機(jī)械—酶消化法制備大鼠膈肌單細(xì)胞懸液的最佳消化酶濃度組合篩選

何杰，王寧，張杉杉，劉青鈴，周舟，陳謖，吳學(xué)東

1 攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，四川攀枝花 617000；2 大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科

膈肌是身體最主要的呼吸肌，在正常潮式呼吸中，大約80%的呼吸工作由膈肌完成。除參與呼吸運(yùn)動(dòng)外，膈肌還可以通過調(diào)節(jié)腹內(nèi)壓參與調(diào)節(jié)姿勢(shì)穩(wěn)定性；膈肌收縮引起腹壓增加，有助于排尿、排便和分娩；膈肌還與血液循環(huán)系統(tǒng)以及淋巴液的回流相關(guān)［1］。因此，從細(xì)胞和亞細(xì)胞角度研究作為基本功能單位的膈肌細(xì)胞的變化，對(duì)揭示膈肌的作用及其機(jī)制具有重要意義。流式細(xì)胞術(shù)可以對(duì)組織細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，制備高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液是流式細(xì)胞術(shù)研究的前提。組織分離、酶解和機(jī)械解離是使細(xì)胞外基質(zhì)降解和單細(xì)胞分離的三個(gè)重要步驟，常用的方法是機(jī)械法和機(jī)械—酶消化法。機(jī)械法適用于一些質(zhì)地較嫩的組織，如肝臟、脾臟等，這些組織質(zhì)地松軟，易于研磨和碾碎，通過機(jī)械法即可獲得較為滿意的效果。機(jī)械—酶消化法是將實(shí)體組織剪碎，再根據(jù)不同組織選用相應(yīng)的消化酶，制成單細(xì)胞懸液。我們的前期研究顯示，采用機(jī)械—酶消化法制備的大鼠膈肌單細(xì)胞懸液優(yōu)于單純的機(jī)械法或酶消化法［2-3］。2019 年 6 月—2020 年 6 月，本研究在此基礎(chǔ)上，探索機(jī)械—酶消化法制備大鼠膈肌單細(xì)胞懸液的最適宜的消化酶濃度，旨在為研究膈肌獲得更優(yōu)質(zhì)的單細(xì)胞懸液。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD大鼠6只，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，4～5 周齡，體質(zhì)量80～130 g，雌雄兼用。本實(shí)驗(yàn)通過大理大學(xué)倫理委員會(huì)審查。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白酶、膠原酶Ⅰ型、膠原酶Ⅳ型以及胎牛血清（FBS）、臺(tái)盼藍(lán)均購(gòu)自Sigma 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)于Hyclone 公司；流式抗體鼠抗CD11b PE（120030-83）和細(xì)胞染色緩沖液（Staining Buffe）購(gòu)于eBoscience Inc；10%水合氯醛溶液由大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供。

1.1.3 主要儀器 恒溫水浴鍋（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；普通光學(xué)顯微鏡（廈門Motic公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)板（上海精密儀器公司）。

1.2 消化酶濃度的組合 將胰蛋白酶稀釋為0.125%、0.250%、0.375%、0.500%、0.625%，膠原酶Ⅰ型稀釋為0.050%、0.100%、0.150%、0.200%、0.250%，膠原酶Ⅳ型稀釋為0.050%、0.100%、0.150%、0.200%、0.250%。將三種消化酶按照從低濃度到高濃度依次組合為五個(gè)濃度組，即：胰蛋白酶0.125%+膠原酶Ⅰ0.050%+膠原酶Ⅳ0.050%、胰蛋白酶0.250%+膠原酶Ⅰ0.100%+膠原酶Ⅳ0.100%、胰蛋白酶0.375%+膠原酶Ⅰ0.150%+膠原酶Ⅳ0.150%、胰蛋白酶0.500%+膠原酶Ⅰ0.200%+膠原酶Ⅳ0.200%、胰蛋白酶0.625%+膠原酶Ⅰ0.250%+膠原酶Ⅳ0.250%。三種消化酶各0.27 mL，組合成0.81 mL的混合液。

