羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)初次性成熟性腺發(fā)育的組織學(xué)觀察*

陳國(guó)柱 鐘鎮(zhèn)霄 楊旻珉 邢錢(qián)錢(qián) 夏正龍 唐瓊英① 易少奎 蔡繆熒 楊 杰 楊國(guó)梁, ①

羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)初次性成熟性腺發(fā)育的組織學(xué)觀察*

陳國(guó)柱1鐘鎮(zhèn)霄1楊旻珉1邢錢(qián)錢(qián)1夏正龍2唐瓊英1①易少奎1蔡繆熒2楊 杰2楊國(guó)梁1, 2①

(1. 湖州師范學(xué)院 浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開(kāi)發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院水生動(dòng)物繁育與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江湖州 313000; 2. 江蘇數(shù)豐水產(chǎn)種業(yè)有限公司 江蘇高郵 225654)

性腺發(fā)育是羅氏沼蝦()個(gè)體生長(zhǎng)及繁育的重要生物學(xué)過(guò)程, 是良種培育的基礎(chǔ)。采用外部形態(tài)觀察及常規(guī)石蠟切片的方法, 分析了羅氏沼蝦初次性成熟過(guò)程中性腺外部形態(tài)及內(nèi)部組織學(xué)變化的規(guī)律。結(jié)果表明, 性腺顏色、體積及細(xì)胞組成、分布均隨性腺發(fā)育表現(xiàn)出規(guī)律性變化, 卵巢發(fā)育劃分為8個(gè)時(shí)期, 精巢發(fā)育分為4個(gè)時(shí)期。卵巢外部形態(tài)發(fā)育與內(nèi)部組織學(xué)變化同步性高, 隨卵巢成熟度增加, 不同階段生殖細(xì)胞由生發(fā)區(qū)向外形成環(huán)狀分區(qū), Ⅰ～Ⅲ期卵巢體積、生殖細(xì)胞大小及性腺指數(shù)(GIS)增長(zhǎng)緩慢, 主要進(jìn)行生殖細(xì)胞數(shù)量積累, Ⅳ～Ⅶ期卵巢體積、生殖細(xì)胞大小及GIS增長(zhǎng)迅速, 生殖細(xì)胞在增殖同時(shí), 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累迅速?？筛鶕?jù)卵巢顏色、體積、色素分布等推測(cè)其內(nèi)部組織細(xì)胞的發(fā)育情況。精巢形態(tài)發(fā)育和組織發(fā)育同步性較差, 精巢體積、生殖細(xì)胞大小、種類(lèi)及GIS在精巢成熟過(guò)程中變化較小, Ⅰ期精巢主要進(jìn)行個(gè)體生殖功能的完善, Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期精巢則整體表現(xiàn)為個(gè)體生殖能力的強(qiáng)化過(guò)程。研究結(jié)果豐富了羅氏沼蝦繁殖生物學(xué)內(nèi)容, 從形態(tài)及組織學(xué)方面初步探明了羅氏沼蝦性腺的基本發(fā)育過(guò)程, 可為其良種選育和蝦苗繁育提供參考依據(jù)。

羅氏沼蝦; 精巢; 卵巢; 周期劃分; 性成熟

羅氏沼蝦(), 又稱(chēng)馬來(lái)西亞大蝦、淡水長(zhǎng)臂蝦, 隸屬甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、長(zhǎng)臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬()。該蝦棲息于熱帶、亞熱帶地區(qū)的咸水及半咸水水域, 是世界上個(gè)體最大的淡水蝦。因其生長(zhǎng)快、食性廣等優(yōu)良養(yǎng)殖及商業(yè)特性而被廣泛養(yǎng)殖(潘家模, 1994)。我國(guó)羅氏沼蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量現(xiàn)已占世界總產(chǎn)量的60%左右, 成為羅氏沼蝦養(yǎng)殖第一大國(guó)(FAO, 2020)。生長(zhǎng)與繁殖性能是最重要的兩個(gè)生物學(xué)指標(biāo), 隨著我國(guó)羅氏沼蝦產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展, 加強(qiáng)羅氏沼蝦基礎(chǔ)生物學(xué)研究顯得尤為重要。

目前對(duì)甲殼類(lèi)動(dòng)物性腺發(fā)育相關(guān)研究主要集中在以下幾方面: 組織學(xué)上, 各學(xué)者將性腺外部形態(tài)與內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)相結(jié)合, 對(duì)波紋龍蝦() (劉慧玲等, 2009)、克氏原螯蝦() (黃文虎, 2012)、凡納濱對(duì)蝦() (顏素芬等, 2004)、中華絨螯蟹() (薛魯征等, 1987; 堵南山等, 1988)、鋸緣青蟹() (上官步敏等, 1991)等的卵巢或精巢的發(fā)育周期進(jìn)行了劃分, 并探索其生殖細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程; 內(nèi)分泌學(xué)上, 羅氏沼蝦的性腺發(fā)育通常與其眼柄的X器官竇狀腺?gòu)?fù)合體、Y器官及大顎器官分泌的多種蛻皮及性腺發(fā)育相關(guān)的激素相結(jié)合進(jìn)行研究(蔡生力, 1998; 朱小明等, 2001; Felterman, 2011);行為學(xué)上, 研究者對(duì)克氏原螯蝦(徐增洪, 2014)、羅氏沼蝦(王春等, 2009; Habashy, 2013)、日本沼蝦() (徐紅艷, 2001)等求偶、交媾前后、產(chǎn)卵等繁殖行為進(jìn)行了系統(tǒng)的觀察描述, 雄蝦在性成熟后繁殖交配季節(jié)表現(xiàn)出明顯的占區(qū)、求偶等行為。形態(tài)學(xué)方面, 邢錢(qián)錢(qián)等(2021)發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦雌蝦性成熟后可能通過(guò)頭胸甲和腹部形態(tài)性狀的變化增強(qiáng)其個(gè)體繁殖力; 與其類(lèi)似, Chow等(1991)發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦性成熟后雌蝦的頭胸甲寬顯著大于雄蝦; Primavera等(1998)認(rèn)為斑節(jié)對(duì)蝦()在仔蝦時(shí)期雌雄個(gè)體規(guī)格及生長(zhǎng)表現(xiàn)相似, 只在雌蝦性成熟后表現(xiàn)出性二態(tài)性。以上研究表明性腺發(fā)育過(guò)程往往伴隨著外部形態(tài)的變化。繁殖生物學(xué)方面, 胡潤(rùn)豪等(2021)認(rèn)為長(zhǎng)臂蝦類(lèi)產(chǎn)卵量受卵巢發(fā)育狀況的影響。在分子機(jī)制方面, 姜虎成(2015)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析了部分基因在克氏原螯蝦性腺不同發(fā)育時(shí)期的調(diào)控機(jī)制和表達(dá)情況; 江紅霞(2017)在日本沼蝦中發(fā)現(xiàn)卵黃蛋白原()、組織蛋白酶L ()、半胱氨酸蛋白酶抑制因子()等12個(gè)可能與日本沼蝦性早熟密切相關(guān)基因。除上述研究外, 許多學(xué)者還通過(guò)人為調(diào)控如營(yíng)養(yǎng)(Jover, 1999; Carmona-Osalde, 2005)、養(yǎng)殖密度(戴習(xí)林等, 2016a, 2016b)、光照(張龍崗等, 2014)等外部環(huán)境因素探索了外界環(huán)境變化對(duì)甲殼類(lèi)動(dòng)物性腺發(fā)育的影響。

