葛根素的提取及生物活性分析

趙麗平，張雯雯，汪金萍，劉琦，陳瓊

（信陽農(nóng)林學院，河南 信陽 464000）

葛根為豆科植物野葛的干燥塊根，人們經(jīng)常用作食用蔬菜，也可用作藥物，素有“千年人參”的美譽[1]。在我國葛根資源極為豐富，除新疆、西藏、青海外，各省均有分布，豫南大別山區(qū)也盛產(chǎn)野生葛。葛根的主要有效成分是以葛根素、大豆苷、大豆苷元為代表的異黃酮類化合物，其中葛根素含量最高[2]。研究表明葛根提取物具有血管舒張、神經(jīng)保護、心臟保護、抗癌、抗氧化、抗炎癥等作用[3-5]。目前文獻中對葛根素的提取方法、葛根素和葛根異黃酮粗提液的抗氧化及抑菌活性均有研究[6-8]，而對純化后的葛根素體外抗氧化及體外抑菌活性分析鮮有報道。本研究以河南省大別山區(qū)的野葛根為原料，采用超聲波輔助提取葛根素，通過與糖精形成超分子復合物純化葛根素，利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定其含量，用清除自由基的方法測試純化的葛根素的體外抗氧化活性，用濾紙片法研究純化的葛根素的體外抑菌活性，以期使信陽大別山區(qū)葛根資源得到充分利用，為葛根研究藥物開發(fā)及食品加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑及儀器

葛根：河南新縣豫南葛業(yè)有限公司；過硫酸鉀、無水乙醇（均為分析純）：中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑總公司；水楊酸（分析純）：石家莊市有機化工廠；硫酸亞鐵：信陽市化學試劑廠；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2′-azino-bis（3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]（均為分析純）：福州飛凈生物科技有限公司；雙氧水（分析純）、甲醇（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；維生素C（分析純）：成都化夏化學試劑有限公司；葛根素標準品：成都植標化純生物技術有限公司。

營養(yǎng)瓊脂：北京奧博星生物技術有限責任公司；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、繩狀青霉菌（Penicillium rope）、黑曲霉菌（Aspergillus niger）：信陽農(nóng)林學院微生物實驗室提供。

KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀：天津港東科技發(fā)展股份有限公司；1100型高效液相色譜儀：日本島津公司；XFS-30CA電熱式壓力蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2F凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；HM-SY96A酶標儀：山東恒美電子科技有限公司；GHA-300Y恒溫搖床：杭州綠博儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葛根素的制備及純化

將干燥的葛根粉碎后過100目篩，稱取粉碎后的葛根粉50 g，參考文獻[9-10]的方法制備，按液料比25∶1（mL/g）加70%乙醇溶液，在超聲功率350W、60℃條件下提取2 h，過濾去除濾渣；濾液在25℃、4 000 r/min條件下離心10 min后，過濾；再蒸發(fā)濃縮濾液至原體積的1/2～1/3后，得葛根素粗提液。低溫烘干得到葛根素粗提物9.53 g。

利用葛根素粗提物，參照文獻[11]的方法純化，通過與糖精形成超分子復合物，再調節(jié)溶液pH值為4，得到葛根素結晶。洗滌干燥后作為葛根素樣品儲藏備用。

1.2.2 葛根素含量測定

色譜條件：色譜柱為Pgrandsil C18分析柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為甲醇∶36%乙酸∶蒸餾水=25∶3∶72（體積比）；流速 1.0 mL/min；柱溫 30℃；檢測波長250 nm；運行時間30 min；進樣量10 μL。利用外標法計算葛根素樣品中葛根素含量。

1.2.3 溶液的制備

精密稱量葛根素對照品1.0 mg，加甲醇10 mL定容，即得葛根素對照品溶液。取葛根素樣品5.0 mg于錐形瓶中，加甲醇50 mL定容至刻度線，即得0.1 mg/mL葛根素樣品溶液。

1.2.4 紅外光譜測定

將葛根素與KBr按質量比1∶100充分研磨混勻后壓片。以KBr為空白，置于傅里葉變換紅外光譜儀，在4 000 cm-1～500 cm-1區(qū)間內進行紅外光譜掃描。

