超聲波輔助酶解法制備豆粕ACE抑制肽的工藝優(yōu)化

苑園園

（衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北 衡水 053000）

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）在血壓調(diào)節(jié)方面具有極其重要的作用[1]。血管緊張素I（angiotensin I，Ang I）不能使血壓升高，但它能被ACE酶轉(zhuǎn)變?yōu)橛袕娚龎夯钚缘难芫o張素II（angiotensin II，Ang II），同時能阻止降壓物質(zhì)緩激肽的釋放，最終促使血壓升高[2]。

目前，制備ACE抑制肽的方法有酶水解法、化學(xué)合成法、基因重組法等。因為操作簡便、反應(yīng)條件易控[3-5]，酶解法得到普遍使用。不同的酶存在不同的切割位點[6]，因而會產(chǎn)生不同功能活性的肽，所以篩選最適合產(chǎn)生高活性的ACE抑制肽的酶非常重要。然而傳統(tǒng)的酶解方法效率低、水解產(chǎn)物ACE抑制率低。制備ACE抑制肽僅用單一方法的效果是非常有限的，已有不少研究發(fā)現(xiàn)通過復(fù)合方法[7-8]，可明顯提高提取率并降低成本。

檢測ACE抑制肽活性的體內(nèi)法主要是動物實驗，體外法采用紫外分光光度法、熒光測定法[9]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[10]、酶偶聯(lián)法[11]等。最常用的是 Cushman等[12]建立的紫外分光光度法，該方法以馬尿酰組氨酰亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）為底物，按照一定的順序先后加入ACE酶和ACE抑制肽發(fā)生反應(yīng)，然后用乙酸乙酯萃取生成的馬尿酸（hippuric acid，Hip），在228 nm波長下測定Hip的吸光度。

脫脂豆粕中的蛋白質(zhì)含量高[13]，作為大豆油加工的副產(chǎn)品[14]，是生產(chǎn)食源性ACE抑制肽的優(yōu)質(zhì)原料。傳統(tǒng)制備ACE抑制肽的方法是蛋白酶水解法，加入超聲波預(yù)處理輔助酶解，利用超聲波的空化效應(yīng)及機械剪切對原料的破碎作用[15-16]，可縮短酶解時間、提高效率。超聲波輔助酶解法制備豆粕ACE抑制肽的研究鮮見報道。本文以脫脂豆粕為原料，通過響應(yīng)面法對超聲波輔助酶解法水解條件進行優(yōu)化，旨在為ACE抑制肽的深入研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕、新鮮豬肺：市售。

堿性蛋白酶（10萬 U/g）、中性蛋白酶（10萬 U/g）和酸性蛋白酶（10萬U/g）：河南仰韶生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（10萬U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；胰蛋白酶（10萬U/g）：河南萬邦實業(yè)有限公司；馬尿酰組氨酰亮氨酸（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白（分析純）：合肥博美生物科技公司；考馬斯亮藍G250、甘氨酸（分析純）：天津大茂化學(xué)試劑廠；磷酸、硼酸、四硼酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙醇95%、乙酸乙酯（分析純）：天津市紅巖化學(xué)試劑廠；鹽酸（分析純）：煙臺遠東精細化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1高速組織搗碎機：上海標本模型廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州榮華儀器制造有限公司；UV-5500紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；Alpha 1-4 LDplus真空冷凍干燥器：德國Christ公司；BGZ-Ⅱ電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司；KS800KDV液晶超聲波清洗器：昆山潔力美超聲儀器有限公司；ST3100 pH計：奧豪斯儀器（常州）有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ACE粗酶的制備

新鮮豬肺4℃冷藏10 h，將血管、脂肪、黏膜清除，于高速組織搗碎機間歇研磨5 min，使?jié){液充分混勻。每5 g勻漿中加入6 mL硼酸緩沖液，置4℃冰箱內(nèi)浸提18 h～24 h，然后8 000 r/min離心15 min，倒出已分層的上清液，冷凍干燥密閉保藏備用[17]。