羅氏沼蝦由仔蝦發(fā)育至成蝦, 達(dá)到初次性成熟這一階段生長(zhǎng)較快, 性腺發(fā)育與生長(zhǎng)是同步進(jìn)行的, 整個(gè)過(guò)程包含了復(fù)雜的行為、外部形態(tài)及性腺形態(tài)的變化。趙云龍等(1998)的研究表明, 羅氏沼蝦的雌性生殖系統(tǒng)包括卵巢和輸卵管, 根據(jù)卵黃積累情況將卵子發(fā)生過(guò)程大致分為5期。王玉鳳等(1997)對(duì)羅氏沼蝦雄性生殖系統(tǒng)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)劃分, 并探索了生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中RNA、DNA及蛋白質(zhì)合成和分布規(guī)律。朱春華等(2011)研究表明羅氏沼蝦仔蝦后15 d出現(xiàn)生殖原基, 外部性征分化略早于內(nèi)部性征分化, 這與戴習(xí)林等(2016b)對(duì)性別分化及性腺原基出現(xiàn)時(shí)間的研究結(jié)論一致。這些研究結(jié)果使我們對(duì)羅氏沼蝦的生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、性腺發(fā)育過(guò)程等有了初步認(rèn)識(shí), 但對(duì)雌蝦卵巢發(fā)育的外部形態(tài)與內(nèi)部組織學(xué)變化規(guī)律的對(duì)應(yīng)關(guān)系研究還不夠深入, 對(duì)雄蝦精巢的發(fā)育規(guī)律也未準(zhǔn)確闡明, 對(duì)羅氏沼蝦性腺發(fā)育過(guò)程的認(rèn)識(shí)還需進(jìn)一步深入。從能量分配的角度考慮, 若不能滿足羅氏沼蝦初次性腺發(fā)育及生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng), 羅氏沼蝦后期的生長(zhǎng)、繁殖性能將會(huì)受到嚴(yán)重的影響。

因此, 研究羅氏沼蝦性腺發(fā)育的基本規(guī)律, 掌握羅氏沼蝦繁殖及生長(zhǎng)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn), 對(duì)增強(qiáng)親蝦繁殖力、提高育苗成活率、保證商品蝦生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)供給意義重大。本研究基于前人對(duì)蝦蟹類(lèi)物種性腺發(fā)育的研究方法, 將性腺外部形態(tài)與其組織學(xué)相結(jié)合進(jìn)行觀察, 對(duì)羅氏沼蝦初次性成熟性腺外部形態(tài)及組織學(xué)變化規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)研究, 以期進(jìn)一步完善羅氏沼蝦的繁殖生物學(xué)資料, 助力羅氏沼蝦的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用蝦

實(shí)驗(yàn)用羅氏沼蝦()來(lái)自江蘇數(shù)豐水產(chǎn)種業(yè)有限公司育種中心淡化時(shí)間相同的9個(gè)家系仔蝦, 個(gè)體規(guī)格(2.9±0.16) g, 每個(gè)家系挑選200個(gè)個(gè)體, 保證雌雄比1︰1左右, 共計(jì)1 800尾仔蝦用于本實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖取樣。實(shí)驗(yàn)用蝦取樣時(shí)間段為2020年8月1日～10月4日。

1.2 飼養(yǎng)管理

將每個(gè)家系的200尾仔蝦分別置于9個(gè)面積為17 m2的水泥池飼養(yǎng), 初期養(yǎng)殖密度約為12 尾/m2。各池的光照(0～1 380 lx)、水溫(28～32 °C)等養(yǎng)殖條件一致, 投喂飼料由江蘇富裕達(dá)糧食制品股份有限公司供應(yīng), 日投喂量為每池蝦總重的8%～10%, 分別于早上8:00、下午4:00及晚上10:00分3次進(jìn)行投喂。養(yǎng)殖中后期除投喂人工飼料外, 適當(dāng)增投螺螄肉(按每次配合飼料投喂量的4～5倍投喂)進(jìn)行強(qiáng)化培育。水質(zhì)指標(biāo)保持在: pH 7.5～8.0、溶氧8～11 mg/L、氨氮0.05～0.25 mg/L、亞硝酸鹽0.1～0.3 mg/L。