1.3 葛根素樣品抗氧化活性試驗

1.3.1 葛根素樣品對ABTS+自由基清除能力的測定

參照文獻[12]的方法進行改良，配制7mmol/LABTS溶液5 mL與140 mmol/L過硫酸鉀溶液88 μL混合，在25℃靜置避光12 h，得到ABTS+自由基儲備液。使用前用無水乙醇稀釋，使其在734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02，得ABTS+自由基工作液。用無水乙醇制備葛根素樣品溶液，使其濃度分別為4.5、8.5、12.5、16.5、20.5、24.5 mg/mL。向試管中依次加入 1.0 mL 的ABTS+自由基工作液和3.0 mL不同濃度的葛根素乙醇溶液，搖勻后放置15 min，在734 nm波長下測其吸光度，記為A樣品。無水乙醇代替ABTS+自由基工作液測其吸光度，記為A對照。無水乙醇代替樣品溶液測其吸光度，記為A空白。陽性對照用維生素C溶液代替樣品液，試驗平行3次，取平均值，按式（1）計算ABTS+自由基清除率。

1.3.2 葛根素樣品對DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的質子自由基，其甲醇溶液顯紫色，當與具有抗氧化活性物質反應后，溶液顏色由紫色逐漸變?yōu)闊o色，吸光度變小，通過測定DPPH自由基的吸光度變化來評價抗氧化物質的抗氧化活性[13]。

參照文獻[13]的方法，稍作改動。取質量濃度為4.5、8.5、12.5、16.5、20.5、24.5 mg/mL 的葛根素樣品溶液2.0mL，均加入濃度為2mmol/LDPPH-甲醇溶液2.0mL，25℃避光1h后在517 nm處測定其吸光度，記為A樣品。甲醇代替DPPH-甲醇溶液測其吸光度，記為A對照。甲醇代替樣品溶液測其吸光度，記為A空白。陽性對照用維生素C溶液代替樣品液，試驗平行3次，取平均值，按式（2）計算DPPH自由基清除率。

1.3.3 葛根素樣品對羥基自由基清除能力的測定

H2O2和 FeSO4混合發(fā)生芬頓（Fenton）反應，生成具有高反應活性的羥基自由基，水楊酸能有效地捕捉羥基自由基，并產(chǎn)生紫色物質。采用Fenton反應法，參照文獻[14]的方法進行改良，用蒸餾水配制濃度為4.5、8.5、12.5、16.5、20.5、24.5 mg/mL 的葛根素樣品溶液，依次取2.0 mL不同濃度的葛根素樣品液，向各試管中加入9 mmoL/L FeSO4溶液2.0 mL和9 mmoL/L水楊酸溶液2.0 mL，搖勻后，再加入8.8 mmoL/L過氧化氫2.0 mL和蒸餾水2.0 mL，搖勻后蓋上塞子，于37℃水浴鍋中加熱30 min，在510 nm處測其吸光度，記為A樣品。設置樣品對照組試驗，用相同體積的蒸餾水代替H2O2溶液測定吸光度，記為A對照。使用相同體積的蒸餾水代替樣品溶液測定吸光度，記為A空白。用維生素C溶液代替樣品溶液做陽性對照。試驗平行3次，取平均值，按式（3）計算羥基自由基的清除率。

1.4 葛根素樣品抑菌活性試驗

1.4.1 培養(yǎng)基的配制

營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基[15]：稱取營養(yǎng)瓊脂33 g于1 000 mL錐形瓶中，加入適量蒸餾水，加熱融化，攪拌搖勻、定容至1 000 mL，調pH值為7.0±0.2，蓋上塞子并包扎好，高壓蒸汽滅菌30 min備用。

馬鈴薯液體培養(yǎng)基：取去皮并切成小塊的馬鈴薯200 g，加蒸餾水1 000 mL煮沸30 min，然后用4層脫脂棉過濾取上清液，加入葡萄糖20 g，攪拌均勻后補加蒸餾水至1 000 mL，調pH值到7.0±0.2，高壓滅菌備用。馬鈴薯固體培養(yǎng)基則另加瓊脂15 g～20 g，其他條件相同。