1.3 大鼠膈肌單細(xì)胞懸液的制備 采用機(jī)械—酶消化法。大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，切開胸部和腹部，暴露并迅速完整取出膈肌，放入預(yù)冷的平皿中，PBS液反復(fù)沖洗。用眼科剪將所得大鼠膈肌剪為糊狀，分成12份，A、B、C、D、E組及對(duì)照組各2份。A～E組各取0.1 g膈肌組織，裝入含有不同濃度組合消化酶的EP 管，對(duì)照組加入等量PBS 溶液。37 ℃恒溫水浴鍋消化30 min，期間每隔5 min 吹打1 次。用200目濾網(wǎng)濾至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入等量PBS震蕩，漂洗2次，再離心、棄上清。加入等體積2%FBS 終止消化。每組最終獲得0.5 mL單細(xì)胞懸液，放入4 ℃冰箱保存待檢。

1.4 單細(xì)胞懸液中細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 取膈肌單細(xì)胞懸液，按1∶1 的比例加入臺(tái)盼藍(lán)混勻，靜置2 min。滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、雜質(zhì)，計(jì)數(shù)每個(gè)小方格的活細(xì)胞、死細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊數(shù)目，以活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 單細(xì)胞懸液質(zhì)量評(píng)價(jià) 采用流式細(xì)胞術(shù)。選用流式抗體Anti-Rat CD11b PE 熒光染色標(biāo)記樣品中的中性粒細(xì)胞。將單細(xì)胞懸液加入5 mL 的BD 流式管，F(xiàn)BS 漂洗，1 200 r/min 離心 5 min，重復(fù) 1 次。加入2μL 鼠抗CD11b PE 抗體原液，震蕩混勻，常溫下避光孵育30 min。加入1 mL 含3%FBS 的細(xì)胞染色緩沖液，1 200 r/min離心5 min，洗去多余的抗體。加入400 μL 含3% FBS 的細(xì)胞染色緩沖液重懸，置4 ℃冰箱待檢。應(yīng)用Cell Quest 軟件自動(dòng)獲取每組3×105個(gè)細(xì)胞，ModFit LT 軟件進(jìn)行圖像分析。分析前側(cè)相散點(diǎn)圖，設(shè)門圈定后，計(jì)算熒光標(biāo)記的CD11b陽性細(xì)胞數(shù)占活細(xì)胞總數(shù)的百分比，獲得中性粒細(xì)胞在活細(xì)胞中的標(biāo)記率。當(dāng)細(xì)胞總量恒定，熒光標(biāo)記的CD11b 陽性細(xì)胞數(shù)所占的比值越高，代表單細(xì)胞懸液的質(zhì)量越好。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)顯著性均大于0.05，故采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組單細(xì)胞懸液中細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果比較 見表1。A～E 組獲得活細(xì)胞數(shù)量最多的是B 組，最少是E 組；死細(xì)胞數(shù)最少的是C 組，最多是B 組；細(xì)胞團(tuán)塊 C 組最少，E 組最多；存活率 C 組最高，E 組最低；單細(xì)胞懸液濃度B 組最高，E 組最低；A～E組獲得的活細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組，其中B 組和C組活細(xì)胞數(shù)量和單細(xì)胞懸液濃度高于其他各組（P均＜0.05）。

表1 各組細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果比較（）

表1 各組細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與B、C組比較，△P＜0.05。

組別A組B組C組D組E組對(duì)照組單細(xì)胞懸液濃度（×105/mL）19.50±0.70*△30.25±3.89*22.75±2.47*20.00±0.71*△17.50±1.41*△6.50±0.71活細(xì)胞（×105/mL）156.00±11.36*△200.92±20.64*182.08±15.76*160.00±17.04*△140.02±13.84*△52.03±14.24死細(xì)胞（×105/mL）24.12±12.16*△28.00±10.48*16.20± 8.48*20.16 ± 8.92*△22.08±11.84*△60.05±15.68存活率（%）87.01 ± 5.32*△90.02± 7.38*91.86± 5.52*90.75 ± 9.19*△86.94 ± 7.17*△49.40±19.02團(tuán)塊（個(gè)/mL）19.20 ± 7.36*△22.08±14.72*10.08±11.84*16.00±12.16*△26.08±11.04*△48.00±12.20

2.2 各組單細(xì)胞懸液質(zhì)量比較 見表2。C 組D11b 陽性的中性粒細(xì)胞數(shù)、CD11b 陽性細(xì)胞占活細(xì)胞的百分比均高于其他各組（P均＜0.05）。

表2 各組被抗體CD11b標(biāo)記細(xì)胞結(jié)果比較（）

表2 各組被抗體CD11b標(biāo)記細(xì)胞結(jié)果比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與C組比較，△P＜0.05。