1.3 取樣及測(cè)量

以7 d為一周期, 分池飼養(yǎng)后即對(duì)各池進(jìn)行采樣, 每個(gè)家系隨機(jī)捕撈雌雄各3尾, 9個(gè)池共取54尾, 實(shí)驗(yàn)共取樣10個(gè)周期。將待取樣蝦置于冰上10 min以降低其活力, 對(duì)每尾蝦的頭胸甲背面進(jìn)行拍照后解剖, 對(duì)性腺進(jìn)行拍照、取樣、稱(chēng)性腺重(gonadal weight, GW), 計(jì)算性腺指數(shù)(gonadal index, GIS), 并選取厚度約0.2～0.5 cm的性腺組織采用4%組織固定液固定, 定期更換固定液以便長(zhǎng)期保存, 供后續(xù)組織切片觀察分析。

1.4 切片制作、H.E染色及拍照測(cè)量

采用常規(guī)石蠟切片的制作流程及蘇木精-伊紅(H.E)染色方法研究性腺的組織學(xué)(趙惠玲等, 2004; 楊捷頻, 2006)。性腺外部形態(tài)在體式解剖鏡下觀察并拍照, 性腺組織結(jié)構(gòu)特征通過(guò)組織切片在顯微鏡下觀察并拍照, 拍攝圖片導(dǎo)入Photoshop CS6, 使用標(biāo)尺工具校準(zhǔn)原圖標(biāo)尺后進(jìn)行細(xì)胞長(zhǎng)短徑測(cè)量。

1.5 性腺發(fā)育分期

性腺的解剖觀察側(cè)重于通過(guò)解剖后肉眼觀察結(jié)合解剖鏡觀察性腺外部形態(tài)結(jié)構(gòu)(體積、顏色、表面色素覆蓋程度等), 而組織學(xué)觀察則側(cè)重于通過(guò)切片觀察性腺內(nèi)部細(xì)胞種類(lèi)、各類(lèi)細(xì)胞所占比率及排布狀態(tài)。本研究基于性腺的解剖觀察與組織學(xué)觀察綜合變化情況對(duì)性腺進(jìn)行發(fā)育時(shí)期的劃分。

2 結(jié)果

2.1 卵子發(fā)生

根據(jù)羅氏沼蝦卵巢切片觀察卵細(xì)胞發(fā)育時(shí)相, 發(fā)現(xiàn)其卵細(xì)胞的大小、H.E染色變化、卵黃物質(zhì)積累、各類(lèi)細(xì)胞在卵巢中的分布存在規(guī)律性變化。此過(guò)程中的卵細(xì)胞存在5個(gè)發(fā)育時(shí)期, 即: 卵原細(xì)胞、卵黃合成前期卵母細(xì)胞、內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞、外源性卵黃合成期卵母細(xì)胞及成熟卵細(xì)胞。

卵原細(xì)胞: 細(xì)胞呈不規(guī)則圓形, 長(zhǎng)徑9～11 μm, 短徑7～9 μm; 整個(gè)細(xì)胞被細(xì)胞核占據(jù)大部分, 核呈嗜堿性, 核仁不明顯, 胞質(zhì)染色淺, 均勻分布于細(xì)胞核周?chē)? 整個(gè)細(xì)胞幾乎跟細(xì)胞核顏色一致。

卵黃合成前期卵母細(xì)胞: 卵原細(xì)胞隨著卵巢發(fā)育, 體積逐漸增大, 由生發(fā)區(qū)向外推移形成卵黃合成期卵母細(xì)胞, 形狀不規(guī)則, 長(zhǎng)徑28～32 μm, 短徑20～24 μm; 細(xì)胞核圓形, 核仁部分可見(jiàn), 圓形, 1～2個(gè),呈強(qiáng)嗜堿性, 細(xì)胞質(zhì)較卵原細(xì)胞增多, 呈藍(lán)紫色。

內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞: 細(xì)胞形狀為橢圓或不規(guī)則多邊形, 長(zhǎng)徑40～48 μm, 短徑30～36 μm; 核質(zhì)分區(qū)明顯, 細(xì)胞核圓形, 染色質(zhì)呈藍(lán)色, 胞質(zhì)由嗜堿性轉(zhuǎn)變?yōu)槭人嵝? 呈深紅色。

外源性卵黃合成期卵母細(xì)胞: 細(xì)胞體積迅速增大, 早期長(zhǎng)徑88～93 μm, 短徑71～76 μm; 細(xì)胞核呈卵圓形, 部分細(xì)胞已形成單個(gè)較大核仁, 呈嗜堿性, 核質(zhì)同樣呈嗜堿性, 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂滴顆粒, 到發(fā)育后期胞質(zhì)內(nèi)脂滴顆粒數(shù)目明顯增多, 體積約早期的2倍。長(zhǎng)徑220～240 μm, 短徑116～138 μm, 顆粒大小增大, 細(xì)胞核開(kāi)始出現(xiàn)不規(guī)則形狀。

成熟卵細(xì)胞: 細(xì)胞體積達(dá)到最大, 長(zhǎng)徑400～ 480 μm, 短徑220～270 μm, 中間充斥著大量脂滴, 單個(gè)細(xì)胞之間已難以區(qū)分界限, 核仁在視野內(nèi)幾乎消失, 卵細(xì)胞透過(guò)卵巢肉眼可見(jiàn), 羅氏沼蝦即將蛻殼抱卵。

2.2 卵巢發(fā)育分期

解剖發(fā)現(xiàn), 卵巢由左右兩葉構(gòu)成, 前端閉合, 呈倒V字型。處于增殖期的卵巢覆蓋于羅氏沼蝦心臟的下方, 肝胰腺的后上方。卵巢解剖結(jié)構(gòu)觀察與組織學(xué)觀察的變化表現(xiàn)出一一對(duì)應(yīng)的高同步性, 可根據(jù)卵巢占羅氏沼蝦體重的比率(性腺指數(shù))、卵巢的體積、顏色(表面色素覆蓋程度), 以及卵巢內(nèi)細(xì)胞種類(lèi)的組成、分布情況, 將卵巢發(fā)育過(guò)程分為以下8個(gè)時(shí)期。