1.3.2 水解度的測定

1.3.2.1 牛血清白蛋白標準曲線的繪制

量取蛋白質(zhì)標準溶液 0、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48、0.72、0.84、0.96mL于10mL比色管中（以上各管蛋白質(zhì)含量分別為 0、0.003、0.006、0.012、0.024、0.048、0.072、0.084、0.096 mg），分別加入蒸餾水 1.00、0.97、0.94、0.88、0.76、0.52、0.28、0.16、0.04 mL，再補加 5 mL 考馬斯亮藍G250溶液，充分混勻，將比色管穩(wěn)定2 min后測定吸光度。用蒸餾水調(diào)零，設(shè)定紫外可見分光光度計波長595 nm，測定吸光度[18]。以橫坐標為牛血清白蛋白濃度（mg/mL），縱坐標為吸光度，制作標準曲線。

1.3.2.2 水解度的計算

準確吸取樣液1.0 mL，稀釋一定的倍數(shù)，加入5 mL考馬斯亮藍G250溶液，同1.3.2.1操作測定吸光度，然后根據(jù)1.3.2.1中的回歸方程，計算水解度（degree of hydrolysis，DH）。

1.3.3 ACE抑制率的測定

取 50 μL 5 mmol/L HHL 與 50 μL ACE 抑制肽混勻，37℃水浴預(yù)熱5 min，然后再加入40 μL12.5 mg/mL ACE溶液搖勻，37℃水浴反應(yīng)30 min，加入 200 μL 1 mol/LHCl使反應(yīng)停止，再加入4℃1mL預(yù)冷過的乙酸乙酯分離出馬尿酸，漩渦振蕩混勻，4℃、4 000 r/min條件下離心15 min，吸取酯層750 μL到另一試管，120℃烘箱烘15 min，冷卻后再加入3 mL蒸餾水，漩渦振蕩20 s，用50 μL硼酸緩沖溶液代替ACE抑制肽作為空白。設(shè)定紫外分光光度計波長228 nm，測定吸光度，并計算ACE抑制率。

式中：A為加入ACE抑制肽時的吸光度；B為未加入ACE抑制肽時的吸光度，即對照；B0為空白反應(yīng)的吸光度，即空白。

1.3.4 最適蛋白酶的選擇

利用傳統(tǒng)酶解法，選用5種蛋白酶分別酶解豆粕蛋白，以ACE抑制率和水解度為衡量指標，來確定最適蛋白酶。5種蛋白酶的最佳水解條件見表1。

表1 5種蛋白酶的最佳水解條件Table 1 The optimum hydrolysis conditions of five proteases

1.3.5 酶法制備豆粕ACE抑制肽

將豆粕按料液比1∶10（g/mL）加入50 mL離心管中，調(diào)節(jié)pH值至蛋白酶的最適pH值，于該酶的最適溫度下水浴保溫5 min，添加5%蛋白酶混勻，酶解一段時間后，沸水加熱15 min使酶失活，4 000 r/min離心5 min，取上清液測定ACE抑制率和水解度。

1.3.6 超聲波輔助酶解法制備豆粕ACE抑制肽

準備干燥潔凈的50 mL離心管，將豆粕按料液比1∶10（g/mL）加入其中，設(shè)定超聲波功率100 W，在55℃超聲30 min，后面試驗操作同1.3.5。

1.3.7 單因素試驗

準確稱量5份質(zhì)量為2.000 0 g的豆粕，在超聲溫度 40、50、60、70、80 ℃，超聲時間 20、30、40、50、60 min，料液比 1 ∶4、1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12（g/mL），加酶量5%、6%、7%、8%、9%，酶解時間 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，超聲波功率100 W的條件下提取ACE抑制肽，以水解度和ACE抑制率為衡量指標，考察超聲溫度、超聲時間、料液比、加酶量、酶解時間對ACE抑制率、水解度的影響。