組別A組B組C組D組E組對(duì)照組CD11b陽性細(xì)胞占活細(xì)胞百分比（%）11.48±2.52*△14.98±2.16*△29.95±3.47*19.02±2.85*△15.85±0.38*△2.03±0.86 D11b陽性細(xì)胞（×103/mL）2.54±1.34*△3.67±1.43*△5.72±2.52*4.18±1.74*△3.38±0.94*△0.54±0.17

3 討論

膈肌功能與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)聯(lián)，并且隨著不同的疾病而改變，但具體的機(jī)制尚未完全闡明［4-6］。細(xì)胞作為器官功能的基本結(jié)構(gòu)單位，從細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)層面進(jìn)行研究對(duì)揭示呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生時(shí)膈肌功能變化或膈肌的變化與呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)系將是關(guān)鍵的步驟，制備優(yōu)質(zhì)的膈肌大鼠單細(xì)胞懸液是前提［7-9］。根據(jù)需要研究的組織，單細(xì)胞懸液的制備方法各有不同，但多采用機(jī)械法或酶消化法，也有利用機(jī)械法結(jié)合酶法進(jìn)行消化的。膈肌屬于骨骼肌，用單純機(jī)械法或單純用酶法制備膈肌單細(xì)胞懸液均難以獲得理想的結(jié)果，課題組前期利用機(jī)械法結(jié)合酶法成功制備了膈肌組織單細(xì)胞懸液，而且通過探索發(fā)現(xiàn)，機(jī)械法結(jié)合酶法進(jìn)行消化比用單純的機(jī)械法或酶法獲得單細(xì)胞懸液的質(zhì)量較高，但如何獲得優(yōu)質(zhì)的膈肌單細(xì)胞懸液仍需要進(jìn)一步探索。研究顯示，不同酶濃度消化組織獲得的單細(xì)胞懸液質(zhì)量是不一樣的［10-14］，低濃度不利于組織的充分消化，而酶濃度過高將會(huì)破壞細(xì)胞表面的抗原，均無法獲得優(yōu)質(zhì)的單細(xì)胞懸液［15-16］。

作為骨骼肌的膈肌，通過機(jī)械剪碎和酶的消化，難以獲得大量完整的肌細(xì)胞單細(xì)胞懸液，但已知膈肌是對(duì)缺氧最為敏感的器官，缺氧與炎癥反應(yīng)相關(guān)聯(lián)和炎癥能導(dǎo)致器官結(jié)構(gòu)與功能的變化，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度體現(xiàn)炎癥反應(yīng)的程度。當(dāng)炎癥因子刺激時(shí)，中性粒細(xì)胞表面的CD11b 活化，在成熟的中性粒細(xì)胞表面可以大量表達(dá)CD11b［17-18］，通過標(biāo)記CD11b 可以檢測(cè)膈肌中性粒細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而了解膈肌的狀態(tài)，也可以評(píng)價(jià)單細(xì)胞懸液的質(zhì)量。因此，本研究在前期工作基礎(chǔ)上，結(jié)合機(jī)械法和酶法并利用不同酶濃度組合對(duì)膈肌組織進(jìn)行消化，探索獲得高質(zhì)量膈肌單細(xì)胞懸液的最適宜酶濃度。

本研究利用新鮮膈肌組織，采用機(jī)械剪碎并用不同濃度的多種酶組合進(jìn)行消化制備單細(xì)胞懸液，在光鏡下計(jì)數(shù)懸液中的活細(xì)胞數(shù)、死細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞存活率、細(xì)胞團(tuán)塊和單細(xì)胞懸液的濃度，當(dāng)酶濃度組合為胰蛋白酶0.375%、膠原酶Ⅰ0.150%、膠原酶Ⅳ0.150%和胰蛋白酶0.250%、膠原酶Ⅰ0.100%、膠原酶Ⅳ0.100%時(shí)，能獲得較高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液，懸液中有較多的活細(xì)胞數(shù)和較高的懸液濃度與細(xì)胞存活率，而且懸液中死細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞團(tuán)塊均較少。在對(duì)以上兩種酶濃度組合消化獲得的單細(xì)胞懸液的進(jìn)一步研究中，經(jīng)流式抗體CD11b 標(biāo)記后用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，以酶濃度組合為胰蛋白酶0.375%、膠原酶Ⅰ0.150%和膠原酶Ⅳ0.150%時(shí)被標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞標(biāo)記率最高。因此認(rèn)為，酶濃度組合為胰蛋白酶0.375%、膠原酶Ⅰ0.150%和膠原酶Ⅳ0.150%是制備膈肌單細(xì)胞懸液最適宜的酶濃度。