Ⅰ期卵巢(增殖期): 該期卵巢體積極小且受到血淋巴的影響, 肉眼觀察極難分辨該期卵巢的形態(tài)和顏色。解剖鏡觀察, 卵巢已隱約區(qū)分左右兩葉, 前端閉合處延伸至整個(gè)肝胰腺背面約1/7處, 最大寬度小于心臟寬度, 顏色接近透明, 卵巢背面無(wú)色素覆蓋(圖1a)。切片觀察, 卵巢中的細(xì)胞主要由卵原細(xì)胞和濾泡細(xì)胞組成, 存在極少數(shù)排列在卵巢外圍發(fā)育初期的卵母細(xì)胞(圖2a)。卵巢性腺指數(shù)0.16%。

Ⅱ期卵巢(發(fā)育前期): 肉眼觀察, 卵巢體積較增殖期增加2～3倍, 已可見(jiàn)卵巢輪廓。解剖鏡觀察, 卵巢前端閉合處向肝胰腺前端緩慢延伸至1/5～1/4處, 最大寬度接近心臟寬度。整體顏色呈半透明乳白色, 背面較增殖期于前端閉合處和中端開(kāi)始出現(xiàn)少量黑色素覆蓋(圖1b)。切片觀察, 卵原細(xì)胞集中分布在卵巢的中心區(qū)域(生發(fā)區(qū)), 外周卵黃合成前期卵母細(xì)胞數(shù)目明顯增加, 濾泡細(xì)胞開(kāi)始由卵巢生發(fā)區(qū)向外遷移, 表現(xiàn)圍繞卵母細(xì)胞形成單個(gè)濾泡腔的趨勢(shì)(圖2b)。卵巢性腺指數(shù)0.18%。

Ⅲ期卵巢(發(fā)育中期): 肉眼觀察, 卵巢體積較發(fā)育前期增加約2倍, 卵巢整體呈乳白色。解剖鏡觀察, 前端閉合處已延伸覆蓋至整個(gè)肝胰腺的1/3處, 最大寬度已超過(guò)心臟寬度, 左右兩葉卵巢背面出現(xiàn)1條黑色素帶, 覆蓋了整個(gè)卵巢背面約2/3面積(圖1c)。切片觀察, 卵巢中心仍主要為卵原細(xì)胞, 其外周環(huán)繞了大量卵黃合成前期卵母細(xì)胞。此外, 在卵黃合成前期卵母細(xì)胞外周出現(xiàn)了部分內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞, 數(shù)量較卵黃合成前期卵母細(xì)胞少, 濾泡細(xì)胞已基本環(huán)繞于單個(gè)卵母細(xì)胞周?chē)纬蔀V泡腔(圖2c)。性腺指數(shù)0.21%。

Ⅳ期卵巢(發(fā)育后期): 肉眼觀察, 卵巢體積進(jìn)一步增大, 卵巢整體呈乳白色。解剖鏡觀察, 前端閉合處延伸至肝胰腺背面約2/3處, 最大寬度較發(fā)育中期更寬, 卵巢內(nèi)隱約可見(jiàn)少量乳黃色區(qū)域, 其背面色素帶未見(jiàn)明顯變化(圖1d)。切片觀察, 整個(gè)卵巢可分為中心區(qū)、外圍1區(qū)、外圍2區(qū)三個(gè)區(qū)域, 中心為生發(fā)區(qū), 以卵原細(xì)胞為主, 外圍2區(qū)為卵巢最外圍, 分布大量?jī)?nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞。外圍1區(qū)在中心區(qū)和外圍2區(qū)之間, 以卵黃合成前期卵母細(xì)胞為主。觀察區(qū)域面積大小發(fā)現(xiàn), 外圍2區(qū)>外圍1區(qū)>中心區(qū)。此外, 環(huán)繞在單個(gè)濾泡腔周?chē)臑V泡細(xì)胞有增加趨勢(shì)(圖2d)。性腺指數(shù)0.34%。

圖1 羅氏沼蝦卵巢不同發(fā)育時(shí)期解剖鏡下外部形態(tài)觀察

注: a. 增殖期卵巢; b. 發(fā)育前期卵巢; c. 發(fā)育中期卵巢; d. 發(fā)育后期卵巢; e. 發(fā)育末Ⅰ期卵巢; f. 發(fā)育末Ⅱ期卵巢; g. 成熟期卵巢; h. 退化期卵巢。O: 卵巢; M: 黑色素; Me: 成熟卵子

Ⅴ期卵巢(發(fā)育末Ⅰ期): 肉眼觀察, Ⅴ期的卵巢體積雖在增加, 但增長(zhǎng)幅度不大, 整個(gè)卵巢呈明顯的乳黃色。解剖鏡觀察, 卵巢背面色素帶明顯, 色素分布區(qū)域明顯增加(圖1e)。切片觀察, 卵巢可分為中心區(qū)、外圍1區(qū)、外圍2區(qū)、外圍3區(qū)共4個(gè)區(qū)域, 主要細(xì)胞類(lèi)型分別為卵原細(xì)胞、卵黃合成前期卵母細(xì)胞、內(nèi)源性合成期卵母細(xì)胞、外源性合成早期卵母細(xì)胞; 各區(qū)域大小為: 外圍3區(qū)>外圍2區(qū)>外圍1區(qū)>中心區(qū)。從該階段開(kāi)始, 環(huán)繞在單個(gè)濾泡腔周?chē)臑V泡細(xì)胞數(shù)目迅速增加(圖2e)。性腺指數(shù)0.49%。