1.4.2 菌懸液的制備

參照文獻[16]的方法，用馬鈴薯液體培養(yǎng)基制備黑曲霉菌、繩狀青霉菌菌懸液，在25℃～28℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)72 h后備用。用營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基制備枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌菌懸液，在37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后備用。

1.4.3 抑菌圈的測定

該試驗參考文獻[16]，稍作改動。將直徑為6 mm的圓形濾紙片經(jīng)高壓滅菌后，分別放入6種濃度為6.5、8.5、10.5、12.5、14.5、16.5 mg/mL 的葛根素樣品液中浸泡2 h。將上述菌懸液用移液槍分別吸取100 μL注射到不同的瓊脂平板表面，涂布均勻，制成大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、黑曲霉菌、繩狀青霉菌含菌平板。取浸泡過不同濃度葛根素樣品的濾紙片貼在含菌平板上，每個培養(yǎng)皿中各放置4片浸泡過同一濃度樣品液的濾紙片。以蒸餾水為空白對照組。將貼好濾紙片的含菌平板封好置于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后用游標卡尺測量其抑菌圈的直徑，取其平均值。

1.4.4 葛根素樣品對G+和G－最低抑菌濃度的測定

最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）是衡量抗生素抗菌活性的指標，指體外培養(yǎng)18 h～24 h后能抑制培養(yǎng)基中致病菌生長的最低藥物濃度[17]。大多數(shù)近球形細菌的最大吸收波長為600 nm，形狀規(guī)則的菌液濃度與吸光度呈線性關系。因此，大多數(shù)細菌的測定通常選擇菌液在600 nm處的吸光度[18]；該試驗以大腸桿菌為革蘭氏陰性試驗菌，以金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性試驗菌來分析其最小抑菌濃度的差異[19]。

參考李橋妹等[20]的方法，稍作修改。分別取10 mL培養(yǎng)液于試管中，加入0.2 mL不同的菌懸液，加入1.0 mL不同濃度的葛根素樣品液，再加入0.8 mL丙酮，使其配制成總體積為12 mL的混合液，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h。陽性對照液：只加菌懸液，不加葛根素樣品和丙酮；陰性對照液：不加菌懸液的混合液。測定各試管中混合液的OD600nm值，與陰性對照管OD600nm值相同的最小葛根素樣品濃度，即為最低抑菌濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)平行測定3次取平均值，采用通過SPSS、Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖片繪制。

2 結果與討論

2.1 葛根素含量測定結果

葛根素對照品和葛根素樣品HPLC色譜圖見圖1、圖2。

圖1 葛根素對照品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of puerarin control product

利用外標法計算葛根素樣品中葛根素含量為62.03%。

圖2 葛根素樣品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of puerarin sample

2.2 紅外測定結果

利用紅外光譜儀測定葛根素樣品的紅外光譜（infrared spectrum，IR），見圖3。

圖3 紅外吸收圖Fig.3 IR absorption diagram

由圖3可知，在3 392.17 cm－1處有一個吸收峰是-OH伸縮振動峰，1 631.48 cm－1吸收峰為C=O伸縮振動峰，1 511.92、1 444.42、1 392.35 cm－1處是芳環(huán)骨架伸縮振動峰，1 255.43、1 056.80 cm－1處為 C-O-C 伸縮振動峰，符合葛根素結構[21]。

2.3 葛根素樣品抗氧化活性的測定結果

葛根素樣品對ABTS+自由基、DPPH自由基和羥基自由基的清除能力結果見圖4～圖6。

圖4 葛根素樣品對ABTS+自由基清除能力Fig.4 Scavenging ability of puerarin sample to ABTS+radical

圖5 葛根素樣品對DPPH自由基清除能力Fig.5 Scavenging ability of puerarin sample to DPPH radical

圖6 葛根素樣品對羥基自由基清除能力Fig.6 Scavenging ability of puerarin sample to hydroxy radical

由圖4可知，在4.5 mg/mL～24.5 mg/mL的質量濃度內，葛根素樣品對ABTS+自由基的清除能力隨濃度的升高逐漸增強；樣品質量濃度為24.5 mg/mL時，自由基清除率達84.26%，雖然ABTS+自由基清除率稍小于同濃度的維生素C，但葛根素樣品仍表現(xiàn)出顯著的清除能力。