1.3.8 響應(yīng)面試驗設(shè)計

響應(yīng)值為ACE抑制率（Y），基于單因素試驗結(jié)果，選擇對響應(yīng)值有較大影響的因素（超聲溫度、超聲時間、加酶量、酶解時間），依據(jù)Box-Behnken，做四因素三水平響應(yīng)面試驗。試驗設(shè)計的因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗的因素和水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)為3次平行試驗的平均值，運用Design Expert 8.0.6軟件擬合回歸方程，并對數(shù)據(jù)模型進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的確立

按1.3.2.1方法制作標準曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 牛血清白蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

由圖1可知，回歸方程為y=7.275 1x+0.029 9，R2=0.992 2，牛血清白蛋白標準溶液在0～0.096 mg/mL范圍，呈良好的線性關(guān)系。

2.2 最適蛋白酶的確定

不同酶水解物的ACE抑制率和水解度見表3。

表3 不同酶水解物的ACE抑制率和水解度Table 3 ACE inhibition rate and degree of hydrolysis of different enzymatic hydrolysates

由表3可知，單一蛋白酶酶解結(jié)果最佳的是堿性蛋白酶，經(jīng)4.0 h的水解反應(yīng)，水解度為92.99%，ACE抑制率為59.38%。堿性蛋白酶是一種內(nèi)切酶，大多結(jié)合疏水性氨基酸，產(chǎn)生大量具有ACE抑制活性的小肽[19]，所以本試驗選擇堿性蛋白酶水解豆粕。雖然中性蛋白酶也是內(nèi)切酶，但堿性蛋白酶活性高于中性蛋白酶[20]；木瓜蛋白酶具有較廣的作用范圍以及中等水解能力[21]；或許是由于胰蛋白酶抑制劑存在于豆粕中，胰蛋白酶酶解液的ACE抑制率相對較??；豆粕蛋白在堿性環(huán)境下溶出率較高，而酸性蛋白酶的最適pH值較低，所以酸性蛋白酶水解產(chǎn)物的ACE抑制率最低。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 超聲溫度對ACE抑制率和水解度的影響

超聲溫度對ACE抑制率和水解度的影響見圖2。

圖2 超聲溫度對ACE抑制率和水解度的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

由圖2可知，超聲溫度為70℃時，ACE抑制率達到最大值59.66%，水解度為91.44%，溫度高于70℃時，水解度和抑制率都開始減小，因此選定超聲溫度60、70、80℃開展后續(xù)試驗。

2.3.2 超聲時間對ACE抑制率和水解度的影響

超聲時間對ACE抑制率和水解度的影響見圖3。

圖3 超聲時間對ACE抑制率和水解度的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

由圖3可知，超聲時間為40 min時，ACE抑制率達最大，為58.53%，水解度為91.79%。水解度的總體變化較小。ACE抑制率先降低后升高再緩慢降低，分析是因為超聲波對豆粕蛋白的空化作用，疏散了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，展現(xiàn)出隱藏在蛋白質(zhì)里面的活性部位，但超聲處理時間過長，會損壞展現(xiàn)的ACE抑制活性部位，導(dǎo)致活性降低或失去活性。因此選擇超聲時間30、40、50 min進行后續(xù)試驗。

2.3.3 料液比對ACE抑制率和水解度的影響

料液比對ACE抑制率和水解度的影響見圖4。

圖4 料液比對ACE抑制率和水解度的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

由圖4可知，料液比為1∶6（g/mL）時，ACE抑制率達最大，為53.03%，水解度為90.65%。水解度總體變化較小。溶劑體積小時，溶液濃度過大，流動性差，不利于攪拌，酶與底物接觸不充分，致使酶解不完全；溶劑體積大時，溶液稀釋，酶濃度降低，影響了反應(yīng)的進行。因此選定料液比為1∶6（g/mL）。

2.3.4 加酶量對ACE抑制率和水解度的影響

加酶量對ACE抑制率和水解度的影響見圖5。

圖5 加酶量對ACE抑制率和水解度的影響Fig.5 Influence of enzyme dosage on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