圖2 羅氏沼蝦卵巢不同發(fā)育時(shí)期組織學(xué)特征

注: a. 增殖期卵巢(×100); b. 發(fā)育前期卵巢(×100); c. 發(fā)育中期卵巢(×100); d. 發(fā)育后期卵巢(×100); e. 發(fā)育末Ⅰ期卵巢(×100); f. 發(fā)育末Ⅱ期卵巢(×40); g. 成熟期卵巢(×40); h. 退化期卵巢(×40)。OG: 卵原細(xì)胞; PR: 卵黃合成前期卵母細(xì)胞; EN: 內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞; EX1: 外源性卵黃合成前期卵母細(xì)胞; EX2: 外源性卵黃合成中、晚期卵母細(xì)胞; MO: 成熟卵子; FC: 濾泡細(xì)胞; FC1: Ⅰ型濾泡細(xì)胞; FC2: Ⅱ型濾泡細(xì)胞; NL: 細(xì)胞核; Y: 卵黃顆粒; BS: 血竇; 0: 中心區(qū); 1: 外圍1區(qū); 2: 外圍2區(qū); 3: 外圍3區(qū); 4: 外圍4區(qū)

Ⅵ期卵巢(發(fā)育末Ⅱ期): 肉眼觀察, 卵巢體積迅速增長(zhǎng)且橫向增長(zhǎng)明顯, 卵巢呈金黃色。解剖鏡觀察, 卵巢表面色素帶斑點(diǎn)變得愈發(fā)致密, 且顏色開(kāi)始向墨綠色轉(zhuǎn)變(圖1f)。切片觀察, 卵巢可按照第Ⅴ期類(lèi)似的區(qū)域劃分方式分為中心區(qū)、外圍1區(qū)、外圍2區(qū)、外圍3區(qū)、外圍4區(qū)共5個(gè)區(qū)域, 主要細(xì)胞類(lèi)型分別為卵原細(xì)胞、卵黃合成前期卵母細(xì)胞、內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞、外源性卵黃合成早期卵母細(xì)胞、外源性卵黃合成中、晚期卵母細(xì)胞; 各區(qū)域大小為: 外圍4區(qū)>外圍3區(qū)>外圍2區(qū)>外圍1區(qū)>中心區(qū)。以成熟度為標(biāo)準(zhǔn), 卵原細(xì)胞、卵黃合成前期卵母細(xì)胞、內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞由卵巢中心向外呈單條脊索狀依次排列, 整個(gè)卵巢呈輻射型向外發(fā)育, 越靠近卵巢膜, 成熟度越高(圖2f)。性腺指數(shù)0.77%。

Ⅶ期卵巢(成熟期): 肉眼觀察, 卵巢體積增至整個(gè)發(fā)育期的最大。其前葉最遠(yuǎn)可覆蓋整個(gè)肝胰腺、胃, 延伸至羅氏沼蝦的額劍處, 整體呈桔黃色。解剖鏡觀察, 其背面的黑色素轉(zhuǎn)變?yōu)槟G色, 覆蓋了整個(gè)卵巢背面, 透過(guò)極薄的卵巢外膜隱約可見(jiàn)卵巢內(nèi)部呈卵圓形的成熟卵子(圖1g)。切片觀察, 視野下主要為成熟卵母細(xì)胞, 外源性卵黃合成期卵母細(xì)胞極少, 內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞消失, 卵巢中心區(qū)存在少量卵原細(xì)胞和卵黃合成前期卵母細(xì)胞(圖2g)。性腺指數(shù)5.7%。

Ⅷ期卵巢(退化期): 肉眼觀察, 卵巢干癟, 體積較小, 顏色趨近半透明, 在肝胰腺背面的覆蓋程度接近Ⅲ期卵巢。解剖鏡觀察, 黑色素帶的覆蓋程度與Ⅵ期卵巢接近, 幾乎覆蓋了整個(gè)卵巢背面, 色素重新轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏?圖1h)。切片觀察, 卵巢內(nèi)細(xì)胞種類(lèi)主要包括卵原細(xì)胞、卵黃合成前期卵母細(xì)胞、內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞、濾泡細(xì)胞4類(lèi), 由卵巢中心生發(fā)區(qū)向卵巢膜分布, 在內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞之間可看到大量已排出成熟卵子的濾泡空腔和濾泡細(xì)胞(圖2h)。性腺指數(shù)0.63%。

羅氏沼蝦卵巢發(fā)育各時(shí)期性腺指數(shù)的變化趨勢(shì)如圖3, 雌蝦的性腺指數(shù)因其發(fā)育時(shí)期的不同存在一個(gè)先緩慢增加, 至Ⅵ～Ⅶ期迅速增加, 而Ⅶ～Ⅷ期迅速下降的過(guò)程。

圖3 羅氏沼蝦不同卵巢發(fā)育時(shí)期性腺指數(shù)(GIS)變化規(guī)律

2.3 精巢形態(tài)學(xué)及組織學(xué)

羅氏沼蝦的精巢與卵巢的位置一致, 位于心臟下方, 肝胰腺后上部。整個(gè)精巢由許多生精小管組成, 覆蓋于肝胰腺上。精巢解剖觀察結(jié)果與組織學(xué)觀察的同步性較差, 外部形態(tài)和內(nèi)部組織學(xué)變化表現(xiàn)出存在一定關(guān)聯(lián)性但又相對(duì)獨(dú)立的變化過(guò)程。根據(jù)精巢發(fā)育過(guò)程中體積、顏色、表面色素覆蓋程度、精巢內(nèi)細(xì)胞種類(lèi)的組成結(jié)構(gòu)差異將其分為4個(gè)發(fā)育時(shí)期。

Ⅰ期精巢: 肉眼觀察, 因受到血淋巴的影響, 極難分辨。解剖鏡觀察, 該期精巢較小, 半透明, 前端閉合, 后端分離, 整個(gè)精巢呈V型。精巢表面無(wú)色素覆蓋, 精巢末端無(wú)法從解剖鏡下觀察到明顯的輸精管(圖4a)。切片觀察, 精巢中精原細(xì)胞占絕大部分, 細(xì)胞之間排列緊密, 生精小管之間夾雜著極少量的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞(圖5a)。性腺指數(shù)0.17%。

