點陣結(jié)構(gòu)光照明大視場SIM 的超分辨成像能力。圖4（a）所示分別為在相移組合［0，0］、［0，2π/3］、［0，4π/3］、［2π/3，0］和［4π/3，2π/3］結(jié)構(gòu)光照明對應(yīng)的5 幅熒光圖像Irs，0（x，y）、Ir，1（x，y）、Ir，-1（x，y）、Is，1（x，y）和Is，-1（x，y）。其中，從圖4（a）的放大圖像中可以明顯看到二維點陣結(jié)構(gòu)光對應(yīng)的“棋盤”圖樣。同時，從Irs，0（x，y）的頻譜分布中可以看出（如圖4（b）所示），其頻譜由沿著±45°方向的0，±1 級衍射光頻譜組成，該結(jié)果表明點陣結(jié)構(gòu)光照明光是由兩組正交方向的條紋結(jié)構(gòu)光非相干疊加而成，且不同結(jié)構(gòu)光之間不存在交叉干涉項。

圖4 點陣結(jié)構(gòu)光照明下熒光小球的原始熒光圖像Fig.4 Raw fluorescence image of fluorescent beads under lattice illumination

利用再現(xiàn)方法獲得不同方向的頻率分量后，結(jié)合與傳統(tǒng)SIM 相同的重構(gòu)方式，熒光小球的超分辨SIM圖像如圖5（a）所示，為了便于比較，在圖中并列放置了該樣品對應(yīng)的寬場熒光圖像。通過對圖中感興趣區(qū)域?qū)?yīng)的寬場熒光圖像和SIM 圖像進行放大比較，且對兩個相鄰小球進行強度曲線分析可以發(fā)現(xiàn)，SIM 圖像能夠展現(xiàn)出樣品更多的細節(jié)結(jié)構(gòu)。此外，從圖5（a）中隨機選擇20 個熒光小球，并統(tǒng)計其強度分布的半高全寬（FWHM），如圖5（c）所示。統(tǒng)計結(jié)果為，寬場成像的小球的FWHM 為560±30 nm，SIM 對應(yīng)的FWHM 為313±24 nm，即結(jié)構(gòu)光照明將空間分辨率提升了1.78 倍。

圖5 直徑為240 nm 熒光小球的寬場和點陣SIM 成像比較Fig.5 Wide-field and lattice SIM imaging on 240 nm-diameter fluorescent beads

為了進一步驗證點陣結(jié)構(gòu)光照明大視場SIM 的超分辨成像能力，分別利用寬場和點陣SIM 對小鼠干細胞中的微管結(jié)構(gòu)進行成像。實驗中，用一級抗體（β-Tubulin，#2146，兔抗）和二級抗體（IgG（H+L）-Alexa Fluor 532，羊抗兔）標(biāo)記小鼠干細胞中的微管結(jié)構(gòu)。圖6（a）的左右兩側(cè)分別為該樣品的寬場和基于點陣結(jié)構(gòu)光的SIM 圖像。圖6（b）放大展示了圖6（a）中橙色方框?qū)?yīng)子區(qū)域的寬場和SIM 圖像，對比發(fā)現(xiàn)SIM 圖像具有更多細節(jié)結(jié)構(gòu)和更高的信噪比。其中，前者受益于SIM 的超分辨能力，后者受益于SIM 的層析能力。為了更加直觀地比較寬場圖像和SIM 圖像的空間分辨能力，圖7（a）展示了圖6（b）中寬場和SIM 圖像中相同虛線位置的強度分布。對比兩條曲線可以看出：點陣結(jié)構(gòu)光照明SIM 可分辨寬場成像無法分辨的微管結(jié)構(gòu)。同時，利用基于去相關(guān)空間分辨率的分析方法［27］對圖6（b）中寬場和SIM 圖像進行評定。圖7（b）和（c）中的分析結(jié)果表明：寬場和SIM 圖像的空間截止頻率分別為3.0 μm-1和6.4 μm-1，對應(yīng)空間分辨率分別為0.67 μm 和0.31 μm。需要說明的是，由于點陣結(jié)構(gòu)光照明SIM 通過評估信號和噪聲之間的相對權(quán)重來測定空間分辨率，與寬場成像相比分辨率提升超過兩倍；并且該方法中的相移操作可以抑制離焦背景噪聲，使空間分辨率的預(yù)測值也得到了提升。與SBP 分析類似，基于光柵投影和SLM 相移的點陣結(jié)構(gòu)光SIM 相比傳統(tǒng)SIM 具有3 倍的SBP 增強［9］。

圖6 寬場和點陣SIM 對Alexa fluor 532 標(biāo)記下固定小鼠干細胞中微管的成像比較Fig.6 Wide-field and lattice SIM image of the microtubules in fixed mouse stem cells labeled with Alexa fluor 532

圖7 寬場和點陣SIM 成像的空間分辨率比較Fig.7 Comparison of spatial resolution of wide-field and lattice SIM imaging

3 結(jié)論

本文介紹了一種基于光柵投影和SLM 相移的大視場SIM 技術(shù)?；谕粚嶒炑b置，實現(xiàn)了條紋結(jié)構(gòu)光照明和點陣結(jié)構(gòu)光照明，具有成像速度快、視場大、分辨率高的優(yōu)點。與傳統(tǒng)基于SLM/DMD 投影的SIM技術(shù)相比，該方法產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光的個數(shù)不受投影器件限制，其成像通量是傳統(tǒng)SIM 的3 倍（目前主要受限于CMOS 相機的通量）。該技術(shù)通過采用振幅光柵投影，避免了SLM/DMD 投影中的色散效應(yīng)，可以直接用于多色SIM 成像。與現(xiàn)有的基于光柵投影的SIM 相比，該方法利用SLM 進行相移，具有更快的成像速度（目前受制于CMOS 相機的曝光時間，最終超分辨成像速度最快為23/5 幀/s）。目前，結(jié)構(gòu)光的照明方向被限制在兩個正交方向。通過采用Dammam 光柵，可在三個或更多方向上生成結(jié)構(gòu)光照明，從而實現(xiàn)各向同性的空間分辨率增強。然而，大視場SIM 也存在一些不足：首先，當(dāng)采用單向條紋結(jié)構(gòu)光照明時，會損失50%的光照強度；其次，由于需要同時使用物理光柵和SLM 來產(chǎn)生相移結(jié)構(gòu)光，具有相對復(fù)雜的裝置。點陣結(jié)構(gòu)光照明與條紋結(jié)構(gòu)光照明相比各有優(yōu)勢，點陣結(jié)構(gòu)光照明僅需要記錄5 幅原始強度圖樣就可以重建出樣品超分辨相位圖像，具有更快的成像速度；另外條紋結(jié)構(gòu)光可以充分利用CMOS 相機的灰度階（不需要復(fù)用兩組正交結(jié)構(gòu)光照明下的強度圖像），具有更高的信噪比。

隨著人工智能（尤其是深度學(xué)習(xí)技術(shù)）的不斷發(fā)展，大視場結(jié)構(gòu)光照明SIM 的超分辨重建速度，以及相位/熒光雙模式成像的融合速度將會得到大幅提升。期望本文介紹的結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)可以被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、材料化學(xué)等研究領(lǐng)域。