由圖5可知，當加酶量達到7%時，ACE抑制率達最大，為55.93%，水解度為91.13%。水解度總體變化較小。ACE抑制率先升高再降低，這是因為一種酶在特定的蛋白質(zhì)分子中有固定數(shù)量的活性位點，當酶的濃度較高時，溶液中的酶與底物之間的活性位點達到飽和[22]。因此選擇加酶量6%、7%、8%進行后續(xù)試驗。

2.3.5 酶解時間對ACE抑制率和水解度的影響

酶解時間對ACE抑制率和水解度的影響見圖6。

圖6 酶解時間對ACE抑制率和水解度的影響Fig.6 Influence of enzymatic hydrolysis time on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis

由圖6可知，酶解時間為3.5 h時，水解液的ACE抑制率達最大值，為56.95%，水解度為91.98%。隨著酶解時間的延長，能與酶結(jié)合并作用的特異性肽鍵數(shù)量下降，ACE抑制率開始變小，水解度總體變化較小。因此選擇酶解時間3.0、3.5、4.0 h進行后續(xù)試驗。

2.4 響應(yīng)面結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Experimental design and results of response surface

利用Design-Expert 8.0.6處理試驗數(shù)據(jù)，得到三元二次回歸擬合方程如下。

回歸模型的方差分析見表5。

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model

由表5可知，該模型差異極顯著（P＜0.000 1）。該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.990 8，校正決定系數(shù)R2Adj=0.981 5，說明預(yù)測值與實際值擬合較好。該模型的失擬項P=0.084 3＞0.05表示失擬不顯著，說明試驗誤差較小。方程中一次項A、B、D以及二次項和交互項均對ACE抑制率影響極顯著，C影響顯著。

運用Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)化參數(shù)，各因素交互作用的響應(yīng)面圖及等高線圖見圖7。

圖7 4個因子交互作用的響應(yīng)面圖以及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plot of the interaction of the four factors

若響應(yīng)曲面坡度越大，說明對水解液ACE抑制率影響越大，等高線為橢圓形，說明因子間交互作用越強。由圖7可知，超聲溫度（A）、超聲時間（B）、加酶量（C）和酶解時間（D）的等高線均為橢圓形，表明兩因素之間交互作用較強。由加酶量（C）與超聲溫度（A）、超聲時間（B）和酶解時間（D）的交互響應(yīng)面圖可以看出，加酶量對應(yīng)的響應(yīng)曲面相對比較平滑，說明該因素對水解液ACE抑制率的影響作用相比其它3個因素較小。

為求得模型極值點，用Design Expert 8.0.6軟件解出回歸方程，確定脫脂豆粕ACE抑制肽的最優(yōu)提取工藝條件為超聲溫度72.53℃、超聲時間39.42 min、加酶量7.20%、酶解時間3.69 h，理論上預(yù)測ACE抑制率為61.71%。

2.5 驗證優(yōu)化結(jié)果

為使操作可行，將影響ACE抑制率的4個主要因素的最佳水平調(diào)整為超聲溫度73℃、超聲時間39 min、加酶量7.20%、酶解時間3.6 h，并進行3次平行試驗得出ACE抑制率的平均值為61.02%，同預(yù)測值相差較小，說明該模型準確性和重復(fù)性高，在實際應(yīng)用中具有很好的可操作性。

3 結(jié)論

ACE底物特異性較廣，水解度大并不代表ACE抑制率大，因此水解度與ACE抑制率二者之間沒有關(guān)聯(lián)性。本文采用超聲波輔助酶解法制備豆粕ACE抑制肽，超聲空化作用能暴露出蛋白分子更多活性部位，使ACE抑制率得到提高。經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化試驗，最終確定最佳工藝為在超聲溫度73℃、超聲時間39 min、料液比1∶6（g/mL）的條件下加入7.20%堿性蛋白酶水解3.6 h。在此條件下所制備的豆粕ACE抑制肽的ACE抑制率為61.02%。該方法使豆油加工副產(chǎn)品豆粕實現(xiàn)高值化綜合利用，但對水解產(chǎn)物具體成分的分離純化和作用機制尚待深入研究。