Ⅱ期精巢: 肉眼觀察, 已可見(jiàn)精巢組織, 顏色呈半透明乳白色, 精巢前端與胃后緣之間存在一透明膜狀組織粘連, 將整個(gè)精巢拉長(zhǎng)至胃的末端。解剖鏡觀察, 精巢表面存在少量黑色素斑點(diǎn), 單側(cè)精巢明顯變粗, 末端隱約可見(jiàn)輸精管(圖4b)。切片觀察, 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞圍繞在單個(gè)生精小管邊緣排布, 不同發(fā)育時(shí)期的生殖細(xì)胞可同時(shí)存在于同一生精小管中且彼此分界并不明顯, 生殖細(xì)胞總數(shù)有所增加(圖5b)。性腺指數(shù)0.23%。

Ⅲ期精巢: 肉眼觀察, 精巢體積較發(fā)育初期有進(jìn)一步增長(zhǎng), 精巢兩葉進(jìn)一步增粗; 精巢整體呈乳白色。解剖鏡觀察, 背面覆蓋的黑色素斑點(diǎn)呈線狀排列, 且黑色素斑點(diǎn)數(shù)量增多, 單個(gè)斑點(diǎn)覆蓋面積增大, 精巢后端的輸精管已清晰可見(jiàn)(圖4c)。切片觀察, 精原細(xì)胞所占比例較發(fā)育初期明顯減少, 而精細(xì)胞所占比例明顯增多, 且存在一定數(shù)量的精細(xì)胞正在轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒炀拥淖儜B(tài)過(guò)程。整個(gè)精巢的細(xì)胞數(shù)量隨著精巢的不斷發(fā)育也有明顯增多的趨勢(shì)(圖5c)。性腺指數(shù)0.23%。

圖4 羅氏沼蝦精巢不同發(fā)育時(shí)期解剖鏡下外部形態(tài)觀察

注: a. Ⅰ期精巢; b. Ⅱ期精巢; c. Ⅲ期精巢; d. Ⅳ期精巢。T: 精巢; M: 黑色素; Vd: 輸精管

圖5 羅氏沼蝦精巢不同發(fā)育時(shí)期組織學(xué)特征

注: a. Ⅰ期精巢(×100); b. Ⅱ期精巢(×100); c. Ⅲ期精巢(×100); d. Ⅳ期精巢(×100)。GE: 生殖上皮; SG: 精原細(xì)胞; SC1: 初級(jí)精母細(xì)胞; SC2: 次級(jí)精母細(xì)胞; ST: 精細(xì)胞; S: 精子; NC: 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞; CT: 結(jié)締組織; GE: 生殖上皮

Ⅳ期精巢: 肉眼觀察, 成熟期的精巢體積增至最大, 顏色乳白色。解剖鏡觀察, 兩葉精巢表面如桑葚狀凹凸不平, 其表面覆蓋的黑色素斑點(diǎn)因精巢的乳白色而顯得更深。精巢末端盤(pán)曲著大團(tuán)輸精管(圖4d)。精巢中生殖細(xì)胞包括了精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精細(xì)胞、成熟精子五類(lèi), 生殖細(xì)胞總數(shù)此時(shí)達(dá)到最大, 精細(xì)胞與成熟精子混雜在一起分布于生精小管一側(cè)(圖5d)。性腺指數(shù)0.26%。

羅氏沼蝦精巢生殖細(xì)胞發(fā)育各時(shí)期性腺指數(shù)的變化趨勢(shì)如圖6。雄蝦的性腺指數(shù)因其發(fā)育時(shí)期的不同存在緩慢增加的趨勢(shì), 但增長(zhǎng)幅度較小。

圖6 羅氏沼蝦不同精巢發(fā)育時(shí)期性腺指數(shù)(GIS)變化

3 討論

3.1 卵巢發(fā)育

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)甲殼動(dòng)物的卵巢發(fā)育時(shí)期劃分標(biāo)準(zhǔn)并不一致, 但存在相似之處。劉慧玲等(2009)按卵巢組織學(xué)特征、不同卵細(xì)胞發(fā)育時(shí)期所占比例、卵巢形態(tài)及顏色將波紋龍蝦卵巢發(fā)育分為6個(gè)時(shí)期。栗治國(guó)等(2014)根據(jù)脊尾白蝦()卵巢顏色及卵巢成熟指數(shù)將卵巢發(fā)育分為6個(gè)時(shí)期。Guimar?es等(2021)以低平斜紋蟹()卵巢形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、各類(lèi)生殖細(xì)胞頻率以及卵巢的位置將卵巢發(fā)育過(guò)程分為4個(gè)時(shí)期。Chen等(2019)在紅紋鞭腕蝦()卵巢發(fā)育分期中以卵巢長(zhǎng)度、顏色為劃分標(biāo)準(zhǔn)。上官步敏等(1991)根據(jù)鋸緣青蟹卵巢外部特征及組織學(xué)特征將卵巢發(fā)育分為未發(fā)育期、發(fā)育早期、發(fā)育期、將成熟期、成熟期和排卵后期?？傮w來(lái)說(shuō), 國(guó)內(nèi)外學(xué)者都將卵巢的外部形態(tài)與內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)作為卵巢發(fā)育分期的劃分標(biāo)準(zhǔn)。本研究將羅氏沼蝦的卵巢顏色、體積、卵巢表面的色素分布情況等外部特征與卵巢內(nèi)生殖細(xì)胞所處發(fā)育階段、各階段細(xì)胞比例進(jìn)行了分析, 同時(shí)結(jié)合性腺指數(shù)的變化將卵巢發(fā)育分為8個(gè)時(shí)期。分析發(fā)現(xiàn)卵巢外部形態(tài)與內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)的變化相互對(duì)應(yīng), 因此可以根據(jù)卵巢顏色、體積、色素分布情況推測(cè)其內(nèi)部組織細(xì)胞發(fā)育情況。