由圖5可知，隨著葛根素樣品濃度的增加，DPPH自由基的清除率明顯增大；樣品質量濃度在20.5 mg/mL時，樣品與維生素C清除率相差不大，樣品質量濃度為24.5 mg/mL時，DPPH自由基清除率達87.25%，樣品的清除能力顯著。

由圖6可知，葛根素樣品對羥基自由基的清除能力，隨著樣品濃度的增加逐漸增強，當濃度為8.5 mg/mL時，兩者清除率相近，之后隨著濃度的增加維生素C的清除率高于葛根素樣品的清除率；樣品質量濃度為24.5 mg/mL時，羥基自由基清除率達80.10%，清除率略小于維生素C，但仍表現(xiàn)出較好的清除效果。

2.4 葛根素樣品抑菌活性結果與分析

2.4.1 葛根素樣品對各種菌的抑菌結果

不同濃度的葛根素樣品對不同菌種的抑制結果見表1。

表1 葛根素樣品抑菌活性測定結果Table 1 Antibacterial activity test results of puerarin sample

由表1可知，葛根素樣品對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌均有一定的抑制作用，且隨著樣品液濃度的增加，對各種菌株的抑制作用也增強。當樣品質量濃度≥10.5 mg/mL時，抑制作用順序為大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞沙門氏菌＞枯草芽孢桿菌；但對繩狀青霉菌和黑曲霉菌沒有抑菌活性。

2.4.2 葛根素樣品對G+和G-最低抑菌濃度的測定

不同濃度混合液OD600nm值的測定結果見表2。

表2 不同濃度混合液OD600nm值的測定Table 2 Determination results of OD600nmvalues of mixed liquid with different concentrations

由表2可知，當葛根素樣品濃度大于4.5 mg/mL時，含大腸桿菌的混合液吸光度與陰性對照液吸光度相近，即無菌生長；而當葛根素樣品濃度降至2.5 mg/mL時，含大腸桿菌的混合液吸光度增至0.285，由此可以得出，4.5 mg/mL的葛根素樣品已經(jīng)不能抑制大腸桿菌的生長，說明能抑制大腸桿菌生長的最低葛根素樣品濃度為4.5 mg/mL，能夠抑制金黃色葡萄球菌的最低葛根素提取物濃度為8.5 mg/mL。葛根素樣品對大腸桿菌的抑制效果強于金黃色葡萄球菌，可粗略得出葛根素樣品對革蘭氏陰性菌的抑制作用大于革蘭氏陽性菌。

3 結論

葛根素經(jīng)超聲波輔助乙醇提取，純化后得葛根素樣品，經(jīng)HPLC法測定其含量為62.03%，IR檢測顯示化合物具有葛根素分子結構。對葛根素樣品進行抗氧化生物活性分析，當樣品濃度在4.5 mg/mL～24.5 mg/mL時，對3種自由基的清除能力隨著樣品濃度增大而增強；當樣品濃度24.5 mg/mL時，對ABTS+自由基、DPPH自由基、羥基自由基的清除率分別達84.26%、87.25%和80.10%，均在80%以上。具有較強的自由基清除能力，表現(xiàn)出較好的抗氧化生物活性。葛根素樣品對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌都有一定的抑制作用，且對各種菌株的抑制作用與樣品濃度呈現(xiàn)正向關系；其抑制能力大小表現(xiàn)為大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞沙門氏菌＞枯草芽孢桿菌，但對繩狀青霉菌和黑曲霉菌沒有抑菌活性。葛根素樣品抑制大腸桿菌生長的最低濃度為4.5 mg/mL，抑制金黃色葡萄球菌的最低濃度為8.5 mg/mL。葛根素樣品對大腸桿菌的抑制效果強于金黃色葡萄球菌，可粗略得出葛根素樣品對革蘭氏陰性菌的抑制作用大于革蘭氏陽性菌。