此外, 卵巢隨著發(fā)育趨于成熟, 其對(duì)應(yīng)的各時(shí)期生殖細(xì)胞存在特殊分布及排列規(guī)律。增殖期卵巢內(nèi)生殖細(xì)胞成團(tuán)分布, 并未出現(xiàn)一定規(guī)律性, 這一現(xiàn)象持續(xù)至發(fā)育前期。從發(fā)育中期開(kāi)始至發(fā)育末期, 各時(shí)期生殖細(xì)胞圍繞卵巢中心向外表現(xiàn)出規(guī)律性排列, 生殖細(xì)胞存在由卵巢中心向外逐漸成熟的趨勢(shì), 且不同時(shí)期生殖細(xì)胞之間出現(xiàn)分區(qū)。單個(gè)生殖細(xì)胞由卵巢中心生發(fā)區(qū)向外呈脊索狀排列, 不同發(fā)育時(shí)期的生殖細(xì)胞之間可劃分出較為明顯的環(huán)狀分區(qū), 各分區(qū)的生殖細(xì)胞發(fā)育階段比較單一, 這一生殖細(xì)胞分區(qū)現(xiàn)象持續(xù)至成熟期消失。何緒剛等(2002)在武湖日本沼蝦卵巢發(fā)育研究中提到關(guān)于卵巢發(fā)育方向的討論, 通過(guò)切片組織觀察認(rèn)為日本沼蝦的卵巢發(fā)育是由腹面向背面發(fā)生。本研究通過(guò)組織切片觀察發(fā)現(xiàn), 羅氏沼蝦的卵巢發(fā)育是由中央向四周橫向發(fā)生, 可能存在卵巢由腹面向背面發(fā)生的趨勢(shì)。

3.2 卵子發(fā)生

關(guān)于甲殼類(lèi)動(dòng)物卵子發(fā)生階段的劃分標(biāo)準(zhǔn)目前主要有2類(lèi), 部分學(xué)者先根據(jù)卵細(xì)胞大小、形態(tài)將其分為: 卵原細(xì)胞、初級(jí)卵母細(xì)胞、次級(jí)卵母細(xì)胞及成熟卵子4個(gè)時(shí)期, 然后根據(jù)生殖細(xì)胞內(nèi)是否出現(xiàn)油滴或卵黃顆粒, 再將次級(jí)卵母細(xì)胞細(xì)分為早、中、晚3個(gè)亞期(King, 1948; 薛魯征等, 1987; 樊玉杰, 2005; 黃楷翔等, 2011)。而另一部分學(xué)者則以卵細(xì)胞是否開(kāi)始卵黃合成, 將卵子的發(fā)生分為卵原細(xì)胞期、卵黃蛋白合成前期、內(nèi)源性卵黃蛋白合成期、外源性卵黃蛋白合成期以及成熟期5個(gè)時(shí)期(Bomirski, 1976; 上官步敏等, 1991; Minagawa, 1997; 顏素芬等, 2004; 栗治國(guó)等, 2014; Guimar?es, 2021)。

本研究參照第2類(lèi)劃分標(biāo)準(zhǔn), 結(jié)合對(duì)應(yīng)的卵巢發(fā)育階段, 將雌蝦卵子發(fā)生過(guò)程分為5個(gè)時(shí)期, 且由于外源性卵黃合成期卵母細(xì)胞在發(fā)育前后體積變化較大, 將外源性卵黃蛋白合成期再細(xì)分為早期和晚期2個(gè)亞期。在整個(gè)卵子發(fā)生過(guò)程中, 卵巢內(nèi)的濾泡細(xì)胞作為卵細(xì)胞發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)供給細(xì)胞發(fā)揮著重要作用。隨著卵子不斷發(fā)育成熟, 濾泡細(xì)胞由卵巢中央向外遷移, 多個(gè)濾泡細(xì)胞圍繞單個(gè)卵子形成濾泡腔, 且濾泡細(xì)胞由早期的近圓形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形, 這一過(guò)程中濾泡細(xì)胞與卵子的接觸面積不斷增大。觀察整個(gè)卵子發(fā)生過(guò)程, 這一系列變化似乎與卵黃合成的啟動(dòng)保持較高的同步性, 推測(cè)濾泡細(xì)胞對(duì)卵子發(fā)育及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累具有重要作用。

3.3 精巢發(fā)育

有關(guān)甲殼類(lèi)動(dòng)物精巢發(fā)育周期劃分的研究國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。栗治國(guó)等(2014)以年為周期將脊尾白蝦的精巢發(fā)育劃分為休止期、增殖期、成熟期。楊筱珍等(2010)根據(jù)日本新糠蝦()精巢組織學(xué)及外部性征變化, 將雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育分為4個(gè)時(shí)期。堵南山等(1988)將中華絨螯蟹的精巢發(fā)育粗略分為休止期和發(fā)育期。Souza等(2018)根據(jù)美人蝦()精巢的外部特征將精巢發(fā)育劃分為成熟期和發(fā)育期。羅氏沼蝦的精巢發(fā)育分期目前未見(jiàn)報(bào)道, 本研究根據(jù)精巢外部形態(tài)發(fā)育特征(精巢體積、顏色、表面色素分布), 將精巢發(fā)育時(shí)期分為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期。

在羅氏沼蝦雄蝦性腺初次成熟過(guò)程中, Ⅰ期精巢中生殖細(xì)胞為單一精原細(xì)胞, 不具備產(chǎn)生精子的能力, 其余3個(gè)發(fā)育期精巢均具備產(chǎn)生成熟精子的能力。這是基于對(duì)雄蝦輸精管及精巢的組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn), Ⅰ期精巢輸精管內(nèi)未見(jiàn)成熟精子, 而Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期精巢包含精原細(xì)胞在內(nèi)的所有時(shí)期細(xì)胞, 雖然各時(shí)期細(xì)胞所占比例存在較大差異, 但輸精管內(nèi)均存在成熟精子, 即Ⅱ期至Ⅳ期精巢除精原細(xì)胞的增殖外, 成熟精子也在同步生產(chǎn)。由此推測(cè), Ⅰ期精巢外部形態(tài)與內(nèi)部組織學(xué)變化保持較高同步性, 主要進(jìn)行原始生殖細(xì)胞的積累、雄性生殖系統(tǒng)功能及結(jié)構(gòu)的完善過(guò)程, 而Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期外部形態(tài)與內(nèi)部組織學(xué)變化不再完全同步, 精巢外部形態(tài)結(jié)構(gòu)與生殖細(xì)胞進(jìn)入一個(gè)具有一定關(guān)聯(lián)性, 但又相對(duì)獨(dú)立的發(fā)育階段。生殖細(xì)胞發(fā)育周期在精巢內(nèi)反復(fù)循環(huán), 同時(shí)精巢、輸精管仍不斷增粗、增長(zhǎng), 產(chǎn)生精子數(shù)量不斷增加, 是雄蝦生殖能力的強(qiáng)化過(guò)程。雄蝦精巢生殖功能完善后, 精子在精巢不斷產(chǎn)出, 后于輸精管內(nèi)積累達(dá)到一定數(shù)量, 待雌蝦卵子成熟后, 隨時(shí)可與雌蝦交配繁殖。本研究也發(fā)現(xiàn)雄蝦精子成熟過(guò)程較雌蝦卵子成熟過(guò)程所需時(shí)間更短。

此外, 雄蝦的精巢由大量生精小管組成, 在單個(gè)生精小管中, 往往精原細(xì)胞所在的生發(fā)區(qū)單獨(dú)集中于生精小管一側(cè)分布, 切片下觀察單個(gè)生精小管之間橫切面中的生發(fā)區(qū)并不存在集中分布的現(xiàn)象, 可能與精巢從蝦體剝離后進(jìn)行切片的人為因素導(dǎo)致。切片觀察同一雄蝦精巢, 各生精小管間存在明顯的發(fā)育階段的不同步性, 這與許多研究者得出的同一雄蝦不同生精小管內(nèi)生殖細(xì)胞發(fā)育不同步的結(jié)論一致(蔡生力, 1998; Felterman, 2011), 但總體以某一發(fā)育時(shí)期生精小管為主導(dǎo)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)性腺外部形態(tài)觀察結(jié)合常規(guī)石蠟切片觀察的方法, 總結(jié)了雌雄羅氏沼蝦初次性成熟卵巢的形態(tài)及組織學(xué)變化規(guī)律。結(jié)果表明: 羅氏沼蝦卵巢發(fā)育可分為8個(gè)時(shí)期, 卵巢在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累時(shí)期(Ⅵ～Ⅶ期)體積及內(nèi)部細(xì)胞種類(lèi)、體積變化明顯; 雄蝦精巢的發(fā)育可劃分為4個(gè)時(shí)期, 精巢體積隨個(gè)體生長(zhǎng)緩慢增大, 內(nèi)部細(xì)胞種類(lèi)、體積變化較小。生產(chǎn)上可嘗試通過(guò)卵巢顏色、體積等特征間接判斷其所處發(fā)育時(shí)期, 對(duì)卵巢快速發(fā)育時(shí)期親蝦進(jìn)行強(qiáng)化培育(投喂配合飼料同時(shí)搭配動(dòng)物性餌料等), 增大初次性成熟親蝦個(gè)體規(guī)格, 助力種蝦選育及蝦苗生產(chǎn)。

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HISTOLOGICAL OBSERVATION OF GONAD DEVELOPMENT DURING THE FIRST SEXUAL MATURITY OF

CHEN Guo-Zhu1, ZHONG Zhen-Xiao1, YANG Min-Min1, XING Qian-Qian1, XIA Zheng-Long2, TANG Qiong-Ying1, YI Shao-Kui1, CAI Miu-Ying2, YANG Jie2, YANG Guo-Liang1, 2

(1. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Aquatic Resources Conservation and Development; Key Laboratory of Aquatic Animal Genetic Breeding and Nutrition, Chinese Academy of Fishery Sciences; Huzhou University, Huzhou 313000, China; 2. Jiangsu Shufeng Prawn Breeding Co. Ltd., Gaoyou 225654, China)

Gonadal development is an important biological process during growth and reproduction of. To understand the changes in morphology and histology of gonads in early stage of sexual maturity of, the external morphology was observed and analyzed, and conventional paraffin section method was used. Results show that the color and volume of gonads, the composition and distribution of germ cells at different developmental stages displayed a certain regularity of development. The ovarian development could be divided into 8 stages and testis development into 4 stages. The external morphological development of the ovary was highly synchronized with the internal histological changes. As the maturity of the ovary increased, the germ cells in different stages formed a ring-shaped partition outward from the germinal zone. The ovarian volume, germ cell size, and gonadal index (GIS) increased slowly from Stages Ⅰ to Ⅲ, and mainly accumulated the number of germ cells. From Stages Ⅳ to Ⅶ, the ovarian volume, germ cell size, and GIS increase rapidly, and the germ cell proliferation was accompanied by rapid accumulation of nutrients. The developmental stages of germ cells in ovary could be inferred from the color, volume, and pigment pattern of ovary. However, for the testis, the morphology-histology synchrony in development was low. In Stage Ⅰ, testis was developed for improving the individual reproductive function mainly, and in stages Ⅱ, Ⅲ, and Ⅳ for increasing the reproductive capacity. This study enriches the knowledge of reproduction biology of, especially the development process ofgonads in morphological and histological aspects, and provides a reference for new varieties breeding and reproduction of.

; testis; ovary; cycle division; sexual maturity

Q954; S917; S966

10.11693/hyhz20211200350

*國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“藍(lán)色糧倉(cāng)科技創(chuàng)新”重點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng), 2018YFD0901300號(hào); 財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部: 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助, CARS-48號(hào); 江蘇省科技廳重點(diǎn)研發(fā)專(zhuān)項(xiàng)資金(現(xiàn)代農(nóng)業(yè))項(xiàng)目, BE2019352號(hào)。陳國(guó)柱, 碩士研究生, E-mail: 810999142@qq.com

楊國(guó)梁, 碩士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: ygl0572@163.com; 唐瓊英, 碩士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: tangqy@ zjhu.edu.cn

2021-12-29,

2022-02-19